花生衣通过调节MAPK/PI3K/AKT信号通路缓解庆大霉素诱导的急性肾损伤

Peanut skin alleviates gentamicin‑induced acute kidney injury in rats via regulation of MAPK/PI3K/AKT signalling pathways

摘要

目的 探讨花生衣提取物改善急性肾损伤的作用及机制。 方法 基于UPLC‑Q TOF‑MS技术对花生衣提取物及其入血成分进行分析，通过数据库对花生衣提取物入血成分和急性肾损伤（AKI）疾病进行靶点预测，取交集靶点构建“药物‑活性成分‑靶点‑疾病通路”网络，通过GO、KEGG功能富集分析并筛选相关性较高的核心活性成分。通过腹腔注射庆大霉素构建急性肾损伤模型，采用病理组织切片检测肾脏炎症细胞浸润程度，微板法检测肾功能指标、炎症因子含量和肾组织氧化指标；Western blot检测MAPK/PI3K/AKT信号通路的关键蛋白表达水平。 结果 基于UPLC‑Q TOF‑MS技术从花生衣提取物中鉴定出45种化学成分和14种入血成分，构建网络获得131个交集靶点，GO和KEGG富集分析主要涉及MAPK信号通路、PI3K信号通路、AKT信号通路。其中核心成分为Arachidonic Acid、Linoleic Acid、Esculetin、7‑Hexadecenoic acid、Daidzein。花生衣提取物可以明显降低AKI大鼠血清中BUN、CRE的含量，降低尿液中UP、LZM酶和NAG含量。减轻TNF‑α、IL‑1β、IL‑6的炎症因子浸润，降低NO、NOS、MDA的水平，提高GSH、SOD、UA的水平。Western blot验证表明，花生衣提取物通过下调MAPK/PI3K/AKT通路相关蛋白磷酸化水平，有效抑制肾小管上皮细胞凋亡。 结论 花生衣提取物通过MAPK/PI3K/AKT信号通路缓解庆大霉素诱导的急性肾损伤，为花生衣缓解急性肾损伤的活性成分及药理机制提供了理论支撑。

Abstract

Objective To explore the effect and mechanism of peanut skin extract in improving acute kidney injury. Methods Based on UPLC‑Q TOF‑MS technology， peanut skin extract and its blood components were analyzed. Target prediction was performed on the blood components of peanut skin extract and acute kidney injury disease through a database. The intersection targets were selected to construct a "drug‑active ingredient‑target‑disease pathway" network. GO and KEGG functional enrichment analysis were used to analyze the network pathways and screen for core active ingredients with high correlation. An acute kidney injury model was established by intraperitoneal injection of gentamicin. Pathological tissue sections were used to detect the degree of renal inflammatory cell infiltration. Microplate method was used to detect renal function indicators， inflammatory factor content， and renal tissue oxidation indicators. Western blot was used to detect the expression levels of key proteins in the MAPK/PI3K/AKT signaling pathway. Results Based on UPLC‑Q TOF‑MS technology， 45 chemical components and 14 blood entering components were identified from peanut skin extracts. A network was constructed to obtain 131 intersecting targets. GO and KEGG enrichment analysis mainly involved the MAPK signaling pathway， PI3K signaling pathway， and AKT signaling pathway. The core components are Arachidonic Acid Linoleic Acid， Esculetin， 7‑Hexadecenoic acid， and Daidzein. Peanut skin extract can significantly reduce the levels of BUN and CRE in rat serum induced by gentamicin， as well as decrease the levels of UP， LZM enzymes， and NAG in urine. Reduce the infiltration of inflammatory factors such as TNF‑α， IL‑1β， and IL‑6， lower the levels of NO， NOS， and MDA， and increase the levels of GSH， SOD， and UA. Western blot validation showed that peanut skin extract effectively inhibited apoptosis of renal tubular epithelial cells by downregulating the phosphorylation levels of key proteins in the MAPK/PI3K/Akt pathway. Conclusion Peanut skin extract alleviates acute kidney injury induced by gentamicin through the MAPK/PI3K/AKT signaling pathway， providing theoretical support for the active ingredients and pharmacological mechanisms of peanut skin in alleviating acute kidney injury.

