基于网络药理学和实验验证研究蒲公英颗粒保护小鼠急性肺损伤的作用机制

Mechanism of Taraxacum mongolicum granules intervening mice acute lung injury based on network pharmacology and experimental verification

摘要

目的 基于网络药理学、分子对接和体、内外实验探讨蒲公英颗粒（Taraxacum mongolicum granules，TMG）治疗急性肺损伤（acute lung injury，ALI）的作用机制。 方法 采用网络药理学筛选TMG治疗ALI的关键靶点，预测TMG治疗ALI相关通路，构建“药物‑活性成分‑靶点”网络图，通过分子对接预测核心成分与关键靶点的结合能力。通过体内、外实验验证网络药理学分析结果。体内实验采用腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立小鼠ALI模型，分为Control组、LPS组、TMG低/中/高剂量组、盐酸地塞米松（dexamethasone,Dex）组，每组10只。给药5 d后检测肺组织H&E、免疫组化等病理染色，ELISA检测小鼠BALF中IgM、IL‑1β、IL‑18、IL‑6、TNF‑α表达，Western blot检测NLRP3、ASC、Caspase‑1、GSDMD‑N、GSDMD蛋白表达，RT‑qPCR检测NLRP3、Caspase‑1、GSDMD mRNA表达。体外实验采用LPS+尼日利亚菌素钠盐建立MH‑S细胞焦亡模型，分为Control组、Model组、TMG低/中/高剂量组、Dex组，RT‑qPCR检测IL‑1β、IL‑18、IL‑6、TNF‑α、NLRP3、Caspase‑1、GSDMD mRNA表达，Western blot检测NLRP3、ASC、Caspase‑1、GSDMD‑N、GSDMD蛋白表达。 结果 网络药理学显示SRC、PIK3R1、HSP90AA1、AKT1、MAPK1、TNF、IL‑1β、TLR4等是治疗ALI的关键靶点。分子对接表明TGM与TNF、IL‑1β、TLR4、SRC、MAPK1具有较高的亲和力。KEGG富集在Toll样受体信号通路、NOD‑like等炎症通路。体内实验表明TMG可以减轻肺组织病理损伤，减少炎症因子释放，抑制NLRP3、ASC、Caspase‑1、GSDMD‑N、GSDMD的表达。体外实验表明TMG可以减少MH‑S细胞炎症因子释放，抑制NLRP3、ASC、Caspase‑1、GSDMD‑N、GSDMD表达。 结论 TMG可改善LPS诱导小鼠ALI炎症反应，保护肺组织，减少炎症因子释放，其作用机制可能与抑制NLRP3/Caspase‑1/GSDMD信号通路介导的肺泡巨噬细胞焦亡有关。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of Taraxacum mongolicum granules （TMG） treating acute lung injury （ALI） through an integrated approach combining network pharmacology， molecular docking， and comprehensive in vivo and in vitro experimental analyses. Methods Key targets of TMG treating ALI were screened by network pharmacology， and the related pathways of TMG treating ALI were predicted. The "drug‑active ingredient‑target" network diagram was constructed， and the binding ability of the core components and the key targets was predicted by molecular docking. The results of network pharmacology analysis were verified by in vivo and in vitro experiments. In vivo experiments were conducted to establish a mouse ALI model by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide （LPS）. The mice were divided into the Control group， the LPS group， the TMG low/medium/high‑dose groups， and the dexamethasone （Dex） group， with 10 mice in each group. On day 5 of administration， pathological staining such as H&E and immunohistochemistry were performed on lung tissue， ELISA was used to detect the expressions of IgM， IL‑1β， IL‑18， IL‑6， and TNF‑α in the BALF of mice. Western blot was used to detect the protein expressions of NLRP3， ASC， Caspase‑1， GSDMD‑N， and GSDMD， and RT‑qPCR was used to detect the mRNA expressions of NLRP3， Caspase‑1， and GSDMD. In vitro experiments， LPS and nigericin were used to establish a pyroptosis model of MH‑S cells， which were divided into the Control group， the Model group， the TMG low/medium/high‑dose group， and the Dex group. RT‑qPCR was used to detect the mRNA expression of IL‑1β， IL‑18， IL‑6， TNF‑α， NLRP3， Caspase‑1， and GSDMD. Western blot was used to detect the protein expressions of NLRP3， ASC， Caspase‑1， GSDMD‑N， and GSDMD. Results Network pharmacology showed that SRC， PIK3R1， HSP90AA1， AKT1， MAPK1， TNF， IL‑1β， and TLR4， etc. were key targets for the treatment of ALI. Molecular docking showed that TGM had a high affinity with TNF， IL‑1β， TLR4， SRC， and MAPK1. KEGG was enriched in the Toll‑like receptor signaling pathway， NOD‑like and other inflammatory pathways. In vivo experiments showed that TMG could reduce pathological damage of lung， reduce the release of inflammatory factors， and inhibit the expressions of NLRP3， ASC， Caspase‑1， GSDMD‑N， and GSDMD. In vitro experiments showed that TMG could reduce the release of inflammatory factors in MH‑S cells， and inhibit the expressions of NLRP3， ASC， Casase‑1， GSDMD‑N， and GSDMD. Conclusion TMG can improve the LPS‑induced ALI inflammatory response in mice， protect lung tissue， reduce the release of inflammatory factors， and its mechanism of may be related to the inhibition of NLRP3/Caspase‑1/GSDMD signaling pathway mediated alveolar macrophage pyroptosis.

