基于网络药理学和体内实验探讨萝芙木对溃疡性结肠炎的治疗作用及分子机制

Identification of the therapeutic role and potential mechanism of Rauvolfia verticillata in ulcerative colitis through network pharmacology and experimental validation

摘要

目的 探究萝芙木在溃疡性结肠炎中的作用及潜在分子机制。 方法 利用HERB数据库和相关文献对萝芙木的活性成分进行筛选，并确定其潜在靶点。从GeneCards数据库获得与溃疡性结肠炎相关的靶点。随后构建成分‑靶点网络，并通过Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析探究萝芙木治疗溃疡性结肠炎的潜在机制。此外，利用葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型评估萝芙木治疗溃疡性结肠炎的疗效和机制。 结果 本研究共筛选出26个萝芙木治疗溃疡性结肠炎的潜在靶点。成分‑靶点网络分析表明，果胶可能是治疗溃疡性结肠炎的关键成分。功能富集分析显示萝芙木治疗溃疡性结肠炎与JAK激酶（Janus kinase，JAK）‑信号传导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）信号通路密切相关。体内实验结果表明，萝芙木果胶可以减轻DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的临床症状（如疾病活动指数、结肠长度和病理变化），并降低肿瘤坏死因子‑α（tumor necrosis factor‑α，TNF‑α）、白细胞介素1β（interleukin‑1β，IL‑1β）和白细胞介素6（interleukin‑6，IL‑6）的表达水平（P<0.05）。此外，萝芙木果胶可以使JAK‑STAT信号通路中的JAK2和STAT3表达下调（P<0.05）。 结论 萝芙木尤其是其果胶成分可能通过调节JAK‑STAT信号通路对溃疡性结肠炎产生治疗作用，本研究旨在为萝芙木在溃疡性结肠炎中的应用提供理论基础。

Abstract

Objective To determine the role of Rauvolfia verticillata in treating ulcerative colitis and the underlying mechanism. Methods The active components of Rauvolfia verticillata were screened using the HERB database and relevant literature， and its potential targets were identified. The ulcerative colitis‑related targets were obtained from the GeneCards database. Subsequently， a component‑target network was constructed， and the Gene Ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathways were analyzed to investigate the potential mechanism of Rauvolfia verticillata in treating ulcerative colitis. Additionally， mice with dextran sulfate sodium （DSS）‑induced ulcerative colitis were utilized to evaluate the therapeutic effects and mechanism of Rauvolfia verticillata treating ulcerative colitis. Results A total of 26 potential targets of Rauvolfia verticillata in ulcerative colitis were identified. The component‑target network analysis suggested that pectin may serve as a key component in ulcerative colitis treatment. The functional enrichment analysis indicated a strong association between the therapeutic effects of Rauvolfia verticillata on ulcerative colitis and the Janus kinase （JAK）‑signal transducer and activator of transcription （STAT） signaling pathway. In vivo experimental results demonstrated the effectiveness of Rauvolfia verticillata pectin in ameliorating clinical symptoms （e.g. disease activity index， colonic length， and pathological changes） and the reduction of tumor necrosis factor‑α （TNF‑α）， interleukin‑1β （IL‑1β）， and interleukin‑6 （IL‑6） expressions in mice with DSS‑induced ulcerative colitis （P<0.05）. Moreover， Rauvolfia verticillata pectin could downregulate JAK2 and STAT3 expressions within the JAK‑STAT signaling pathway（P<0.05）. Conclusions Rauvolfia verticillata， particularly its pectin， might exert a therapeutic effect on ulcerative colitis by modulating the JAK‑STAT signaling pathway， thereby providing an experimental foundation for the application of Rauvolfia verticillata in ulcerative colitis treatment.