Graphical abstract

关键词

花生衣 / UPLC‑Q TOF‑MS / 急性肾损伤 / MAPK/PI3K/AKT信号通路

Key words

Peanut skin / UPLC‑Q TOF‑MS / Acute kidney injury / MAPK/PI3K/AKT signaling pathway

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是一种常见的临床综合征，其特征是肾组织结构和功能改变、氮代谢副产物水平升高和尿量减少^［1］。此外，急性肾损伤与心血管疾病、进展性慢性肾病有关^［2］。庆大霉素（gentamicin，GM）被归类为氨基糖苷类抗生素，肾毒性被认为是与这类抗生素相关的最常见的不良反应^［3］。研究表明，急性肾损伤与细胞内炎症、氧化和抗氧化水平失衡和肾组织内药物积聚密切相关^［4‑6］。目前已经开发了许多源自天然产物的高效低毒性药物来减轻AKI的影响。例如，人参、姜黄素和石榴具有抗氧化和抗炎特性^［7‑9］，可能通过增强抗氧化酶的活性来提供抗氧化应激保护^［10］。这些天然产物的潜在抗氧化和抗炎作用表明，它们作为膳食补充剂可以缓解与急性肾损伤相关的肾毒性作用。因此，本研究强调了对具有药用和营养价值的天然产物的探索。

花生衣（peanut skin， PS）是豆科植物花生（Arachis hypogaea L）外表面的红棕色种皮，富含多酚化合物、脂肪酸化合物、萜类化合物、膳食纤维、蛋白质等多种活性成分^{［11，12］}。花生衣提取物具有很强的抗氧化活性^［13］，可以延缓食物的氧化和变质，保护食物中的脂质、蛋白质和其他成分免受氧化损伤。膳食纤维可以增加食物的纤维含量，促进消化健康，改善食物的质地和味道。色素成分为食物提供天然的红色或棕色色调。当代药理学研究表明，花生衣具有一系列药理作用，包括清除自由基、抗氧化特性和抗癌作用^{［14，15］}。研究发现，花生衣中原花青素对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和光自由基具有很强的清除能力^［16］。花生衣提取物可以减轻对乙酰氨基酚诱导的肾脏损伤^［17］，对高脂肪和高果糖导致的饮食性肾损伤具有保护作用^［18］。因此，花生衣是一种具有营养和药用价值的天然产品，具有在肾损伤方面药用的潜力。

本研究结合网络药理学和体内实验验证的方法，探究了花生衣在急性肾损伤方面的生物学靶点和机制，建立了庆大霉素诱导的AKI模型，证明花生衣可以通过调节磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路有效缓解肾脏炎症，减少肾脏组织的氧化应激。本研究结果初步阐明了花生衣治疗庆大霉素诱导的急性肾损伤的作用机制，突出了花生衣未来临床应用的药用价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物

72只SPF级雄性Sprague‑Dawley大鼠体质量（200±20） g，购买于河南斯克贝斯生物科技有限公司［许可证号SCXK（豫）2020‑0005］。大鼠饲养在石河子大学药学院实验动物中心，室温（22±2） ℃，湿度（50±5）%，自由饮水摄食。此外，本研究已获得石河子大学生物伦理委员会的正式批准，伦理批准编号为A2025‑058。