Graphical abstract

关键词

急性肺损伤 / 蒲公英颗粒 / NLRP3/Caspase‑1/GSDMD信号通路 / 细胞焦亡

Key words

Acute lung injury / Taraxacum mongolicum granules / NLRP3/Caspase‑1/GSDMD signaling pathway / Pyroptosis

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是由各种肺内、外致病因素导致的一种以呼吸窘迫和进行性低氧血症为特征的常见临床综合征^［1］。流行病学调查显示，全球ALI重症病例的发病率约为10%，病死率高达50%^［2，3］。目前ALI发病机制尚不完全清楚，剧烈炎症反应和氧化应激被认为是ALI的重要病理生理机制^［4，5］。肺巨噬细胞（alveolar macrophage，AM）是促炎（M1）巨噬细胞，在ALI发病过程中产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）和炎症介质（IL‑1β、iNOS、TNF‑α等），导致细胞因子风暴和严重的肺损伤^［6］。

研究发现NLRP3/Caspase‑1介导巨噬细胞焦亡引起ALI^［7］。另有研究表明焦亡可引发细胞因子风暴，加重ALI^［8］。当ALI发生时，NLR家族含pyrin结构域NOD样受体家族3（NOD‑，LRR‑ and pyrin domain‑containing protein 3，NLRP3）炎性小体与含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis‑associated speck‑like protein containing a CARD，ASC）寡聚及Caspase‑1连接，形成活跃的炎症小体（包含NLRP3、ASC和Caspase‑1）^［9，10］，被激活的Caspase‑1裂解为裂解的Caspase‑1，诱导GSDMD产生N端GSDMD片段（N‑GSDMD），触发炎症细胞因子（IL‑1β、IL‑18、TNF‑α等）的释放，诱发焦亡^{［11，12］}。目前糖皮质激素是治疗ALI的主要方法，但不良反应较多，包括耐药性、代谢紊乱和骨质疏松症等^{［13，14］}。Peleman等^［15］的一项研究中发现焦亡在影响患者预后方面发挥了关键作用，为治疗ALI提供了方向。

近年来，草药治疗炎症性疾病取得较大进展^［16］，已有研究证实其在治疗ALI中有效^［17］。蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.‑Mazz.，T. mongolicum）为菊科多年生草本植物，已被纳入《中国药典》^［18］，具有“天然抗生素”之称。有研究表明蒲公英对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等多种细菌有明显抑菌、杀菌作用^［19］。蒲公英颗粒（Taraxacum mongolicum granules，TMG）是由蒲公英和蔗糖调配而成的颗粒，已用于上呼吸道感染、急性扁桃体炎、疖肿等多种炎性疾病的治疗。虽然TMG具有抗炎作用^［20］，但对ALI的治疗作用及其机制尚不明确。

网络药理学可以通过宏观角度分析和预测药物干预疾病潜在的机制^［21］。本研究利用网络药理学，通过建立ALI小鼠模型和MH‑S细胞焦亡模型，初步探讨TMG治疗ALI的机制，为ALI的临床治疗提供新的思路，为TMG的药用价值增加新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与细胞