Graphical abstract

关键词

萝芙木 / 溃疡性结肠炎 / 治疗效果 / 分子机制 / 网络药理学 / 体内实验

Key words

Rauvolfia verticillata / Ulcerative colitis / Therapeutic effect / Molecular mechanism / Network pharmacology / In vivo experiment

溃疡性结肠炎是一种慢性、炎症性疾病，主要影响结肠黏膜，引起肠道持续性炎症反应。溃疡性结肠炎的病因尚不明确，可能与遗传、免疫功能异常、环境因素以及肠道菌群失衡等因素密切相关^［1，2］。溃疡性结肠炎患者通常会出现腹痛、腹泻、便血和贫血等症状，严重影响其生活质量。此外长期控制不佳的溃疡性结肠炎可导致各种并发症，甚至增加恶化为结直肠癌的风险^［3］。目前，溃疡性结肠炎的治疗主要包括药物和手术治疗。常用药物包括氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂和生物制剂^［4，5］。然而，现有的治疗方法存在一定的局限性。部分药物疗效有限，长期使用免疫和生物制剂可能会增加不良反应的风险。因此，有必要研究新的治疗方法和药物以改善溃疡性结肠炎患者的健康状况。

传统中药作为一种相对安全的治疗方式，可成为对常规药物治疗反应不佳或不能耐受常规药物治疗的溃疡性结肠炎患者的一种替代性选择^［6］。此外，研究中药的有效成分和作用机制可为溃疡性结肠炎的病因学提供有价值的见解，并有助于识别其潜在的治疗靶点和药物。多种中药已被证实含有具有抗炎、抗氧化、免疫调节等作用的活性成分，对溃疡性结肠炎具有特定的治疗作用^［7，8］。更重要的是某些中药可通过调节肠道菌群、调节免疫反应、增强肠黏膜屏障功能等机制治疗溃疡性结肠炎^［9，10］。因此，探讨中药对溃疡性结肠炎的治疗价值具有重要的临床和科学意义。

萝芙木是我国常见的夹竹桃科药用植物，主要分布在中国、印度和马来西亚。萝芙木的根、叶、枝富含多种生物活性化合物，被广泛应用于药物研究。研究发现，萝芙木含有一系列吲哚生物碱（如蛇根精、育亨宾、利血平和阿吗灵等）、果胶多糖和高挥发性化合物^{［11‑14］}。本研究团队前期研究显示萝芙木果胶多糖可通过调控丝裂原活化蛋白激酶（mitogen‑activated protein kinase，MAPK）/核转录因子κB（nuclear factor κB，NF‑κB）通路治疗溃疡性结肠炎^{［13，15］}。然而，目前对萝芙木治疗溃疡性结肠炎的具体作用途径和机制仍不清楚。因此，需要进一步的研究来阐明其具体的作用机制。

网络药理学作为一种新兴的研究方法，已被广泛应用于研究中药治疗作用的分子机制^{［16，17］}。网络药理学可通过分析药物成分与生物分子之间的相互作用网络，阐明药物作用机制^{［18‑20］}。为了更全面地了解萝芙木治疗溃疡性结肠炎的作用机制和疗效，本研究舍弃传统药理学“先分离后鉴定”的研究方法，而是采用网络药理学对萝芙木核心成分、靶点和调控机制进行预测和分析。随后，利用葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型对预测结果进行验证，以评估萝芙木对溃疡性结肠炎的疗效。本研究旨在加深对萝芙木治疗溃疡性结肠炎疗效的分子机制的理解，促进新型药物的开发，增强现有疗法，并为患者提供更有效的治疗选择。

1 材料与方法

1.1 萝芙木有效成分及靶点的鉴定与筛选

通过HERB数据库（http：//herb.ac.cn/）和文献检索萝芙木的活性成分。然后通过HERB数据库预测活性成分相关靶点，并通过UniProt数据库（https：//www.uniprot.org）将靶点名称转换为基因名称。

1.2 疾病相关靶点的筛选

利用GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）检索"ulcerative colitis"，物种选择"Homo species"，收集溃疡性结肠炎相关的靶点。在获得靶点后，通过UniProt数据库将靶蛋白名称转换为标准的基因名称。

1.3 潜在治疗靶点的筛选及蛋白相互作用网络分析

通过Venny 2.1（http：//liuxiaoyuyuan.cn/）在线软件将萝芙木相关靶点与疾病相关靶点取交集，以确定萝芙木治疗疾病的潜在靶点。随后，将潜在的治疗靶点输入STRING数据库（https：//string-db.org/），构建蛋白质相互作用（protein‑protein interaction，PPI）网络。最后，使用Cytoscape软件对构建的PPI网络进行可视化。