1.2 药品与试剂

本实验所需药材花生衣（冀20211125）购买于河北保定药材市场，石河子大学朱芸教授鉴定其为豆科植物花生（Arachis hy Pogaea L.）的种皮。

乙醇（500 mL，250203）购买于津市鑫铂特化工有限公司；乙腈（4 L，22H0262010）购买于美国J.T. Baker公司；甲酸（1 kg，CAS64‑18‑6）购买于韩国杜山纯化学公司；硫酸庆大霉素注射液（8万单位，国药准字H37021973）购买于江苏豪森制药集团有限公司；肌酐（sarcosine oxidase，CRE，C011‑2‑1）、尿素氮（urea assay kit，BUN，C013‑2‑1）、尿酸（uric acid，UA，C012‑2‑1）、尿蛋白（urine protein，UP，C035‑2‑1）、溶菌酶（lysozyme assay，LZM，A050‑1‑1）、β‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶（β‑N‑acetyl‑glucosaminidase，NAG，A031‑1‑1）、丙二醛（malondialdehyde，MDA，A003‑1‑2）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，A001‑1‑2）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH‑PX，A006‑2‑1）、一氧化氮（nitric oxide，NO，A012‑1‑2）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS，A014‑2‑2）、白细胞介素‑6 （Interleukin ‑6，IL‑6，H007‑1‑2）、白细胞介素‑1β（Interleukin ‑1β，IL‑1β，H002‑1‑2）、肿瘤坏死因子‑α（tumor necrosis factor‑α，TNF‑α，H052‑1‑2）试剂盒购买于中国南京建成有限公司；小鼠抗GAPDH抗体（TA‑08）、山羊抗兔IgG/辣根酶标记抗体（ZB‑2301）和山羊抗小鼠IgG/辣根酶标记抗体（ZB‑2305）购买于北京中杉金桥生物技术有限公司；p‑ERK1/2抗体（AF1015）、ERK1/2抗体（AF0155）、p‑JNK1/2/3抗体（AF3318）、JNK1/2/3‑抗体（AF6318）、p‑PI3K抗体（AF3241）、PI3K抗体（AF6241）、p‑AKT抗体（AFP0832）、AKT抗体（AF0836）购买于Affinity。

1.3 仪器

超高效液相色谱质谱联用仪（UPLC‑Q‑TOF‑MS，美国Waters公司）、ACQUITY UPLC^® BEH C₁₈ 色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）色谱柱、离心机（Thermo Fisher Scientific Inc）、纯水仪（美国Millipore公司）、电泳仪（Bio‑Rad Laboratories， Inc.）、球磨仪（GT200上海净信实业发展有限公司）、正置高分辨荧光显微镜（AXiOImaGer.m2 北京博瑞斯科技有限公司）、化学发光检测成像系统（UVP EC3510 美国UVP公司）、石蜡包埋机（DB‑09 湖北德力森科技有限公司）、酶联免疫吸附测定仪（Thermo Fisher Scientific Inc）。

1.4 药物制备

称取2.5 kg花生衣药材，置浸泡桶中，用10倍量70%乙醇浸泡1 h，置渗漉桶中，以20倍量70%乙醇渗漉，减压回收渗漉液，得花生衣提取物，收率为11%。

1.5 分析样本制备

1.5.1 花生衣提取物化学成分样本制备

取花生衣提取物20 mg，用1 mL的色谱甲醇溶解，超声溶解，涡旋混匀，取溶液稀释200倍，混匀，过0.22 μm滤膜备用。

1.5.2 花生衣入血成分样本制备

大鼠禁食不禁水12 h，灌胃花生衣提取物（折合生药量72 g/kg），于给药前和给药后1 h，经眼眶静脉丛采血于2 mL采血管中，于4 ℃下3 500 r/min离心10 min，取上清液冻存于-80 ℃下备用。

1.6 生物样本的处理

4 ℃下，取100 μL血浆于2 mL离心管中，加入300 μL甲醇，涡旋混匀30 s，在4 ℃下10 000 r/min离心5 min，取上清液用于测定。

取96孔板式HLB柱，预先用500 μL甲醇活化，500 μL水平衡，取上清液样本100 μL上样，收集流出液Y0，500 μL水洗脱2次，弃去洗脱液，再用500 μL甲醇洗脱1次，收集洗脱液Y1，合并Y0和一次洗脱液为Y1，待测。

1.7 色谱与质谱条件

1.7.1 色谱条件

乙腈‑0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱条件见下表，流速：0.4 mL/min；柱温：25 ℃，样品池温度：4 ℃；进样量：2 μL。

1.7.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源（ESI），采用正、负离子2种模式，采集模式为MSE，离子源温度110 ℃；脱溶剂气体为氮气，流速为650 L/h，温度450 ℃。正离子模式下毛细管电压3 kV，负离子模式下毛细管电压2.5 kV，锥孔电压50 V，分子量扫描范围50~1 500 Da。正负离子扫描时能量均为20~50 eV。准确质量数用leucineenk ephalin（LE）液校正，浓度为200 pg/mL；正离子模式下m/z为556.277 1，负离子模式下为554.261 5，采集模式为采集不校正。UPLC‑Q‑TOF‑MS系统的操作软件为MassLynx 4.1。

