肝豆灵通过调控LncRNA H19促进胆汁排铜改善Wilson病肝纤维化

Gandouling ameliorates hepatic fibrosis in Wilson disease by regulating LncRNA H19 to promote biliary copper excretion

摘要

目的 观察肝豆灵（Gandouling，GDL）对铜负荷Wilson病大鼠肝组织和血清外泌体长链非编码RNA H19 （long non‑coding RNA H19， LncRNA H19）及胆汁淤积的影响，探讨GDL改善Wilson病肝纤维化的作用机制。 方法 将60只SD雄性大鼠随机分为正常（Control）组、模型（Model）组、GDL低剂量（GDL‑L）组、GDL中剂量（GDL‑M）组、GDL高剂量（GDL‑H）组、青霉胺（penicillamine，PCA）组，每组10只。通过喂养五水合硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）构建铜负荷Wilson病肝纤维化模型，造模过程中同时给药。GDL各治疗组及PCA组灌胃相应剂量药物，Control组和Model组灌胃等体积蒸馏水，连续30 d。H&E和Masson染色观察肝脏病理学改变；ELISA检测胆汁淤积指标γ‑谷氨酰转移酶（γ‑glutamyl transferase，GGT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）、总胆汁酸（total bile acids，TBA）和肝功能指标丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平；原子吸收分光光度计测定胆汁铜含量；RT‑qPCR检测LncRNA H19、胆管反应指标细胞角蛋白 7（cytokeratin7，CK7）和细胞角蛋白19（cytokeratin19，CK19）基因表达；Western blot观察CK7、CK19蛋白表达。 结果 与Control组相比，Model组肝组织病理形态显示细胞核边界不清伴有裂解、坏死，肝组织中央静脉及胆管周围出现明显的胶原沉积；ALT、AST、GGT、ALP、TBIL、TBA、胆汁铜水平明显升高（P<0.01）；LncRNA H19、CK7、CK19基因表达水平明显升高（P<0.01）；CK7、CK19蛋白水平明显升高（P<0.01）。经GDL和PCA干预后，肝组织纤维化程度明显改善；ALT、AST、GGT、ALP、TBIL、TBA、胆汁铜含量降低（GDL‑L组ALT、TBIL、TBA除外）（P<0.01）；LncRNA H19、CK7、CK19基因表达水平降低（P<0.01）；CK7、CK19蛋白水平降低（GDL‑L组CK7除外）（P<0.05）。 结论 GDL可能通过调控LncRNA H19的表达，促进胆汁排铜，改善铜负荷Wilson病大鼠肝纤维化。

Abstract

Objective To observe the effects of Gandouling （GDL） on hepatic and serum exosomal long non‑coding RNA H19 （LncRNA H19） as well as cholestasis in hepatic tissues of copper‑loaded rats with Wilson disease， and to explore the mechanism of action of GDL ameliorating hepatic fibrosis in Wilson disease. Methods A total of 60 SD male rats were randomly divided into the normal group （Control）， the model group （Model）， the GDL low‑dose group （GDL‑L）， the GDL medium‑dose group （GDL‑M）， the GDL high‑dose group （GDL‑H）， and the penicillamine group （PCA）， with 10 rats in each group. A copper‑loaded Wilson disease liver fibrosis model was constructed by feeding copper（Ⅱ） sulfate pentahydrate（CuSO₄·5H₂O）， and the drug was administered simultaneously during the modeling process. Each treatment group of GDL and the PCA group were administered the corresponding doses of the drugs by gavage， while the Control group and the Model group were administered an equal volume of distilled water by gavage for 30 consecutive days. H&E and Masson staining were used to observe the pathological changes in the liver. ELISA was utilized to measure cholestasis indicators， including γ‑glutamyl transferase （GGT）， alkaline phosphatase （ALP）， total bilirubin （TBIL）， and total bile acids （TBA）， as well as liver function markers alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST）. Atomic absorption spectrophotometer was used to determine the copper content of bile. RT‑qPCR was used to detect the gene expressions of LncRNA H19， cytokeratin 7 （CK7）， an indicator of bile duct response， and cytokeratin 19 （CK19）； Western blot was used to observe the protein expressions of CK7 and CK19. Results Compared to the Control group， the histopathologic pattern of liver tissue in the Model group showed unclear cell nucleus boundaries with lysis and necrosis， and obvious collagen deposition around the central vein and bile ducts of the liver tissue； the levels of ALT， AST， GGT， ALP， TBIL， TBA， and biliary copper were elevated significantly（P<0.01）. LncRNA H19， CK7， and CK19 gene expression levels increased significantly （P<0.01）. CK7 and CK19 protein levels increased significantly （P<0.01）.The degree of hepatic tissue fibrosis was significantly improved after the intervention of GDL and PCA. ALT， AST， GGT， ALP， TBL， TBA， and biliary copper levels were decreased （except for ALT、TBIL and TBA in the GDL‑L group）（P<0.01）， LncRNA H19， CK7， and CK19 gene expression levels were decreased （P<0.01）， and CK7 and CK19 protein levels were decreased （except for CK7 in the GDL‑L group）（P<0.05）. Conclusion GDL may promote biliary copper excretion and ameliorate hepatic fibrosis in copper‑loaded rats with Wilson disease by regulating the expression of LncRNA H19.