1.4 功能富集分析

利用DAVID数据库（http：//david.abcc.ncifcrf.gov）和KOBAS数据库（https：//www.biostars.org/p/200126/）检索相关基因功能。通过R包进行Gene Ontology（GO）功能富集分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析探究萝芙木治疗溃疡性结肠炎的潜在分子机制。

1.5 成分‑靶点和靶点‑通路网络构建

利用Cytoscape软件构建成分‑靶点网络和靶点‑通路网络，识别核心成分和通路。节点代表中药成分、靶点或者通路，而节点之间的连线代表它们之间的相互作用。节点的度值表示与节点相连的边的数量，是衡量节点在网络中重要性的重要指标，以最高的度值确定节点的核心成分或者通路。

1.6 动物实验

1.6.1 DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型构建及药物干预

本研究所使用的BALB/C小鼠（6~8周龄，体重18~22 g）购自常州卡文斯实验动物有限公司。BALB/C小鼠适应性饲养1周，所有实验程序严格按照国际实验动物评估和认可委员《实验动物的管理和使用》指南进行。小鼠随机分为6组，每组9只，分为正常对照（Control）组、DSS组、DSS+萝芙木（Rauvolfia verticillata，Rau）组（50、100、200 mg/kg）和DSS+柳氮磺吡啶（sulfasalazine，SASP）组（100 mg/kg）。DSS组给予3% DSS溶液自由饮用，Control组给予纯净水，连续饮用7 d。从第8天开始，DSS+Rau组和DSS+SASP组分别给予500 μL Rau（50、100、200 mg·kg^‑1·d^‑1）和SASP（100 mg·kg^‑1·d^‑1）灌胃7 d，Control组和DSS组给予等体积蒸馏水灌胃。在实验第15天处死小鼠，收集血清和结肠。本实验方案经海南省人民医院伦理委员会批准（编号：2021‑306）。

1.6.2 疾病活动指数（disease activity index，DAI）评估

通过检测直肠出血、体重下降和粪便性状评估结肠炎的损伤程度^［21］。在建模和药物治疗的过程中，观察并记录小鼠的直肠出血、粪便稠度和体重下降情况，并对照文献［22］中描述的建立方法确定DAI评分。DAI评分通过结合粪便性状、直肠出血和体重减轻的评分计算。

1.6.3 H&E染色分析

待实验小鼠安乐死后，迅速取出结肠组织，使用预冷的PBS溶液清洗以去除残留物。随后立即在4%多聚甲醛中固定24 h，以保持组织的微观结构。固定后，采用常规石蜡包埋法包埋组织。然后使用切片机获得厚度为5 μm的切片。随后按照既定方案进行H&E染色。最后，由经过专业培训的病理学家使用光学显微镜观察切片并评估结肠组织的病理变化。

1.6.4 ELISA分析炎症因子

实验小鼠被人道处死后，从眼眶取眼球血。血液于4 ℃静置2 h， 4 000 r/min离心5 min，取上清液。然后采用ELISA试剂盒检测上清液中白细胞介素1β（interleukin‑1β，IL‑1β）、肿瘤坏死因子‑α（tumor necrosis factor‑α，TNF‑α）和白细胞介素6（interleukin‑6，IL‑6）水平。

1.6.5 qRT‑PCR分析

按照TRIzol提取方法提取结肠组织总RNA。采用NanoDrop™ 2000分光光度计检测RNA的浓度和质量。然后，用NovoScript^®Plus 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix逆转录高质量RNA。采用美国ABI公司的ABI 7500实时荧光定量PCR系统（SYBR high‑sensitivity qPCR SuperMix）进行qRT‑PCR分析。内部对照为GAPDH。qRT‑PCR引物见表1。

1.6.6 Western blot分析

使用含有RIPA缓冲液和蛋白酶抑制剂的裂解液提取小鼠结肠组织蛋白，采用BCA法对提取的总蛋白进行定量。通过10% SDS‑PAGE分离蛋白后，利用半干转膜法将蛋白转移至PVDF膜上。然后在室温下用5%脱脂奶粉将PVDF膜封闭2 h。随后，添加一抗并将膜在4℃孵育过夜。用TBST洗涤3次，与第二抗体孵育，再用TBST洗涤3次。将ECL发光液接种到膜上，然后在E‑BLOT系统中进行成像。