1.8 数据处理

采用MassLynx V4.1软件对MS数据进行采集，所得数据导入至自建库进行峰识别与峰指认。

1.9 构建“药物‑活性成分‑靶点‑疾病通路”网络

1.9.1 PS的入血成分及靶点预测

将花生衣提取物入血成分的2D结构图输入Swiss Target Prediction平台、Pubchem数据库进行靶点预测，将结果去重即得到花生衣提取物入血成分的预测靶点。

1.9.2 急性肾损伤疾病靶点的获取

在OMIM数据库、PharmGKB数据库、Gene Cards数据库、DisGeNET数据库中输入关键词“Acute kidney injury”进行急性肾损伤靶点的搜集，将从数据库中获得的疾病靶点进行汇总，删除重复值，得到网络药理学所需的急性肾损伤疾病的相关靶点。

1.9.3 AKI与PS共同靶点的获取

把急性肾损伤相关疾病靶点与PS入血成分的作用靶点传送至Venny 2.1.0平台，得到入血成分与急性肾损伤的交集靶点。

1.9.4 建立入血成分‑疾病靶点网络

利用Excel建立入血成分与急性肾损伤的相关映射，并将映射关系、名称等信息进行规范，再利用Cytoscape 3.9.0平台建立成分‑靶点网络关系。利用平台自带模块Network Analyzer运算出该网络相关拓扑参数，以自由度、平均最短路径长度、介数、R值评价相应节点在网络图中的相关性。

1.9.5 基因富集及通路分析

将获取的入血成分和急性肾损伤共同靶点导入DAVID平台，选择人类物种，再分别单独勾选富集分析模块中KEGG Pathway和GO Biological Processes功能选项，分别进行分析，得出结果。

1.10 动物实验

1.10.1 建立急性肾损伤模型

72只SPF级雄性SD大鼠，实验开始前适应性喂养1周，随机分为对照组、庆大霉素组。对照组大鼠给予腹腔注射蒸馏水，连续注射7 d；模型组大鼠给予腹腔注射庆大霉素100 mg∙kg^‑1∙d^‑1，连续注射7 d；第8天眼眶静脉丛采血2 mL，并置代谢笼中收集24 h尿液，将收集的血清于3 500 r/min离心10 min，尿液于3 000 r/min 离心10 min，分装后冻存于-80 ℃待检。

检测肾功能指标CRE、BUN、UA、UP、LZM、NAG判断模型是否建立成功^［19］后，将大鼠分为对照（Con）组，将模型建立成功的大鼠分为模型（Mod）组、花生衣提取物低剂量（PS1，折合生药量8 mg∙kg^‑1∙d^‑1）组、花生衣提取物中剂量（PS2，折合生药量24 mg∙kg^‑1∙d^‑1）组、花生衣提取物高剂量（PS3，折合生药量72 mg∙kg^‑1∙d^‑1）组、地塞米松（Pos）组，每组10只开始连续灌胃14 d，末次给药后，置代谢笼中收集24 h尿液，并收集血清、肾组织冻存于-80 ℃冰箱待检。

1.10.2 大鼠肾脏指数测定及肾组织病理观察

各组大鼠腹主动脉取血后，颈椎脱臼处死，称体重和肾脏质量，计算肾脏系数，肾脏系数=双侧肾重（g）/取材当天小鼠体重（kg），每组随机选取6只大鼠的肾组织，置于4%多聚甲醛中固定24 h后，将肾组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后，按照苏木精和伊红（H&E）染色说明书染色，评估各组肾组织的组织形态变化。

1.10.3 大鼠尿液中UA、UP、LZM、NAG指标检测

末次给药后，置代谢笼中收集24 h尿液，取尿液，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，使用酶标仪检测尿液中UA、UP、LZM、NAG的含量。

