雪上一枝蒿总生物碱及其三种生物碱类单体对MH7A细胞毒性及抗炎活性研究

Cytotoxic and anti⁃inflammatory activities of Aconitum brachypodum Diels total alkaloids and its three alkaloid monomers on MH7A cells

摘要

目的 探究雪上一枝蒿（Aconitum brachypodum Diels）总生物碱及其三种生物碱类单体对MH7A细胞的毒性及其体外抗炎活性。 方法 选用MH7A细胞作为实验对象，采用CCK⁃8法测定雪上一枝蒿总生物碱及其三种生物碱类单体对MH7A细胞存活率的影响；细胞划痕法检测雪上一枝蒿总生物碱及其三种生物碱类单体对MH7A细胞迁移的影响；通过肿瘤坏死因子⁃α（TNF⁃α）刺激MH7A细胞建立体外类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）细胞模型，ELISA法测定细胞上清中炎症因子前列腺素E2（PGE⁃2）、白细胞介素⁃6（IL⁃6）、白细胞介素⁃1β（IL⁃1β）的表达情况。 结果 根据CCK⁃8法检测得各药物最大无细胞毒性药物浓度分别为：雪上一枝蒿甲素1 140 μg/mL、雪上一枝蒿乙素750 μg/mL、雪上一枝蒿总生物碱纯化物100 μg/mL、乌头碱50 μg/mL；各给药组对MH7A细胞迁移抑制作用强弱顺序为：乌头碱>雪上一枝蒿乙素>雪上一枝蒿总生物碱纯化物>雪上一枝蒿甲素；雪上一枝蒿总生物碱纯化物、雪上一枝蒿甲素、雪上一枝蒿乙素、乌头碱能抑制TNF⁃α诱导后的MH7A细胞PGE2、IL⁃6、IL⁃1β的生成量。 结论 雪上一枝蒿总生物碱纯化物、雪上一枝蒿甲素、雪上一枝蒿乙素、乌头碱均可呈浓度依赖性地抑制MH7A细胞分泌细胞因子PGE2、IL⁃6、IL⁃1β。

Abstract

Objective To investigate the toxicity and in vitro anti⁃inflammatory activity of Aconitum brachypodum Diels total alkaloids and its three alkaloid monomers of on MH7A cells. Methods MH7A cells were selected as experimental subjects， and the effects of total alkaloids of Aconitum brachypodum Diels alkaloids and its three alkaloid monomers on the cell viability of MH7A were determined by CCK⁃8 assay； The effect of total alkaloids of Aconitum brachypodum Diels alkaloids and its three alkaloid monomers on the migration of MH7A cells was examined by the cell⁃scratch method； An in vitro rheumatoid arthritis （RA） cell model was established by tumor necrosis factor （TNF⁃α） stimulation of MH7A cells， and the expression of the inflammatory factors prostaglandin E2 （PGE⁃2）， interleukin⁃6 （IL⁃6）， and interleukin⁃1β （IL⁃1β） in the supernatants of the cells was determined by ELISA. Results The maximum cytotoxicity⁃free drug concentrations of each drug according to the CCK⁃8 assay were 1 140 μg/mL for Bullatine A， 750 μg/mL for Bullatine B， 100 μg/mL for total alkaloids of Aconitum brachypodum Diels， and 50 μg/mL for Aconitine officinale； The order of the inhibitory effects on the migration of MH7A cells in each dosing group was as follows： Aconitine> Bullatine B> total alkaloids of Aconitum brachypodum Diels> Bullatine A； Total alkaloids of Aconitum brachypodum Diels， Bullatine A， Bullatine B， and Aconitine inhibited the amount of PGE2， IL⁃6， and IL⁃1β production in MH7A cells after TNF⁃α induction. Conclusion Total alkaloids of Aconitum brachypodum Diels， Bullatine A， Bullatine B， and Aconitine all inhibited the secretion of cytokines PGE2， IL⁃6， and IL⁃1β from MH7A cells in a concentration⁃dependent manner.