6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠，重量22~25 g，无特异性病原体，由贵州医科大学动物房购于斯贝福生物技术有限公司（北京，中国）［动物生产许可证：SCXK（京）2019‑0010，使用许可证号：SYXK（贵）2023‑0002］。本研究所有动物实验经过贵州医科大学实验动物伦理委员会授权（批准号：2023‑09‑15，伦理审查号：22305087），对小鼠的处理遵循动物福利伦理原则。小鼠饲养于动物室控制条件下（12 h明暗循环，21~23 ℃，45%~65%湿度）。小鼠肺泡巨噬细胞MH‑S细胞系（批号：GC2403027）购于武汉塞维尔科技有限公司。

1.1.2 药物与试剂

TMG（成分为蒲公英和蔗糖，15 g/袋）由四川同人泰药业股份有限公司提供（批号：23010305）；大肠杆菌O55∶B5的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）购于北京Solarbio公司（批号：IL2020）；尼日利亚菌素钠盐（Nigericin，Nig）购于美国APExBIO公司（批号：28643‑80‑3）；盐酸地塞米松注射液（dexamethasone，Dex）购于成都倍特药业股份有限公司（批号：N2405112）；胎牛血清、1640培养基购于武汉Pricella公司（批号：64210‑50、PM150110）；H&E试剂盒购于北京Solarbio公司（批号：G1120）；IgM、IL‑1β、IL‑6、IL‑18、TNF‑α ELISA试剂盒购于江苏晶美生物公司（批号：JM‑02341M1、JM‑02323M1、JM‑02446M1、JM‑ 02452M1、JM‑02415M1）；NLRP3抗体、ASC抗体购于美国Cell Signaling Technology公司（批号：D4D8T、D2W8U）；Pro‑Caspase‑1抗体、GSDMD购于英国Abcam公司（批号：AB179515、AB219800）。β‑actin购于武汉Proteintech公司（批号：HRP‑6609）；山羊抗兔IgG二抗购于美国APExBIO公司（批号：K1223）；Trizol试剂盒、逆转录试剂盒、qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒购于上海Yeasen公司（批号：10606ES60、11141ES60、1118‑ES08）。

1.1.3 主要仪器

RM2245荧光显微镜、DM2500半自动石蜡切片机（德国莱卡公司）；Synergy H4酶标仪（中国香港基因有限公司）；化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；电泳仪（美国Bio‑Rad公司）；高温灭菌型CO₂培养箱、NanoDrop 2000分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 网络药理学分析

1.2.1.1 TMG成分筛选和ALI靶点预测

以“蒲公英”为关键词，通过HERB本草组鉴数据库（http：∥herb.ac.cn/）搜索化学成分。在PubChem数据库（https：∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查询相关成分Canonical SMILES号。在中医药系统药理数据库和分析平台TCMSP^［22］（https：∥www.tcmsp‑e.com/#/home）及SwissADME^［23］（http：∥www.swissadme.ch/）对化合物进行筛选。TCMSP设置OB（≥30%）和DL（≥0.18）为筛选条件，SwissADME设置类药性满足Lipinski、Ghose、Veber、Egan和Muegge中任意3种评价模型合格（Yes）且生物利用度评分（bioavailability score）≥0.55^［24］。不满足上述条件，但已经证实可以入药的化合物也纳入其中。使用目标化合物的Canonical SMILES号在SwissTargetPrediction数据库^［25］（http：∥www.swisstargetprediction.ch/）搜索，选择为“Homo Sapiens”和probability>0的靶点作为目标靶点。

在GeneCards数据库^［26］（https：∥auth.lifemapsc.com/）中以“acute lung injury”为关键词查询相关靶点，选择relevance score>1的靶点作为潜在靶点。将T. mongolicum靶基因与ALI相关靶基因在微生信平台（https：∥www.bioinformatics.com.cn/）取交集，绘制Venn图。

1.2.1.2　蛋白质‑蛋白质相互作用（protein‑protein interaction，PPI）网络构建将T.mongolicum治疗ALI潜在靶点导入STRING数据^［27］（https：∥cn.string‑db.org/），选择“Multiple proteins”，物种选为“Homo Sapiens”，设置“minimum required interaction score”为0.9，其余参数默认，构建PPI网络，并将数据导入Cytoscape 3.10.0进行可视化分析。