1.10.4 大鼠肾组织MDA、SOD、GSH‑PX、NO、NOS指标检测

取10%的肾组织匀浆液按照试剂盒的说明，使用酶标仪检测肾组织中MDA、SOD、GSH‑PX、NO、NOS的含量。

1.10.5 大鼠血清IL‑6、IL‑1β、TNF‑α、CRE、BUN指标检测

末次给药后，取各组大鼠腹主动脉血，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，使用酶标仪检测血清中炎症指标IL‑6、IL‑1β、TNF‑α、CRE、BUN的含量。具体方法按试剂盒说明书操作。

1.10.6 大鼠肾组织中MAPK/PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达检测

采用免疫印迹法进行检测。称量肾组织并均质化，通过蛋白质裂解缓冲液提取总蛋白质，并定量蛋白质含量。通过SDS‑PAGE根据其分子量分离蛋白质，并将其转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶溶液封闭2 h后，加入p‑ERK1/2、ERK1/2、p‑JNK1/2/3、JNK1/2/3、p‑PI3K、PI3K、p‑AKT、AKT、GAPDH一抗（稀释比例均为1∶1 000），在4 °C下孵育过夜。孵育后，用含有吐温20的Tris缓冲盐水洗涤膜4次，与相应的二抗在室温下孵育90 min。最后，通过增强化学发光（ECL）检测发光液观察蛋白质条带，以凝胶成像系统检测，用ImageJ软件计算蛋白质条带灰度值进行定量分析。

1.11 统计学处理

应用GraphPad Prism7软件分析数据，计量数据以\overline{x}\pm s表示，2组间比较采用独立样本t检验，3组及以上采用单因素方差分析（ANOVA），P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基于UPLC‑Q‑TOF‑MS对花生衣提取物的分析

通过自建库、文献比对，在正离子模式下，共查找到24个花生衣提取物，负离子模式下，共查找到21个化合物。对花生衣提取物进行化学成分聚类分析可知，花生衣提取物中检测出45个化学成分，其中多酚类化合物13个、蒽醌类化合物1个、皂苷类化合物2个、脂肪酸类化合物8个、酯类化合物4个、木质素类化合物2个、生物碱类化合物1个、萜类化合物5个、甾体类化合物9个。见图1。

2.2 花生衣提取物入血成分分析

从大鼠血浆成分中鉴定出14种化合物，分别是Procyanidin A2、4‑Hydroxycinnamic acid、Behenic Acid、Arachidic Acid、Proanthocyanidin A1、Stigmasterol、Daidzein、Arachidonic Acid、Linoleic Acid、Esculetin、Ethyl palmitate、7‑Hexadecenoic acid、Lecithin、Luteolin 7‑O‑glucoside。见图2。

2.3 花生衣“药物‑活性成分‑靶点‑疾病通路”网络构建结果

2.3.1 花生衣提取物入血成分和疾病共同靶点的获取

利用Swiss Target Prediction平台、Pubchem数据库获取PS入血成分相关预测靶点，去除重复值后得到325个作用靶点；利用OMIM平台检索急性肾损伤靶点，得到急性肾损伤靶点128个、利用DisGeNET数据库，得到急性肾损伤靶点185个、利用PharmGKB数据库平台检索急性肾损伤靶点，得到急性肾损伤靶点20个、利用Gene Cards数据库平台检索急性肾损伤靶点，得到急性肾损伤靶点7 722个，以Relevance score>10为筛选条件，得到1 560个急性肾损伤相关靶点。将各数据库中得到的急性肾损伤靶点去重得到1 647个疾病靶点。将PS入血成分的预测靶点与疾病靶点输入Venny2.1.0平台，获取药物疾病共同靶点131个，见图3。

2.3.2 建立PS入血成分‑急性肾损伤靶点网络关系

利用软件Cytoscape 3.9.0绘制14个血浆入血成分和131个共同靶点映射关系网络图，得到PS化学成分‑急性肾损伤靶点网络关系。圆形节点代表靶点，三角形节点代表PS化学成分。其中，网络关系包含147个节点，331条边，自由度平均值为4.5，表明花生衣提取物中可能主要通过Arachidonic Acid、Linoleic Acid、Esculetin、7‑Hexadecenoic acid、Daidzein成分对AKI起治疗作用。见图4。