Graphical abstract

关键词

肝豆灵 / 胆汁淤积 / 肝纤维化 / LncRNA H19 / Wilson病

Key words

Gandouling / Cholestasis / Liver fibrosis / LncRNA H19 / Wilson disease

Wilson病（Wilson disease，WD），是铜转运蛋白编码基因ATP7B突变引起的慢性铜代谢障碍性疾病，其特征是由胆汁铜排泄障碍引起的体内铜病理性沉积^［1］。目前普遍认为，胆汁排铜障碍是WD的基本缺陷^［2‑4］。肝内胆汁淤积是由肝实质细胞和/或肝内胆管疾病引起的^［5］，长期的胆汁淤积会诱发胆管反应，刺激胆管上皮细胞（biliary epithelial cells，BECs）增殖，引起肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）进一步增殖与活化，导致肝纤维化的发生^［6］。肝脏和血清外泌体长链非编码RNA H19 （long non‑coding RNA H19， LncRNA H19）近期被观察到在胆汁淤积性肝损伤、原发性胆汁性胆管炎、肝癌、肝纤维化和肝硬化等慢性肝胆病患者中表达增加^［7］，LncRNA H19过表达会加剧胆汁淤积造成的肝损伤^［8］。

中医学认为，胆汁的分泌与排泄，主要责之于肝，肝之功能正常，气机调畅，疏泄有度，胆道无郁阻之患，则胆汁排泄正常。肝豆灵（Gandouling，GDL）具有利胆通腑化瘀之功效，为我院治疗WD的特色院内制剂。本研究通过建立铜负荷WD大鼠模型模拟肝纤维化，观察GDL对肝组织LncRNA H19、肝功能、胆汁淤积及胆管反应相关指标的影响，探讨GDL是否具有调控LncRNA H19促进胆汁排铜改善WD肝纤维化的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物

SPF级60只雄性SD大鼠，体重180~200 g，购于杭州子源实验动物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（浙）2019‑0004，合格证编号：20231016Aazz0105000912。于安徽中医药大学药学院动物中心饲养，室温24~26 ℃，湿度50%~60%，光线明暗交替，自由饮食饮水。该实验已获得安徽中医药大学实验动物伦理委员会审批（AHUCM‑rats‑2023190）。

1.1.2 药物

GDL（主要成分：黄连、丹参、鸡血藤、大黄、莪术、姜黄），每片0.3 g，批号：Z20050071。青霉胺（penicillamine，PCA），每片0.125 g，批号：H31022286。GDL和PCA购于安徽中医药大学第一附属医院。