1.2.1.3 基因本体（Gene ontology，GO）功能富集和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

为确定T. mongolicum在ALI中的潜在生物学功能和治疗机制，通过DAVID数据库^［28］（https：∥david.ncifcrf.gov/）对T. mongolicum治疗ALI的交叉靶点的进行GO和KEGG富集分析并在微生信平台绘制成气泡图。

1.2.1.4 “药物‑活性成分‑靶点”网络构建

基于T. mongolicum活性成分、治疗ALI潜在靶点，构建“药物‑活性成分‑靶点”图。使用Cytoscape 3.10.0软件进行可视化处理。

1.3 分子对接

选择鉴定出的主要基因与T. mongolicum前6位活性成分进行分子对接模拟。从PubChem数据库下载活性成分2D结构，用OpenBabel 2.3.2软件转化为3D结构，Avogadro1.2.0进行结构优化。从RCSB数据库（https：∥www.rcsb.org/）获得目标蛋白的结构，使用Pymol‑open‑source 2.6.0去除蛋白质中多余的配体和水分子，使用Reduce 3.23给蛋白质加氢。使用ADFRsuite‑1.0和Vina 1.2.5进行分子对接。最后，使用PyMol 2.5.5可视化对接结果。

1.4 体、内外实验验证TMG治疗ALI的作用机制

1.4.1 动物造模

将60只C57BL/6J小鼠适应性喂养7 d后随机分为Control组、LPS组、TMG 低/中/高剂量（TMG L/M/H）组、Dex组。人与小鼠的剂量换算比为1∶12.3^［29］，TMG L/M/H组分别每日灌胃给药剂量4.5、9.0、18 g/kg。Control、LPS、Dex组分别灌胃等体积生理盐水。连续灌胃5 d后，LPS、TMG L/M/H、Dex组腹腔注射LPS（15 mg/kg），Control组给予生理盐水，Dex组提前1 h给予5 mg/kg Dex。24 h后所有小鼠安乐处死，取支气管肺泡灌洗液（BALF）、肺组织保存。

1.4.2 细胞实验

小鼠肺泡巨噬细胞MH‑S细胞系在含有10%胎牛血清和1%青霉素‑链霉素的RPMI‑1640中，置于37 ℃、5% CO₂的加湿培养箱中培养。结合文献［30］建立细胞焦亡模型。细胞分为Control组、Model（MOD）组、Dex组和TMG 低/中/高剂量（TMG L/M/H）组。MH‑S细胞先用TMG（80、160、320 μg/mL）、Dex（2 μg/mL）预处理24 h，然后用1 000 ng/mL LPS处理4 h，最后用10 μmol/L Nig刺激2 h。

1.4.3 H&E染色

将肺组织经固定、脱水、包埋、切片等操作后，用H&E染色，最后在光学显微镜下观察。根据肺组织损伤情况评分^［30］，包括无损伤（1分）、肺泡充血（2分）、出血（3分）、中性粒细胞浸润到空气或血管壁（4分）、肺泡壁厚度增加/透明膜形成（5分）。

1.4.4 肺湿/干比

取小鼠右肺上叶称重，随后置于65 ℃恒温箱干燥72 h，记录干重。利用肺湿/干重量比（W/D），评估肺水肿程度。

1.4.5 BALF细胞计数及蛋白浓度测定

将BALF以3 000 r/min离心15 min收集细胞及上清液。加入红细胞裂解液沉淀细胞，用PBS洗涤细胞2次，用1 mL PBS重悬，并用自动细胞计数器计数。采用bicinchoninic acid（BCA）蛋白浓度测定试剂盒检测BALF蛋白浓度。

1.4.6 酶联免疫吸附实验（ELISA）

采用ELISA试剂盒按说明书检测细胞因子IgM、IL‑1β、IL‑6、IL‑18、TNF‑α 表达情况。

1.4.7 免疫组织化学染色（IHC）

IHC检测小鼠肺组织中NLRP3、Caspase‑1、GSDMD、F4/80蛋白表达量。将3 μm肺切片去蜡化，然后进行抗原修复、内源性过氧化物酶的阻断及血清封闭，再用一抗在4 ℃下孵育过夜。PBS洗涤后，切片用相应的二抗检测试剂盒检测一抗结合。封片后在光学显微镜下观察小鼠肺组织中上述蛋白的表达情况。最后，采用ImageJ软件进行分析。

