外泌体miR-885-5p靶向Hmgb1调控急性胰腺炎细胞凋亡的实验研究

摘要

目的：探讨外泌体miR??885??5p靶向高迁移率族蛋白b1（Hmgb1）对急性胰腺炎细胞凋亡的作用及机制。方法：以未经处理的兔胰腺永生化腺泡细胞作为Control组，用浓度为1×10^-7 mol/L的雨蛙素联合10μg/mL的脂多糖处理兔胰腺腺泡永生化细胞24 h建立严重急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）体外模型，分离Control组和模型组细胞上清液的外泌体，用透射电镜观察外泌体形态，纳米颗粒追踪分析仪对外泌体进行粒径分析，Western blot检测外泌体蛋白标志物，RT??qPCR检测外泌体中miR??885??5p的表达。构建miR??885??5p过表达慢病毒及空病毒载体、miR??885??5p低表达慢病毒及空病毒载体分别转染模型细胞建立miR??885??5p mimics组及mimics NC组、miR??885??5p inhibitor组及inhibitor NC组，RT??qPCR检测各组细胞miR??885??5p、Hmgb1、Bax、Bcl??2、Caspase??3的mRNA表达量。Western blot检测各组细胞Hmgb1、Bax、Bcl??2和Caspase??3蛋白表达量。流式细胞术检测各组细胞凋亡率，Hoechst染色观察细胞凋亡情况。双荧光素酶报告试验验证miR??885??5p和Hmgb1的靶向关系。结果：Control组和严重AP组细胞外泌体直径约为50～200 nm，呈茶托状的外囊泡，双层膜结构。Western blot结果显示CD63、HSP70和TSG101有表达；严重AP组外泌体miR??885??5p的表达上调（P<0.01）。与Control组相比，严重AP组的miR??885??5p表达上调（P<0.01）,Hmgb1、Bax、Caspase??3的mRNA和蛋白表达上调（P<0.01）,Bcl??2的mRNA和蛋白表达下降（P<0.01），细胞凋亡率升高（P<0.01）。与mimics NC组相比，miR??885??5p mimics组的miR??885??5p表达上调（P<0.01）,Hmgb1、Caspase??3的mRNA和蛋白表达上调（P<0.01）,Bax的mRNA表达上调（P<0.01）以及蛋白表达上调（P<0.05）,Bcl??2的mRNA和蛋白表达下降（P<0.05），细胞凋亡率升高（P<0.01）。与inhibitor NC组相比，miR??885??5p inhibitor组的miR??885??5p表达下调（P<0.05）,Hmgb1、Bax的mRNA和蛋白表达下调（P<0.01）,Caspase??3的mRNA表达下调（P<0.05）以及蛋白表达下调（P<0.01）,Bcl??2的mRNA和蛋白表达升高（P<0.01），细胞凋亡率下降（P<0.01）。双荧光素酶基因检测报告试验显示Hmbg1为miR??885??5p的靶基因。结论：外泌体miR??885??5p在严重AP模型细胞中高表达，上调miR??885??5p的表达促进细胞凋亡，抑制miR??885??5p的表达可逆转这一结果，其机制可能与靶向Hmgb1促进Bax、Caspase??3表达及抑制Bcl??2表达有关。

关键词

外泌体 / miR??885??5p / 高迁移率族蛋白b1(Hmgb1) / 急性胰腺炎(CAP) / 凋亡