1.1.3 主要试剂与仪器

五水合硫酸铜（CuSO₄·5H₂O，安徽欣乐生物技术有限公司，批号：20201105）；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、γ‑谷氨酰转移酶（γ‑glutamyl transferase，GGT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）、总胆汁酸（total bile acids，TBA）、铜离子检测试剂盒（南京建成生物工程研究院，批号：20240125、20240129、20240114、20240107、20240109、20240125、20240110）；Novo start SYBR qPCR Super Mix Plus（荧光染料）（novoprotein，批号：05285501）；Prime Script™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（反转录试剂盒）（TaKaRa，批号：AM62082A）；ECL超敏发光试剂盒（Thermo，批号：VC298015）；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、GAPDH（Zsbio，批号：140193、202700514、230040220）；细胞角蛋白7（cytokeratin7，CK7）、细胞角蛋白19（cytokeratin19，CK19）（bioss，批号：AH19201182、AG19051146）。

荧光定量PCR仪（Thermo Scientific，型号：PIKOREAL96）；自动曝光仪（上海培清科技有限公司，型号：JS‑1070P）；数字切片扫描仪（匈牙利3DHISTECH，型号：Pannoramic MIDI）。

1.1.4 动物模型的构建及分组给药实验

将60只大鼠随机分为正常（Control）组、模型（Model）组、肝豆灵低剂量（GDL‑L）组、肝豆灵中剂量（GDL‑M）组、肝豆灵高剂量（GDL‑H）组、青霉胺（PCA）组，每组10只。依据文献［9］方法造模，先适应性喂养1周，Control组喂养普通饲料和蒸馏水，其余5组以300 mg/kg CuSO₄·5H₂O溶液灌胃，造模过程中同时灌胃给药。先将GDL和PCA研磨成粉末，以便与蒸馏水充分融合。予以GDL‑L组（0.24 g/kg），GDL‑M组（0.48 g/kg）、GDL‑H组（0.96 g/kg）及PCA组（90 mg/kg）灌胃，Control组和Model组予以等体积的生理盐水，连续30 d。末次灌胃给药后禁食12 h，每只大鼠称重后，于大鼠右下腹注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉。剖开腹腔后，腹主动脉取血，以3 500 r/min离心10 min（离心半径为8.4 cm，下同），取上清，放置EP管中，冰箱-20 ℃保存。找到胆总管，放置引流管收集大鼠胆汁，待胆汁缓慢流出放在EP管中液氮保存。剪取部分组织放入装有10%多聚甲醛的离心管中，常温保存，剩余肝脏组织放入液氮保存。

1.2 实验方法

1.2.1 一般情况

每天观察大鼠的毛发、性情及行为情况，记录体重与摄食量。

1.2.2 血清学指标检测

酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测ALT、AST活性和GGT、ALP、TBIL、TBA水平，操作严格遵循试剂盒说明。

1.2.3 肝组织病理学观察各组大鼠肝组织

用10%多聚甲醛溶液固定后，经脱水机脱水、石蜡包埋、切片、苏木素‑伊红（hematoxylin⁃eosin，H&E）和马松（Masson）染色、切片，最后用数字切片扫描仪扫描，观察肝组织病理形态改变。

1.2.4 原子吸收分光光度计测定胆汁铜含量

严格按照试剂盒说明书步骤检测铜离子含量。

1.2.5 实时荧光定量PCR（real‑time fluorescence quantitative PCR，RT‑qPCR）检测肝组织LncRNA H19、CK7、CK19基因的表达

称取肝组织50 mg，研磨充分后加入1 mL TRIzol裂解，1 2000 r/min离心15 min，去上清液，加入1 mL 75% 乙醇，离心（1 2000 r/min，15 min）2次，提取其总RNA。根据反转录试剂盒的操作说明反转录为cDNA，以cDNA作为荧光定量的模板进行扩增。反应条件为95 ℃、1 min预变性，60 ℃、1 min延伸退火，扩增40个循环。以β‑actin为内参，用2^-ΔΔCT法计算结果代表目的基因表达量，实验涉及引物序列见表1。