Graphical abstract

关键词

雪上一枝蒿 / 总生物碱 / 生物碱类单体 / MH7A细胞 / 抗炎活性

Key words

Aconitum brachypodum Diels / Total alkaloids / Alkaloid monomers / MH7A cells / Anti⁃inflammatory activity

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种影响关节的慢性炎症性自身免疫性疾病^［1⁃3］，具体以关节病变为主，主要表现为关节滑膜慢性炎症、血管翳形成，以及进行性、持续性的炎症破坏关节软骨、韧带及肌腱，导致关节畸形及功能丧失，常伴有其他脏器功能受损^［4］。据报道，RA的发病率0.5%~2%，且女性发病率是男性的2倍^［5，6］。目前，RA具体的病因及发病机制尚不明确，且目前尚无有效的根治性治疗方法。临床上用于治疗RA的主要是化学药物，如非甾体抗炎药、疾病修饰抗风湿药物、糖皮质激素和生物制剂等^［7，8］。中医药在治疗疾病时疗效明显且不良反应少，因此越来越受到关注。中医药能通过多成分、多途径发挥治疗疾病的作用，长期的临床应用已经证明中医药治疗风湿性关节炎的疗效和安全性^［9］。探讨中医药治疗RA的作用机制对于中药制剂及剂型的开发具有积极意义。

雪上一枝蒿来源于毛茛科乌头属植物短柄乌头（Aconitum brachypodum Diels）、铁棒锤（Aconitum pendulum Busch）及宣威乌头（Aconitum subrosullatum H⁃M.）的干燥块根，具有祛风除湿、散瘀疗伤及活血止痛等功效，被用于治疗风寒湿痹所致的筋骨和关节疼痛、跌打损伤所致的瘀血疼痛及虫蛇咬伤等症^{［10，11］}，主要含有雪上一枝蒿甲素、乙素、庚素、乌头碱、次乌头碱等生物碱类成分^{［12⁃14］}。本实验采用人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞株MH7A细胞，建立RA体外细胞模型^{［15，16］}，以实验室自制的雪上一枝蒿总生物碱纯化物以及雪上一枝蒿中存在的生物碱类单体成分：雪上一枝蒿甲素、雪上一枝蒿乙素、乌头碱为作用药物，采用CCK⁃8法筛选出无明显细胞毒性的各药物剂量范围，细胞划痕法测定各药物对MH7A细胞迁移的影响，肿瘤坏死因子⁃α（TNF⁃α）诱导MH7A细胞发生炎症，ELISA法检测炎症因子前列腺素E2（PGE⁃2）、白细胞介素⁃6（IL⁃6）和白细胞介素⁃1β（IL⁃1β）的含量，评价雪上一枝蒿生物碱纯化物及部分生物碱类单体成分的抗炎活性。以筛选出雪上一枝蒿治疗RA有效组分，为其治疗RA的后续研究提供一定的理论依据和实验支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

成人关节炎滑膜成纤维细胞MH7A（购于广州吉尼欧生物有限公司）。

1.1.2 药物、试剂与仪器

雪上一枝蒿生物碱（实验室自制，雪甲素含量≥10%，雪总碱≥78%）；雪上一枝蒿甲素对照品（中国药品生物制品检定所，110895⁃200404）；DMEM高糖培养基（美国GIBCO公司，8122258）；PBS（索莱宝，20201217）；胎牛血清（普诺赛）；青霉素⁃链霉素预混液（cellmax，20220405）；胰蛋白酶消化液（索莱宝，20220413）；CCK⁃8（奥怡生物科技有限公司）；甲氨蝶呤（MTX）（源叶）；PEG2试剂盒（深圳子科生物科技有限公司，202207）；IL⁃6试剂盒（深圳子科生物科技有限公司，202212）；IL⁃1β试剂盒（深圳子科生物科技有限公司，202212）；SW⁃CJ⁃1FD型超净工作台（苏州集团安泰空气技术有限公司）；MCO⁃15AC型CO2恒温培养箱（日本SANYO公司）；IX51型倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；H1650R型冷冻高速离心机（湖南湘仪）；FlexStation 3多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；移液枪（北京大龙）；微量移液器（美国ThermoFisher公司）。

1.2 方法

1.2.1 MH7A细胞的培养

将MH7A细胞接种于含12%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基中，置于5% CO₂、37 ℃，相对湿度90%恒温培养箱中培养。

1.2.2 药物不同浓度对MH7A细胞存活率的影响

细胞分组为：空白组（无药物）、雪上一枝蒿总生物碱纯化物组（药物浓度：10、50、100、150、200、250、500、750、1 000 μg/mL）、雪上一枝蒿甲素组（药物浓度：36.63、71.25、142.5、285.00、570.00、1 140 μg/mL）、雪上一枝蒿乙素组（药物浓度：50、100、200、250、500、750、1 000 μg/mL）、乌头碱组（药物浓度：10、20、50、100、250、500 μg/mL）、阳性药物甲氨蝶呤组（药物浓度：0.1、1、10、20 μg/mL）。

1.2.3 CCK⁃8法测定各处理组的细胞活性

将MH7A细胞以5×10³/孔在96孔板中孵育过夜，然后按“1.2.2”分组更换为含药培养基。继续培养24 h后更换为含10% CCK⁃8的基础培养基，并在37 ℃下继续培养2 h，于450 nm下测定吸光度OD值，并计算细胞存活率。