1.7 统计学处理

本研究使用GraphPad Prism 9.0进行数据分析。计量资料以\overline{x}\pm s表示，组间差异采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 萝芙木有效成分及靶点的筛选

从HERB数据库和文献中共鉴定出20种萝芙木的成分。剔除重叠成分和无对应靶点成分后，筛选出10个活性成分和471个靶点进行后续分析，见表2。

2.2 萝芙木治疗溃疡性结肠炎潜在靶点的鉴定及PPI分析

通过检索GeneCards数据库，共获得129个溃疡性结肠炎相关的靶点（图1A）。Venn图显示萝芙木和溃疡性结肠炎共有26个共同靶点。此外，在排除与共同靶点不相交的成分后，得到7种成分（果胶、利血平、育亨宾、阿吗碱、紫草素、阿吗灵和哈曼）以供进一步研究。基于这26个共同靶点构建PPI网络。PPI网络中度值最高的节点依次为AKT1（degree=21）、STAT3（degree=20）和JAK2（degree=18），提示其可能在溃疡性结肠炎的病理过程中发挥重要作用（图1B）。

2.3 成分‑靶点网络分析

为了探究萝芙木治疗疾病的核心成分，基于7种活性成分和26个共同靶点，构建成分‑靶点网络，该网络包含35个节点（成分7个，共同靶点26个，草药1个，疾病1个）。在以上成分中，果胶（degree=16）的度值最高，随后是育亨宾（degree=7）、利血平（degree=7）、阿吗碱（degree=5）、阿吗灵（degree=4）、紫草素（degree=4）和哈曼（degree=4）。上述结果表明果胶可能是治疗溃疡性结肠炎的关键成分，见图2。

2.4 GO和KEGG分析

通过GO和KEGG分析进一步探究萝芙木治疗溃疡性结肠炎的潜在机制。生物过程（biological process，BP）分析显示共同靶点主要富集在平滑肌细胞增殖（smooth muscle cell proliferation）、肽调节（peptide regulation）、平滑肌细胞增殖的调控（regulation of smooth muscle cell proliferation）等方面。对于细胞组分（cellular component，CC），靶点主要与转录调控复合体（transcription regulator complex）、NF-κB p50/p65复合体和免疫突触（immunological synapse）等相关。在分子功能（molecular function，MF）方面，以上靶点与四吡咯结合的调控（regulation of tetrapyrrole binding）、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）和前列腺素内过氧化物合酶活性（prostaglandin-endoperoxide synthase activity）等相关（图3A）。此外，KEGG分析显示，以上靶点主要富集在与溃疡性结肠炎密切相关的JAK-STAT信号通路中（图3B）。

2.5 靶点‑通路网络分析

通过构建靶点‑通路网络进一步阐明萝芙木治疗溃疡性结肠炎的分子机制。靶点‑通路网络涉及30个靶点，包括20个靶点和10个信号通路。结合PPI分析（JAK2和STAT3具有较高的度值）、成分‑靶点网络（果胶为核心成分）、KEGG结果（JAK‑STAT通路为与疾病密切的主要富集通路）和靶点‑通路网络（STAT3和JAK2参与JAK‑STAT通路），可推测萝芙木尤其是其成分果胶可能通过调控STAT3和JAK2的表达影响JAK‑STAT信号通路，从而在治疗溃疡性结肠炎中发挥重要作用，见图4。