2.3.3 PPI网络构建与核心靶点的筛选

通过STRING数据库，对药物‑疾病的共有靶点信息进行分析，获得PPI网络，借助Cytoscape 3.7.1分析软件对数据进行处理构建PPI网络，网络中包括131个节点和1 772条边。通过Cytoscape 3.7.1插件CentiScaPe2.2计算出该网络的Betweenness、Closeness、Degree、分别为115.30、0.004、27.05。根据选择标准筛选出PPI网络的关键靶点25个，包括TNF、AKT1、EGFR、TP53、MMP9、SRC、PPARG、PTGS2、ESR1、MAPK3、ERBB2、GSK3B、KDR、TLR4、MMP2、IL2、MAPK1、ACE、NR3C1、PPARA、ABCB1、FYN、PLG、XDH、ABCG2。见图5。

2.3.4 花生衣提取物潜在GO和KEGG信号通路的预测用于治疗AKI

利用GO和KEGG对核心作用靶点进行分析可以更好地理解功能分子之间的关联及其相关性。GO富集分析主要涉及细胞凋亡过程的负调控、肽基酪氨酸磷酸化、对外源性刺激的反应、ERK1和ERK2级联的正调控有关。KEGG通路显示富集的通路主要分布在PI3K‑AKT通路、MAPK通路，这部分研究结果表明，PS可能通过调控PI3K‑AKT信号通路、MAPK信号通路从而改善了庆大霉素诱导的AKI。见图6。

2.3.5 AKI大鼠血清、尿液生化指标检测的结果

应用庆大霉素建立大鼠急性肾损伤模型，通过测定模型组大鼠血清中BUN、CRE的含量，大鼠尿液中UP、UA、LZM、NAG判断模型是否造模成功。与对照组相比，AKI组大鼠BUN、CRE、UP、LZM、NAG含量比对照组明显增高（P<0.01），UA含量明显降低（P<0.01），实验结果说明连续注射庆大霉素7 d后，大鼠的肾功能明显下降。见图7。

2.3.6 花生衣提取物对AKI大鼠尿液、血清中生化指标的影响

血清中肌酐、尿素氮是评价肾功能的常用指标，尿液中尿酸、尿蛋白的水平高低是提示肾脏肾小球或肾小管损伤的标志。与对照组相比，AKI组中大鼠CRE、BUN、UP含量明显升高（P<0.01），UA含量明显降低（P<0.01）；与模型组相比，花生衣提取物各组及阳性药组CRE、BUN、UP含量均明显降低（P<0.01），UA含量明显升高（P<0.01）；说明花生衣提取物可以明显改善大鼠肾小球滤过功能，缓解肾损伤。见图8。

2.3.7 花生衣提取物对AKI大鼠肾组织中氧化应激指标的影响

为了研究庆大霉素诱导的急性肾损伤大鼠肾组织中氧化应激反应的变化，本研究评估了肾脏匀浆中SOD、MDA、GSH‑PX、NOS和NO的含量。MDA、NO和NOS是反映机体内氧化应激的主要物质之一，生物体内的抗氧化剂防御系统包括主要包括SOD和GSH‑PX。Mod组中SOD、GSH‑PX活性明显降低（P<0.05），MDA、NO和NOS活性明显升高（P<0.01），与Mod组相比，不同剂量花生衣提取物组中MDA、NO和NOS活性明显下降，SOD和GSH‑PX活性明显增加，说明花生衣提取物能够改善肾脏氧化应激损伤状况并减轻肾脏损伤。见图9。

2.3.8 花生衣提取物对AKI大鼠血清中炎症因子指标的影响

炎症反应在急性肾损伤发生、进展过程中发挥重要作用，因此本研究评估了TNF‑α、IL‑1β、IL‑6炎性因子的含量。与Con组相比，Mod组中TNF‑α、IL‑1β、IL‑6的含量明显增高（P<0.05），与Mod组相比，不同剂量花生衣提取物组中TNF‑α、IL‑1β、IL‑6的含量明显下降，表明花生衣提取物通过降低肾脏中促炎细胞因子的水平从而改善肾脏炎症反应。见图10。