1.4.8 免疫荧光染色（IF）

将肺组织固定在4%多聚甲醛溶液中，随后将肺组织与抗TNF‑α一抗在4 ℃加湿室中孵育过夜。次日用PBS洗涤，用荧光素标记的二抗避光孵育2 h，用DAPI对细胞核染色，最后使用荧光显微镜拍照，ImageJ软件分析。

1.4.9 Western blot分析

从肺组织和MH‑S细胞中提取总蛋白，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。然后用10%十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS‑PAGE）分离蛋白质，并转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。在5%脱脂牛奶中封闭2 h，将膜与一抗在4 ℃下孵育过夜，包括ASC（1∶1 000）、pro‑Caspase‑1（1∶1 000）、GSDMD（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、β‑actin（1∶10 000）。次日，用TBST缓冲液洗涤3次，将膜与二抗在室温下孵育2 h，β‑actin孵育二抗。最后，条带通过ECL试剂盒在化学发光成像系统下显影，使用ImageJ软件分析灰度值。

1.4.10 CCK‑8细胞活力分析

将处于对数生长期的MH‑S细胞接种至96孔板中，在培养箱中培养24 h，分别使用浓度为0、40、80、160、360、640、1 280、2 650 μg/mL的TMG处理细胞，继续培养24 h。孵育结束后，每孔加入20 μL CCK‑8溶液，置于培养箱避光孵育1~4 h，使用酶标仪在450 nm波长下对各孔的吸光度（A）进行检测。细胞存活率=（A_实验组-A_空白组）/（A_对照组-A_空白组）×100%。

1.4.11 实时定量PCR（RT‑qPCR）分析

根据试剂说明书，使用Trizol试剂从肺组织、MH‑S细胞中提取总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计检测提取的RNA纯度及浓度。使用逆转录试剂盒构建互补DNA（cDNA）。使用qPCR SYBR Green Master Mix 试剂盒检测mRNA的表达。采用β‑actin作为内参基因，用2^-ΔΔCt方法计算mRNA表达量的倍数变化。所有基因的引物序列来自Sangon Biotech，详细信息见表1。

1.5 统计学处理

使用GraphPad Prism 10软件进行统计学分析，计量数据以\overline{x}\pm s表示。多组间比较用单因素方差分析（ANOVA），两组间比较采用Student's t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学结果

2.1.1 T. mongolicum和ALI交集基因Venn图

通过HERB、TCMSP、SwissADME网站获得T. mongolicum 26个化学成分（表2），SwissTargetPrediction数据库预测到521个靶点。在GeneCards数据库中检索到8 833个ALI靶点。将T. mongolicum和ALI靶点取交集，得到437个交集靶点，绘制Venn图（图1A）。

2.1.2 PPI网络

由437个靶基因构建PPI网络，包括435个节点和1 022条边，使用Cytoscape 3.10.0进行可视化（图1B）。Degree排名前10的靶点包括SRC、PIK3R1、PIK3CA、STAT3、PIK3CB、HSP90- AA1、AKT1、MAPK1、ESR1、EGFR。此外，TNF、IL‑1β、TLR4是与炎症相关，degree值排名较前且具有统计学意义的靶点。

2.1.3 GO和KEGG富集分析

将T. mongolicum与ALI相交集的437个靶基因提交到DAVID数据库，用微生信平台进行GO功能和KEGG通路富集分析。鉴定出GO功能富集项776条和157条KEGG途径（P<0.01）。GO包括540个生物过程（BP）、164个分子功能（MF）和72个细胞成分（CC）。对BP、MF、CC前20项富集分析（图2A~C）。BP主要集中在磷酸化、凋亡过程的负调控、炎症反应、对缺氧的反应等生物学过程。MF包括ATP结合、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白丝氨酸激酶活性。CC主要涉及质膜、细胞外泌体、细胞质、细胞表面。KEGG与炎症有关的前15条通路包括炎症介质对TRP通道的调节、PI3K‑Akt信号通路、Toll样受体信号通路、NOD‑like通路等（图2D）。选择NOD‑like通路有关指标进行后续实验。