2.6 萝芙木果胶可改善DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的临床症状

为评估萝芙木果胶治疗溃疡性结肠炎的疗效，使用DSS诱导小鼠作为实验模型，研究萝芙木果胶对疾病相关临床指标（DAI、结肠长度和病理变化）和炎症水平的影响。与Control组相比，DSS组小鼠的DAI指数明显增加（P<0.001），从而证实模型建立成功。从第8天开始，与DSS组相比，萝芙木果胶治疗组（DSS+Rau）的DAI指数明显降低（P<0.001），表明萝芙木果胶对溃疡性结肠炎具有潜在的治疗作用，见图5A。与DSS组相比，萝芙木果胶治疗组结肠长度明显增加（P<0.05），见图5B。H&E染色观察各组小鼠结肠组织病理变化。与Control组相比，DSS组结肠黏膜上皮变性，炎性细胞浸润，杯状细胞缺失，黏膜层与固有层分离，黏膜下水肿，隐窝损伤。而萝芙木果胶治疗组结肠结构相对完整，结肠黏膜仅有少量炎性细胞浸润，黏膜分离较轻，隐窝结构较完整，见图5C。上述结果表明，萝芙木果胶对DSS诱导的溃疡性结肠炎具有明显的改善作用。

此外，本课题组还检测了小鼠血液样本中的炎症标志物。与Control组相比，DSS组的TNF‑α、IL‑1β和IL‑6水平明显升高（P<0.001）。与DSS组相比，萝芙木果胶治疗组小鼠的血清TNF‑α、IL‑1β和IL‑6水平明显降低（P<0.05），见图6A~C。

2.7 萝芙木果胶通过JAK‑STAT信号通路发挥治疗作用

为了探究萝芙木果胶是否通过调控JAK‑STAT信号通路上的关键基因来治疗疾病的分子机制，本研究首先通过qRT‑PCR分析了JAK2、STAT3、p21和Bcl2的mRNA表达水平。与Control组相比，DSS组中JAK2、STAT3、p21和Bcl2的mRNA表达水平明显升高（P<0.001）。与DSS组相比，萝芙木果胶治疗组JAK2、STAT3、p21和Bcl2的mRNA表达水平明显降低（P<0.01），见图7A。此外，进一步通过Western blot检测JAK2、STAT3、p21和Bcl2的蛋白表达水平。与Control组相比，DSS组的JAK2、STAT3、p21和Bcl2的蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。萝芙木果胶治疗组JAK2、STAT3、p21和Bcl2的蛋白表达水平明显低于DSS组（P<0.05），见图7B、C。上述结果表明，萝芙木果胶可能通过抑制JAK‑STAT信号通路中JAK2和STAT3的表达治疗溃疡性结肠炎。

3 讨论

溃疡性结肠炎是一种病因不明的炎症性疾病，目前的治疗方法效果有限。萝芙木是一种具有抗炎特性的植物，但其在溃疡性结肠炎治疗中的作用和潜在机制尚不清楚。近年来，网络药理学通过整合多个数据库和文献资源成为研究药物作用机制的重要工具^{［23，24］}。该方法有助于识别药物的活性成分和靶点，揭示它们在疾病中的作用路径。本研究的目的是探讨萝芙木对溃疡性结肠炎的治疗潜力。为此，本研究采用网络药理学和体内实验相结合的方法，研究萝芙木治疗溃疡性结肠炎的核心成分、靶点、疗效和作用机制。本研究结果表明，萝芙木中的果胶多糖可能通过下调JAK‑STAT信号通路中JAK2和STAT3的表达来有效治疗溃疡性结肠炎。

本研究采用网络药理学方法研究了萝芙木的成分及其对溃疡性结肠炎的潜在治疗靶点。结果表明，萝芙木含有26个可能对溃疡性结肠炎治疗产生影响的潜在靶点。后续的成分‑靶点网络分析显示，果胶是萝芙木治疗溃疡性结肠炎的潜在关键有效成分。这一发现与之前研究的结果一致。例如，Fan等^［25］证明不同程度的酯化果胶对溃疡性结肠炎小鼠具有预防作用；Tao等^［26］揭示，硒化后的苹果果胶可以通过下调血清中IL‑6和TNF‑α的含量对DSS小鼠结肠炎产生治疗作用。另一项研究表明，菝葜中提取的果胶可以通过抑制galectin‑3/NLRP3炎症小体通路来改善溃疡性结肠炎症状^［27］。上述发现进一步证实果胶在溃疡性结肠炎治疗中的关键作用。因此，本研究提供了新的理论支持和实验证据，以加强对萝芙木及其主要成分果胶在溃疡性结肠炎治疗中的作用的理解。