1.2.4 细胞划痕法检测不同药物对MH7A细胞迁移的影响

MH7A细胞以1×10⁵ 个/mL接种在24孔板上至细胞长满后，血清饥饿过夜。使用无菌200 μL移液管划痕，并清洗划痕处附着的细胞，给予不同药物（雪上一枝蒿甲素1 140 μg/mL、雪上一枝蒿乙素750 μg/mL、雪上一枝蒿总生物碱纯化物100 μg/mL、乌头碱50 μg/mL、甲氨蝶呤0.1 μg/mL），使用Axio Vert. A1倒置显微镜成像系统在40倍镜下拍照记录0、24 h时划痕处细胞迁移情况，并用ImageJ Pro对划痕处细胞迁移面积进行分析，计算迁移率。

1.2.5 TNF⁃α诱导MH7A细胞炎症模型浓度的筛选

细胞分组为：空白组；TNF⁃α组：在细胞培养液中加入TNF⁃α溶液，TNF⁃α浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5 μg/mL；空白组不加入TNF⁃α。

将MH7A细胞以5×10³/孔在96孔板中孵育过夜，然后按以上分组更换为含药培养基。继续培养24 h后收集细胞上清（4 ℃，1 500 r/min，离心20 min），按照试剂盒说明检测PGE2的含量。CCK⁃8法测定各处理组的细胞活性。

1.2.6 不同药物对TNF⁃α诱导的MH7A细胞中炎症因子PGE2、IL⁃6、IL⁃1β表达的影响

细胞分组为：空白组；TNF⁃α模型组；给药组：雪上一枝蒿总生物碱纯化物组（100、75、50 μg/mL）、雪上一枝蒿甲素组（1 140、570、285 μg/mL）、雪上一枝蒿乙素组（750、500、250 μg/mL）、乌头碱组（50、25、12.5 μg/mL）、阳性对照组：MTX（0.1 μg/mL）；除空白组外，其余各组均加入0.5 μg/mL的TNF⁃α刺激。

将MH7A细胞以5×10³/孔在96孔板中孵育过夜，然后按以上分组更换为含药培养基。继续培养24 h后收集细胞上清（4 ℃，1 500 r/min，离心20 min），按照ELISA试剂盒操作步骤检测PGE2、IL⁃8、IL⁃1β的含量。

1.3 统计学处理

应用SPSS17.00统计软件对数据进行分析，GraphPad8.0.2作图，计量数据以\overline{x}\pm s表示，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 药物不同浓度对MH7A细胞存活率的影响

与空白组比较，在设置浓度范围内，雪上一枝蒿甲素对细胞活性均无明显影响；在给药浓度雪上一枝蒿总生物碱纯化物为100 μg/mL，雪上一枝蒿乙素为750 μg/mL，乌头碱为50 μg/mL，MTX为0.1 μg/mL时，与空白组比较，药物对细胞均无明显的毒性；当雪上一枝蒿总生物碱纯化物给药浓度为150 μg/mL时，其细胞的存活率为94.17%（P<0.01），雪上一枝蒿乙素给药浓度为1 000 μg/mL，细胞的存活率为90.68%（P<0.01）；乌头碱给药浓度为100 μg/mL，细胞的存活率为91.75%（P<0.01）；阳性药物MTX给药浓度都为1 μg/mL，细胞的存活率为90.92%（P<0.01）。见图1。

后续实验各药物的高、中、低剂量分别为：雪上一枝蒿总生物碱纯化物浓度为100、75、50 μg/mL，雪上一枝蒿甲素浓度为1 140、570、285 μg/mL，雪上一枝蒿乙素为750、500、250 μg/mL，乌头碱浓度为50、25、12.5 μg/mL，MTX浓度为0.1 μg/mL。

2.2 细胞划痕法检测不同药物对 MH7A 细胞迁移的影响

与空白组比较，各给药组MH7A细胞迁移率均明显降低（P<0.01）。各给药组对MH7A细胞迁移抑制作用强弱顺序为：乌头碱>雪上一枝蒿乙素>雪上一枝蒿总生物碱纯化物>雪上一枝蒿甲素。见图2、3。

2.3 TNF⁃α诱导MH7A细胞炎症模型浓度的筛选

当TNF⁃α浓度大于3 μg/mL时，细胞存活率明显降低（P<0.01），见图4。当TNF⁃α浓度为0.5 μg/mL时，分泌的PGE2的量最多。综合考虑，选择TNF⁃α造模浓度为0.5 μg/mL，见图5。