2.1.4 “药物‑活性成分‑靶点”网络

使用Cytoscape 3.10.0软件将T. mongolicum 26个活性成分和437个T. mongolicum‑ALI靶点构建“药物‑活性成分‑靶点”网络（图3）。

2.1.5 分子对接

用T. mongolicum 8个主要靶点（SRC、PIK3R1、HSP90AA1、AKT1、MAPK1、TNF、IL‑1β、TLR4）和6个核心活性成分（No. 4、1、6、20、8、16）进行分子对接模拟。在8组蛋白‑配体复合物中选择结合能力最强的前5组进行可视化，分别是TNF‑11β，13‑dihydrotaraxinic acid β‑glucopyranosyl ester、IL‑1‑beta‑sitosterole、TLR4‑beta‑sito- sterol、SRC‑beta‑sitosterol、MAPK1‑beta‑sitosterol（图4A），结合能依次为-9.471、-7.651、-7.276、-7.508、-7.983 kcal/mol。将8组分子对接复合物结合能绘成热图（图4B）。

2.1.6 TMG预处理可以减轻LPS诱导小鼠ALI

与Control组相比，LPS组肺组织H&E染色结果显示肺泡间隔增厚、出血，大部分肺泡断裂融合成片，有明显的中性粒细胞及巨噬细胞浸润。与LPS组比，TMG和Dex组上述病理改变减轻。TMG中剂量组及Dex组肺损伤明显减轻，以Dex组最明显，见图5A。与LPS组相比，TMG及Dex组肺损伤评分明显降低（P<0.01），见图5B。巨噬细胞标记物F4/80 IHC染色结果表明TMG和Dex可减轻LPS诱导的肺组织巨噬细胞浸润，TMG以中剂量组效果最好，Dex组改善最明显（P<0.01），见图5C、D。LPS组肺W/D重量增加，提示肺水肿，TMG和Dex肺W/D重量比降低，肺水肿减轻（P<0.001），见图5E。与Control相比，LPS组BALF总细胞及蛋白明显升高（P<0.001），而TMG和Dex组明显低于LPS组（P<0.001），见图5F、G。结果表明TMG预处理可以减轻LPS诱导的小鼠肺部炎症、改善病理改变和降低肺损伤评分。

2.1.7 TMG减轻LPS诱导的小鼠ALI炎症反应

IHC染色结果表明，与Control组比，LPS组肺组织中髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）表达明显升高（P<0.001），TMG和Dex组表达量明显降低，以TMG中剂量组减轻最明显（P<0.01），见图6A、B。ELISA检测小鼠BALF，与Control组比，LPS组IgM、IL‑1β、IL‑18、IL‑6、TNF‑α的表达量明显升高（P<0.001）；与LPS组比，TMG和Dex组上述指标表达明显降低（P<0.05），见图6C~G。肺组织IF染色结果表明，与LPS组相比，TMG和Dex组肺组织TNF‑α表达量明显降低（P<0.01），见图6H、I。综上所述，TMG预处理可以减轻ALI炎症反应。

2.1.8 TMG减轻LPS诱导ALI小鼠NLRP3/Caspase‑1/GSDMD介导的焦亡

IHC染色结果显示，与Control组相比，LPS组肺组织NLRP3、GSDMD表达量明显升高（P<0.001）；与LPS组比，TMG和Dex组表达降低（P<0.001），见图7A~C。RT‑qPCR结果表明，与Control组相比，LPS组肺组织中NLRP3、Caspase‑1、GSDMD mRNA水平明显升高（P<0.001）；与LPS组比，TMG和Dex组肺组织中NLRP3、Caspase‑1、GSDMD mRNA表达量明显降低（P<0.001），见图7D~F。Western blot结果表明，与Control组比，LPS组NLRP3、ASC、Caspase‑1、GSDMD、GSDMD‑N蛋白表达量升高（P<0.001）；与LPS组比，TMG和Dex组上述蛋白表达量明显降低（P<0.05），见图7G~L。说明TMG可能通过抑制NLRP3/Caspase‑1/GSDMD通路介导的焦亡减轻ALI小鼠炎症反应。