2.3.9 花生衣提取物对AKI大鼠肾组织系数和病理形态的影响

通过H&E染色发现，对照组大鼠肾小球、肾小管结构及细胞形态均未见异常，和对照组相比，模型组大鼠肾脏组织肾小管空泡化严重、囊腔比例增大、肾间质中大量炎性细胞浸润。花生衣提取物低剂量处理的大鼠的肾组织肾小管上皮细胞坏死减少、肾小管空泡化减少、炎性细胞浸润减少。花生衣提取物减轻了大鼠肾组织病理状态，抑制炎性细胞形成，改善了肾损伤。肾器官系数间接反映了肾组织水肿情况，AKI组肾器官系数明显高于对照组（P<0.01），与AKI组相比，不同剂量花生衣提取物组使肾器官系数呈剂量依赖性下降，说明花生衣提取物可以改善AKI组小鼠通气功能。见图11、表2。

2.3.10 花生衣提取物对AKI大鼠肾组织中MAPK信号通路相关蛋白表达的影响

KEGG富集分析发现MAPK与急性肾损伤的发生、发展密切相关，MAPK级联反应是调控多种细胞生物学过程，包括增殖、分化、凋亡和应激反应，所以，首先证实MAPK信号通路转导参与了庆大霉素诱导的急性肾损伤。与对照组相比，庆大霉素明显增强了MAPK磷酸化（P<0.01），同时花生衣提取物治疗组p‑ERK1/2、p‑JNK的水平明显降低（P<0.05）。这些结果表明，花生衣提取物可能影响了MAPK通路，从而改善肾损伤。见图12。

2.3.11 花生衣提取物对AKI大鼠肾组织中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响

PI3K/AKT信号通路是导致急性肾损伤发生、发展的关键信号转导通路，为了进一步验证花生衣提取物对肾损伤大鼠的保护机制，通过Western blot检测了大鼠肾组织中的PI3K/AKT信号通路的表达水平。在庆大霉素诱导的肾纤维化建立后，与对照组相比，庆大霉素明显增强了p‑PI3K、p‑AKT（P<0.01）。同时，花生衣提取物治疗组p‑PI3K、p‑AKT水平明显降低（P<0.01）。这些结果表明，花生衣提取物可能影响了PI3K‑AKT通路，从而改善肾损伤。见图13。

3 讨论

基于UPLC‑Q‑TOF‑MS 分析花生衣提取物中的化学成分和大鼠口服给药后血浆入血成分，共检测到45个化学成分和14个入血成分，根据聚类分析结果分析可知多酚类化合物为花生衣提取物中主要化合物。血清药物化学认为，血液成分是口服药物治疗效果的物质基础^［20］，因此，基于血液成分进行网络药理学研究可能会产生更严格和客观的发现。通过Cytoscape软件进行网络拓扑分析，确定花生提取物在急性肾损伤下的关键成分和靶点。通过STRING数据库构建了PPI网络，根据既定的选择标准从中选择了25个关键靶点，结果显示花生衣提取物主要通过Arachidonic Acid、Linoleic Acid、Esculetin、7‑Hexadecenoic acid、Daidzein成分对AKI产生治疗作用，其中Daidzein是具有生物活性的黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、心脑血管健康、抗骨质疏松以及改善更年期综合征等多种生理功能^［21］。Esculetin可有效抑制肾透明细胞癌786‑O和SN12‑PM6细胞增殖，诱导肾癌细胞凋亡^［22］；Procyanidin A2具有较强的抗氧化、抗炎、抗癌、抑菌、抗细胞凋亡、抗衰老、抗突变、降血压和神经保护等作用^［23］。以上结果说明多酚类化合物可能是花生衣潜在抗氧化和抗炎作用的药效物质基础。通过KEGG通路分析显示，富集的通路主要与PI3K/Akt信号通路和MAPK信号通路相关。这些发现表明，PI3K/AKT和MAPK信号通路可能在花生衣治疗急性肾损伤中起着至关重要的作用。