1.2.6 Western blot检测肝组织CK7、CK19蛋白的表达

取0.1 g肝组织样本，加入RIPA细胞裂解液600 µL进行裂解。12 000×g离心15 min。收集上清液，即为总蛋白。根据TaKaRa产品目录进行凝胶配置，在蛋白样品中按照1∶4加入5×SDS‑PAGE蛋白上样缓冲液。待到室温后，上样、电泳、恒流转膜。加入封闭液（5%脱脂奶粉）封闭2 h，按照1∶2 000比例加入一抗CK7、CK19、GAPDH孵育，3次PBST洗涤后，按照1∶20 000比例孵育二抗，再经3次PBST洗涤，每次10 min。实验重复3次。使用ECL发光试剂盒检测蛋白，ImageJ软件进行条带的分析。

1.3 统计学处理

数据应用Graphpad Prism 9.0进行统计学分析，计量资料采用\overline{x}\pm s表示。多组间比较采用单因素方差分析，Bonferroni法进行两两比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 动物一般情况

与Control组比较，Model组大鼠性情易暴躁，毛发较粗糙，颜色偏暗黄，体形消瘦，体重减轻。GDL和PCA给药后，大鼠性情变温和，毛发暗黄情况好转，体重逐渐恢复。

2.2 H&E、Masson染色观察肝组织病理形态改变

与Control组相比，Model组大鼠中央静脉及胆管周围出现明显的肝组织炎性细胞浸润和胶原沉积；GDL各治疗组和PCA组大鼠的肝组织炎性细胞浸润和胶原沉积现象得到明显改善，见图1。

2.3 各组大鼠胆汁淤积（GGT、ALP、TBIL、TBA）和肝功能（AST、ALT）指标比较

与Control组相比，Model组大鼠血清GGT、ALP、TBIL、TBA水平明显升高（P<0.01）；与Model组相比，GDL‑L组血清GGT、ALP、TBIL、TBA呈下降趋势，GDL‑M组和GDL‑H组血清GGT、ALP、TBIL、TBA水平明显降低（P<0.01），GDL‑H与PCA疗效相当，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

与Control组大鼠相比，Model组大鼠血清ALT、AST水平明显升高（P<0.01）；与Model组比较，GDL‑M组、GDL‑H组和PCA组ALT、AST水平明显降低（P<0.01），见表2。

2.4 各组大鼠胆汁铜含量比较

与Control组比较，Model组大鼠胆汁铜含量明显升高（P<0.01），与Model组比较，经GDL和PCA治疗后，大鼠胆汁铜含量明显降低（P<0.01），见图2。

2.5 各组大鼠肝组织中LncRNA H19、CK7、CK19基因表达水平比较

RT‑qPCR结果显示，与Control组比较，Model组肝组织中LncRNA H19、CK7、CK19基因表达水平均明显上调（P<0.01），经过GDL干预后，GDL各治疗组的LncRNA H19、CK7、CK19基因表达水平均明显下降（P<0.01），见图3。

2.6 各组大鼠肝组织中CK7、CK19蛋白表达水平比较

Western blot结果显示，与Control组相比，Model鼠肝组织CK7、CK19蛋白水平上调（P<0.01）。与Model组相比，GDL‑M组和GDL‑H组的CK7和CK19蛋白表达水平下调（P<0.01），见图4。

3 讨论

WD是因铜转运蛋白编码基因ATP7B基因突变出现铜蓝蛋白合成障碍，铜从胆汁排出减少，引起铜过度沉积于肝脏、肾脏、及脑部基底节区而发病^［10］。在ATP7B缺失或功能失调的WD患者中，胆汁铜排泄减少，铜在胆道中积聚，随着铜聚集量增加，超出机体的安全存储容量，造成胆道系统损伤、胆汁排泄障碍而出现胆汁淤积。