2.1.9 TMG减轻MH‑S细胞炎症反应

通过CCK‑8实验筛选出TMG在40~2 560 μg/mL浓度范围内对MH‑S细胞无明显细胞毒性，在640 μg/mL以后的浓度活性下降。因此，选择160、320、640 μg/mL 3个浓度进行后续实验（图8A），依次设为低（L）、中（M）、高（H）剂量组。Western blot结果显示LPS/Nig造模时，随着LPS浓度增加NLRP3、GSDMD、GSDMD‑N蛋白表达量增加，在LPS 1 000 ng/mL、Nig 10 μmol/L蛋白表达量最多（P<0.001），故选择该条件建立MH‑S细胞焦亡模型（Model组），见图8B~E。在MH‑S细胞焦亡模型中，RT‑qPCR结果显示，与Model组相比，TMG和Dex组IL‑1β、IL‑6、IL‑18、TNF‑α mRNA表达量明显降低（P<0.001），见图8F~I。说明TMG可以减少MH‑S细胞焦亡炎症因子释放。

2.1.10 TMG减轻NLRP3/Caspase‑1/GSDMD介导的MH‑S细胞焦亡

Western blot结果显示，与Control组比，Model组MH‑S细胞中ASC、Caspase‑1、GSDMD‑N、GSDMD、NLRP3蛋白水平明显升高（P<0.01）。与Model组比，TMG和Dex组上述蛋白表达量降低（P<0.05），见图9A~F。RT‑qPCR结果表明，Model组与Control组相比，Caspase‑1、GSDMD、NLRP3 mRNA表达量升高（P<0.001），而TMG可以发挥与Dex相同的作用，逆转了这一趋势（P<0.001），见图9G~I。

3 讨论

ALI发病机制复杂，涉及多个靶点、途径和机制的跨网络相互作用，其中肺部炎症是ALI的关键病理过程。ALI初期，活化的上皮及内皮细胞释放大量的炎症因子，导致继发性炎症反应^［31］。随着病情进展，炎症因子不断积累可引发严重的细胞因子风暴^［32］。细胞焦亡常常伴随炎症的发生，它是一种涉及核DNA断裂的细胞死亡类型。当肺部发生炎症时，NLRP3被激活，Caspase‑1激活后裂解GSDMD为GSDMD‑N，释放IL‑18、IL‑1β，诱导细胞焦亡^{［33，34］}。AMs可维持肺上皮的完整性^［35］，是肺泡中最丰富的免疫细胞，保护肺免受致病性攻击，维持免疫平衡和肺内稳态^［36］。AMs中发生焦亡加重ALI患者的病情。遗憾的是，单靶点药物对ALI的作用有限。中药活性成分多，具有多药理活性、多靶点、多通路的特点，为ALI治疗提供了新的前景。蒲公英是“天然抗生素”，其抗炎效果已被广泛证实，TMG唯一入药成分就是蒲公英，但对ALI是否有抗炎作用尚不明确。本研究通过网络药理学结合体内、外实验阐明TMG治疗ALI的潜在机制。

网络药理学通过连接中药活性成分、相关靶点和相应疾病，可预测中药治疗疾病的作用靶点^［37］。研究表明槲皮素可以调节氧化应激、改善炎症，可以抑制NLRP3炎性囊泡的激活^［34］，已被证实可以改善LPS诱导的ALI^［38］。本研究通过网络药理学分析发现萜类、β‑谷甾醇、槲皮素等是TMG治疗ALI的主要活性化合物，SRC、PIK3R1、HSP90AA1、AKT1、MAPK1、TNF、IL‑1β、TLR4是治疗ALI的度值较高靶点。KEGG通路分析T. mongolicum治疗ALI涉及多个信号通路，其中包括NOD‑like信号通路。NLRP3/Caspase‑1/GSDMD是经典的焦亡信号通路，在焦亡过程中产生大量的IL‑1β和TNF，是ALI的重要发病机制之一。因此，本课题组假设TMG可以通过抑制焦亡来抑制炎症反应，从而减轻ALI。