功能富集分析进一步发现萝芙木治疗溃疡性结肠炎与JAK‑STAT信号通路强相关。JAK由JAK1、JAK2、JAK3和酪氨酸激酶2组成，是一组介导炎症反应的酪氨酸蛋白激酶。当细胞因子（如IL‑6）与细胞表面受体结合时，JAKS被激活，从而磷酸化STAT蛋白。这导致STAT蛋白从受体中释放，随后二聚化并转位到细胞核，从而导致一系列促炎介质的基因转录^{［28‑30］}。JAK‑STAT信号通路在炎症性肠病的发生发展中起着至关重要的调控作用^［31］。该通路调控细胞增殖、凋亡、分化和炎症反应，与免疫细胞活化和炎症介质释放密切相关^{［32，33］}。例如，Cordes等^［34］发现了溃疡性结肠炎患者和克罗恩病患者之间JAK‑STAT信号通路调节的差异。大量研究强调了JAK‑STAT信号通路在炎症性肠病发病机制中的关键作用，以及JAK抑制剂对溃疡性结肠炎的治疗潜力^{［35，36］}。此外，中药治疗溃疡性结肠炎的机制研究也与本研究的发现一致。Zheng等^［37］在综合分析中医治疗溃疡性结肠炎的机制时强调，中医影响多种信号通路，JAK‑STAT通路是关键靶点。结果表明，萝芙木可能通过调控JAK‑STAT信号通路发挥其治疗作用。

体内实验进一步表明，萝芙木中的果胶对改善DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的临床症状（包括结肠长度、DAI和病理改变）和降低炎症因子（如TNF‑α、IL‑1β和IL‑6）的水平有明显影响。此外，萝芙木果胶对溃疡性结肠炎的治疗作用归因于其能抑制JAK‑STAT通路中JAK2和STAT3的表达。早期的研究为各种药物和中草药对溃疡性结肠炎的治疗作用提供了证据。例如，Jiang等^［38］证明了双氢青蒿素下调JAK2和STAT3的表达，从而有助于其抗炎机制。此外，紫苏醇通过调节JAK2/STAT3信号通路缓解DSS引起的溃疡性结肠炎^［39］。Yu等^［40］发现清肠栓通过JAK2/STAT3通路在溃疡性结肠炎中发挥抗炎作用。Tang等^［41］研究表明，丁酸可以通过抑制JAK2/STAT3/SOCS1通路来增加EHLJ7对溃疡性结肠炎的疗效。黄连解毒汤通过下调JAK‑STAT通路中JAK2和STAT3的表达来缓解DSS诱导的溃疡性结肠炎^［42］。此外，He等^［43］报道瑞香素可通过抑制JAK2/STAT3通路减轻溃疡性结肠炎肠道炎症和细胞凋亡。

尽管先前的研究已揭示萝芙木在治疗溃疡性结肠炎方面可能涉及MAPK/NF‑κB信号通路的调节机制，但本研究融合网络药理学与体内实验，发现萝芙木可能通过抑制JAK‑STAT信号通路中的核心分子JAK2与STAT3的表达水平，发挥其抗溃疡性结肠炎的作用，也为溃疡性结肠炎的治疗提供了新的视角和潜在靶点。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，由于本研究在动物模型上进行，因此有必要在人类受试者中进一步验证其有效性和安全性。其次，尽管本研究发现了萝芙木果胶对JAK‑STAT通路的调节作用，但具体的分子机制仍不清楚。因此，需要进一步的研究来阐明其详细的机制。

综上所述，本研究的结果表明，萝芙木（特别是其活性成分‑果胶）可能通过调节JAK‑STAT信号通路治疗溃疡性结肠炎。

作者贡献度说明：

吴海东：文献调查、网络药理学分析、实验及数据整理；郭一凡：部分实验；陈旭永、王柳丹：部分实验和统计学分析；苗新普：课题构思、写作指导与修改、文稿审核及校对、经费支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(82160104)

海南省重点研发计划项目(ZDYF2022SHFZ099)

海南省高等学校科学研究项目重点课题(Hnky2021ZD‑13)

海南省研究生创新科研课题(Qhys2023‑477)