2.4 不同药物对TNF⁃α诱导的MH7A细胞中炎症因子PGE2、IL⁃6、IL⁃1β表达的影响

2.4.1 不同药物组对TNF⁃α诱导MH7A细胞生成PGE2的影响

与空白组对比，模型组释放PGE2的含量明显上升（P<0.01），说明造模成功。与模型组比较，各给药组均对PGE2生成具有明显的抑制作用（P<0.01），且具有剂量依赖性，雪上一枝蒿乙素低剂量和乌头碱低、中剂量及雪上一枝蒿总生物碱纯化物低剂量组对PGE2抑制作用没有明显差异（P>0.05），高剂量组均具明显差异（P<0.01）。其作用强弱顺序为：雪上一枝蒿甲素>乌头碱>雪上一枝蒿总生物碱纯化物>雪上一枝蒿乙素。见图6。

2.4.2 不同药物组对TNF⁃α诱导MH7A细胞生成IL⁃6的影响

与空白组对比，模型组释放IL⁃6的含量明显上升（P<0.01），说明造模成功。与模型组比较，各给药组均对IL⁃6生成具有明显的抑制作用（P<0.01），且具有剂量依赖性，雪上一枝蒿乙素低剂量对IL⁃6抑制作用没有明显差异（P>0.05），各药物高剂量组均具明显差异（P<0.01）。其作用强弱顺序为：雪上一枝蒿总生物碱纯化物>乌头碱>雪上一枝蒿乙素>雪上一枝蒿甲素。见图7。

2.4.3 不同药物组对TNF⁃α诱导MH7A细胞生成IL⁃1β的影响

与空白组对比，模型组释放IL⁃1β的含量明显上升（P<0.01），说明造模成功。与模型组比较，各给药组均对IL⁃1β生成具有明显的抑制作用（P<0.01），且具有剂量依赖性，各药物高、中、低剂量组均具明显差异（P<0.01）。其作用强弱顺序为：雪上一枝蒿总生物碱纯化物>雪上一枝蒿乙素>乌头碱>雪上一枝蒿甲素。见图8。

3 讨论

RA成纤维细胞样滑膜细胞（RA⁃FLSs）是敏感关节中高度特化的间充质细胞，在RA的进展中起着重要作用^{［17，18］}。RA⁃FLSs异常活化增殖可入侵关节软骨，并通过产生促炎细胞因子、趋化因子和基质降解分子从而促进滑膜炎症和关节破坏^［19］。RA⁃FLSs能分泌多种致病介质，如TNF⁃α、IL⁃6等^［20］。IL⁃1β是促使RA免疫应答放大，并转为破坏反应的主要细胞因子，IL⁃6是一种与RA发展密切相关的炎症细胞因子，PGE2作为第三信使，是炎症反应的重要介质，炎症的发生、发展与局部PGE2的含量密切相关^［15］。有研究表明，通过降低IL⁃1β、IL⁃6的含量能抑制成纤维细胞样滑膜细胞炎症增生，从而抑制类风湿关节炎炎症增生^［21］。抑制RA⁃FLSs的增殖和迁移是治疗RA的一种方法^{［22，23］}。MH7A细胞属于类风湿性关节炎成纤维细胞中的一种成熟细胞系，是研究类风湿性关节炎公认的体外细胞模型^［24］。本研究表明，雪上一枝蒿生物碱类成分对MH7A细胞毒性最小的是雪上一枝蒿甲素，最大的是乌头碱；对MH7A细胞迁移抑制作用最强的是乌头碱，抑制作用最弱的是雪上一枝蒿甲素；本课题组前期对雪上一枝蒿总生物碱作用于大鼠关节炎机制进行研究，发现雪上一枝蒿总生物碱能明显抑制前PGE⁃2的合成^［25］，结合本实验结果表明，雪上一枝蒿甲素可能是雪上一枝蒿总生物碱中发挥治疗效果的重要部分。雪上一枝蒿总生物碱与各生物碱类单体成分对IL⁃1β、IL⁃6均有明显抑制作用，以雪上一枝蒿总生物碱纯化物最强，这可能与雪上一枝蒿总生物碱纯化物中多成分协同作用有关。综上所述，雪上一枝蒿甲素、雪上一枝蒿乙素、乌头碱可能是雪上一枝蒿中发挥治疗作用的部分。

作者贡献度说明：

陈磊：实验操作，数据整理，撰写论文初稿；邓铋莉、邓琴、范耕齐：实验操作、数据整理；谌文元：技术支持及部分实验指导；陈晓兰：承担课题的经费，文章整体设计，论文终稿审定。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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