本研究通过LPS诱导小鼠ALI和LPS/Nig诱导MH‑S细胞焦亡模型来验证这一假设。首先，在体内验证了TMG对LPS诱导小鼠ALI是否有保护作用。在ALI小鼠模型中，H&E染色结果显示，LPS诱导小鼠出现肺泡断裂、融合成片、出血等严重的病理改变，肺损伤评分明显升高。F4/80是成熟小鼠巨噬细胞标志物，可以表达于肺的巨噬细胞，它是一种细胞表面糖蛋白。IHC染色结果表明，给予LPS后小鼠肺组织F40/80明显增加。此外，在LPS组BALF中细胞总数、总蛋白明显升高。给予TMG预处理后，小鼠肺组织病理损伤减轻，肺损伤评分下降，F40/80表达量减少，逆转了LPS引起的BALF中细胞总数和总蛋白升高，以TMG中剂量组效果最为明显，这些改变与Dex组效果无明显差异，表明TMG对ALI具有保护作用。

在ALI发展中全身炎症反应综合征是重要环节之一^［39］，MPO被认为是中性粒细胞的特异性生物标志物，促炎细胞因子（IL‑1β、IL‑6、IL‑18、TNF‑α）会引发组织损伤及炎症^［40］，因此抑制这些炎症细胞因子可以减弱LPS诱导的ALI。网络药理学表明MPO、IL‑1β、TNF是TMG治疗ALI的靶点。分子对接进一步证实了TMG活性主要活性成分11β，13‑dihydrotaraxinic acid β‑glucopyranosyl ester和beta‑sitosterole分别对TNF、IL‑1β具有良好的亲和力。IHC染色结果表明TMG组较LPS组肺组织中MPO表达量降低。经TMG处理的ALI小鼠BALF中IL‑6、IL‑1β、TNF‑α、IL‑18表达量降低。在MH‑S细胞焦亡模型中，经TMG处理后明显抑制IL‑6、IL‑1β、TNF‑α、IL‑18 mRNA的表达。由此，证实了TMG可以减轻LPS所致肺组织急性炎症反应。

AM作为ALI的“开关”细胞^［41］，在ALI早期，AM通过分泌促炎因子加重炎症级联反应^［42］。AM焦亡程度与ALI预后密切相关^［43］。研究表明，使用NLRP3抑制剂或靶向敲除AM中的NLRP3基因以减少AM焦亡也可有效减轻ALI的损伤程度^［7，44］。KEGG分析表明TMG治疗ALI与NOD‑like通路有关。NLRP3是NOD‑like受体中的一员，TMG中含有槲皮素具有抑制NLRP3炎症小体的作用。IHC及RT‑qPCR结果表明TMG组ALI小鼠肺组织Caspase‑1、GSDMD、NLRP3表达减少。Western blot结果表明TMG在体内和体外能抑制ASC、Caspase‑1、NLRP3、GSDMD‑N、GSDMD蛋白表达。在MH‑S细胞焦亡模型中，经TMG处理后Caspase‑1、GSDMD、NLRP3 mRNA的表达明显下降。这些结果表明TMG可能通过抑制NLRP3/Caspase‑1/GSDMD介导的肺泡巨噬细胞焦亡减轻ALI。

综上所述，本研究结果表明LPS可以上调促炎因子，激活NLRP3引起小鼠ALI。TMG可以下调BALF细胞总数及总蛋白，减少IL‑6、IL‑1β、TNF‑α、IL‑18炎症因子的产生，减轻ALI的病理过程。TMG对ALI的治疗未表现出剂量效应关系，可能与其作用成分、靶点、通路多有关。大部分结果表明，以临床剂量等效于小鼠中剂量效果最佳，甚至与Dex疗效媲美。TMG可能通过抑制NLRP3/Caspase1/GSDMD介导的肺泡巨噬细胞焦亡减轻ALI。遗憾的是，网络药理学分析提示T. mongolicum与其他多条信号通路相关，本研究暂未涉及其他信号通路的验证。这将是本课题组后续研究的重要任务。尽管本研究存在局限性，但揭示了TMG治疗肺部炎症潜在分子机制，对ALI治疗策略具有实践意义，为TMG治疗ALI的研究和应用提供了基础。通过KEGG分析表明，T. mongolicum可能与癌症、糖尿病、乙型肝炎等多条信号通路有关，为TMG治疗这些疾病的研究提供了相关理论基础。

作者贡献度说明：

欧丽萍：数据管理、正式分析、方法论、验证、可视化、软件、初稿写作；陈良琪：调查、验证、软件；顾若琪：调查、方法论；周桂英：概念化、软件；张宝芳：资金获取、可视化；张权：稿件修改、监督、资金获取、项目管理、提供资源。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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