我院创制的利胆通腑化瘀方GDL由大黄、黄连、姜黄、丹参、莪术、鸡血藤组成，方中姜黄专入肝胆经，可疏肝利胆以排毒；大黄、黄连清解泻下、利胆通腑以降浊；三药合用疏肝利胆、通腑泻浊以排铜；丹参、莪术、鸡血藤活血散瘀、流畅经络以利铜浊毒邪排出。诸药合用，共奏利胆通腑化瘀之效，使铜浊毒邪随胆汁、二便排出。现代药理研究发现：姜黄中主要成分姜黄素有利胆之功效，能增加胆汁的生成和分泌，并能促进胆囊收缩，可降低血清中ALT、AST的水平，减少BECs增殖并减轻胆管结扎大鼠的胆汁淤积程度^［11］。大黄可促进胆囊中的胆汁排泄，一直被用于治疗肝内胆汁淤积并取得了良好的临床疗效^［12］。黄连能通过调控肝细胞的摄入和胆汁酸的转运，促进肝细胞向毛细胆管排泌胆汁，改善胆汁酸肝肠循环，从而降低胆汁淤积程度^［13］。丹参对胆汁淤积性肝损伤小鼠也具有良好的保护作用^［14］。鸡血藤可抑制肝内胆汁酸的合成和重吸收，改善肝内胆汁淤积^［15］。本实验发现WD大鼠中胆汁铜含量明显升高，GDL治疗后可明显降低胆汁铜含量，促进铜从胆汁中排泄，减少铜在肝脏中的过度积蓄，减轻胆汁淤积造成的肝损伤。

LncRNA H19作为最早被发现的LncRNAs之一，也是人类和小鼠之间保存的为数不多的LncRNA之一，在调节细胞增殖和分化方面发挥关键作用，其异常表达可能导致不同器官的疾病^［16］。有研究表明，LncRNA H19主要在胆管细胞中表达，在胆汁酸稳态和胆汁淤积性疾病中具有重要作用，而LncRNA H19的异常表达与不同胆汁淤积小鼠模型的胆汁酸紊乱和肝脏炎症有关^［8，17］，其过度表达会导致胆汁酸稳态被破坏，加剧胆汁淤积造成的肝纤维化^［18］。本实验表明，在WD大鼠肝组织中LncRNA H19的表达水平上调，而GDL可降低LncRNA H19的表达。

胆管细胞是胆汁淤积性肝病发病机制的主要靶标，胆道梗阻和胆汁形成异常导致胆汁酸蓄积，造成进行性胆管破坏和肝脏炎症，并进一步导致纤维化^{［19，20］}。有研究表明，肝脏炎症是通过募集炎症细胞和激活HSC来驱动肝纤维化^［21］。H&E和Masson染色结果显示GDL治疗后肝组织炎性细胞浸润和胶原沉积现象明显好转，提示GDL可改善WD大鼠肝纤维化。胆汁酸稳态失衡，胆汁合成或调节失调会导致胆汁淤积，诱发“胆管反应”，出现以ALP、TBIL和TBA水平升高为主的血生化指标异常，并伴有BECs的异常增殖^［22］。CK7和CK19是BECs的标志物，被用于识别BECs^［23］。本研究中WD大鼠GGT、ALP、TBIL、TBA、ALT、AST指标水平明显升高，GDL治疗后明显下降，且呈现出剂量效应关系，提示GDL可改善WD大鼠的胆汁淤积和肝功能。本实验通过Western blot和RT‑qPCR检测发现铜负荷WD大鼠发生了BECs异常增殖，而GDL可降低CK7、CK19 mRNA和蛋白的表达，缓解胆管反应。

综上所述，GDL可能通过下调LncRNA H19的表达，抑制胆汁酸的合成，促进胆汁铜的排泄，减轻肝内胆汁淤积，缓解WD肝纤维化，为后续深入探究GDL治疗WD的作用靶点提供新思路。本研究从GDL促进胆汁排铜角度探讨WD肝纤维化治疗，明确了GDL具有调控LncRNA H19促进胆汁排铜改善WD肝纤维化的作用。然而本研究仍存在一定的局限性，后续将完善体外细胞实验，进一步探讨GDL改善WD铜负荷大鼠胆汁淤积的调控机制，为其临床治疗提供依据。

作者贡献度说明：

杨文明：实验思路构思；汪瀚：实验方案设计与手稿撰写；殷馨、花代平、孙兰婷：实验实施；宣巧玉、纪美艳：数据整理与分析。所有作者都批准了最后的手稿。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金区域创新发展联合基金项目(U22A20366)

安徽省自然科学基金项目(2208085MH266)

安徽省卫生健康科研项目(AHWJ2022b036)