本文建立了庆大霉素诱导的急性肾损伤大鼠模型，进一步评价花生衣提取物的对AKI的改善作用。在临床实践中，CRE和BUN通常用作评估肾功能的指标，而UP是与各种肾脏疾病相关的生化指标^［24］。在严重急性肾损伤和慢性肾损伤的情况下，尿液中UA水平在一定程度上会降低。此外，LZM和NAG主要用作临床环境中肾小管损伤的标志物^［25］。与空白对照组相比，模型组大鼠LZM和NAG水平的升高证实了急性肾损伤模型的成功建立。肾脏的病理改变是急性肾损伤的关键指标，包括肾小管空泡化、囊性改变和肾间质内炎性细胞的广泛浸润^［26］。本研究结果显示，模型组大鼠肾间质出现肾小管空泡化、囊性改变、炎性细胞浸润和肾脏系数增加。给予72 g/kg花生衣提取物后，肾组织的病理变化明显改善，肾组织结构完整性改善，肾系数明显降低。庆大霉素诱导的肾组织损伤导致ROS水平升高，氧化和抗氧化水平之间的平衡对于减轻AKI至关重要^［27］。MDA是自由基介导的脂质过氧化的副产物，是评估体内氧化应激的主要生物标志物。SOD和GSH‑PX是关键的抗氧化剂。此外，NO和NOS是氧化应激的重要指标^［28］。在本研究中，AKI组的SOD和GSH‑PX活性明显降低，而MDA、NO和NOS水平明显升高。与AKI组相比，不同剂量的花生衣提取物导致MDA、NO和NOS活性明显降低，SOD和GSH‑PX活性明显升高。这些发现表明，花生衣提取物可以改善氧化应激相关的肾损伤，减轻肾损伤。炎症反应是急性肾损伤发生和进展的关键因素。研究表明，受损的肾小管上皮细胞通过释放促炎细胞因子，如TNF‑α、IL‑1β和IL‑6，促进炎症细胞的趋化和活化，从而加剧炎症反应^［29］。模型组大鼠中IL‑1β、IL‑6和TNF‑α的增加表明庆大霉素诱导了肾组织的炎症反应，花生衣给药治疗后，治疗组大鼠促炎细胞因子的水平明显降低，表明花生衣提取物有效减轻了肾脏炎症反应。PI3K是一种脂质激酶，在各种生理和病理过程的信号转导中起着关键作用^［30］。AKT是蛋白激酶第二信使调节亚家族的成员，是PI3K的主要下游效应器之一，介导其大部分功能。PI3K/AKT通路与各种细胞因子和趋化因子的信号机制错综复杂地联系在一起，从而调节许多细胞功能。值得注意的是，它在凋亡、细胞增殖和肿瘤转移等过程中起着关键作用^［31］。通常，PI3K/AKT信号通路的激活是由与G蛋白偶联受体结合的配体引发的，导致PI3K的磷酸化，随后激活下游AKT并进一步刺激MAPK通路^［32］。Western blot验证结果显示庆大霉素诱导后，大鼠肾组织中p‑ERK、p‑JNK、p‑AKT、p‑PI3K蛋白表达水平明显升高，花生衣提取物可以降低ERK、JNK、AKT、p‑PI3K蛋白的磷酸化水平，缓解肾脏炎症因子浸润，平衡肾脏组织氧化物质和抗氧化物质的失衡。

综上所述，花生衣提取物通过MAPK/PI3K/AKT信号通路有效改善了庆大霉素诱导的急性肾损伤，这些作用与抗炎、抗氧化和抗凋亡等多种蛋白活性密切相关，为花生衣在肾疾病中的应用提供了理论基础，为药食同源的开发提供了新思路。但本研究仅在药效层面探讨了花生衣对急性肾损伤的改善作用，未在作用机制深入研究，而MAPK信号通路参与细胞增殖、分化、凋亡、应激反应等多种生理过程^［33］，这些潜在的作用机制有待深入研究。在接下来研究中，课题组将根据已有研究结果，对花生衣改善肾疾病的活性成分、信号通路和作用靶点机制进行深入研究，进一步挖掘花生衣在医药保健等领域的应用潜力，推动花生衣资源高值化利用。

作者贡献度说明：

李俞瑶：参与研究设计和论文撰写；郭亚萍、陈雯艳：参与数据整理和论文撰写；沙巴艾提·艾买尔和段雅楠：参与实验数据的获取及分析；张珂和杨璐：参与论文修改与校审；王航宇和王金辉：指导实验研究。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家重大专项新药创制项目(2018ZX09735‑005)