组蛋白H3表达对重金属镉暴露肝癌细胞氧化应激性损伤的影响

Effect of histone H3 expression on oxidative stress injury in hepatocellular carcinoma cells exposed to heavy metal cadmium

摘要

目的 探讨组蛋白H3修饰对镉暴露微环境中肝癌细胞Hep3B氧化应激损伤的影响。 方法 将Hep3B分为对照组和20 ng/mL氯化镉（CdCl₂）染毒组，培养28 d。流式细胞术检测培养7、14、21、28 d时间点各组氧化应激［活性氧（reactive oxygen species，ROS）］及细胞凋亡情况；免疫荧光技术测定不同时间点各组组蛋白H3乙酰化的表达情况；划痕及CCK‑8检验测定不同时间点各组细胞活性及增殖能力；使用组蛋白H3乙酰化抑制剂对染毒组7、14、21 d干预48 h。 结果 镉暴露导致Hep3B细胞形态萎缩、触角及碎片增加；细胞迁移愈合速度变慢；随着镉暴露时间延长，7、14、21 d染毒组ROS水平、凋亡水平较对照组明显升高（P<0.05）；28 d染毒组ROS、凋亡水平与对照组差异无统计学意义（P>0.05）；与对照组相比，7、14 d染毒组组蛋白H3乙酰化表达水平随干预时间延长明显升高（P<0.01），21、28 d染毒组组蛋白H3乙酰化表达趋向稳态（P<0.01）；7、14、21 d抑制剂组细胞凋亡水平与ROS水平较染毒组明显下降（P<0.01）。 结论 低剂量镉暴露可在早期诱导Hep3B肝癌细胞氧化应激性损伤导致凋亡，抑制肝癌细胞的抗氧化应激能力影响其细胞活性；长期低剂量镉暴露，Hep3B肝癌细胞通过自身调节增强耐受，适应有害环境维持稳态；组蛋白H3乙酰化参与Hep3B肝癌细胞氧化应激性损伤与凋亡。

Abstract

Objective To investigate the effect of histone H3 modification on oxidative stress damage in hepatocellular carcinoma cells Hep3B in a cadmium‑exposed microenvironment. Methods Hep3B were divided into a control group and a 20 ng/mL cadmium chloride （CdCl₂） stained group， and cultured for 28 days. Flow cytometry was used to detect oxidative stress （reactive oxygen species，ROS） and apoptosis in each group at the time points of 7， 14， 21， and 28 day of culture； immunofluorescence was used to determine the expression of histone H3 acetylation in each group at different time points； scratches and CCK‑8 were used to determine the activity and proliferative capacity of cells in each group at different time points； and an inhibitor of histone H3 acetylation was used to intervene on the stained group at the 7， 14， and 21 day for 48 hours. Results Cadmium exposure led to morphological atrophy， increased tentacle and fragmentation of Hep3B cells； cell migration and healing were slowed down； With prolonged cadmium exposure， ROS and apoptosis levels in the stained group increased significantly compared to those in the control group at the 7， 14， and 21 day （P<0.05）； there were no significant differences between the ROS and apoptosis levels in the stained group at 28 day and those in the control group （P>0.05）； Compared to the control groups， the expression level of protein H3 acetylation in the stained group at the 7 and 14 day significantly increased with the prolongation of the intervention time （P<0.01）， and the expression of protein H3 acetylation in the stained group at the 21 and 28 day tended to be in a steady state （P<0.01）； and the levels of apoptosis and ROS at the 7， 14， and 21 day inhibitor groups were decreased compared to those in the stained group （P<0.01）. Conclusion Low‑dose cadmium exposure can induce oxidative stress injury leading to apoptosis in Hep3B hepatocellular carcinoma cells at an early stage， and inhibit the anti‑oxidative stress ability of hepatocellular carcinoma cells affecting their cellular activity； in long‑term low‑dose cadmium exposure， Hep3B hepatocellular carcinoma cells can enhance tolerance and adapt to the hazardous environment to maintain homeostasis through self‑regulation； histone H3 acetylation is involved in oxidative stress injury and apoptosis of Hep3B hepatocellular carcinoma cells.

Graphical abstract

关键词

镉 / Hep3B细胞 / 氧化应激 / 组蛋白 / 乙酰化

Key words

Cadmium / Hep3B cells / Oxidative stress / Histones / Acetylation

镉是一种生物蓄积性强、毒性持久、具有“三致”作用的剧毒元素环境污染物，对人类和动物健康构成极大危害^［1］，过量摄入会对肝脏、肾脏、肺部、骨骼、生殖器官，免疫系统、心血管系统等产生毒性效应^［2，3］。人体中镉离子代谢半衰期长，易引起急慢性中毒、致畸、致癌等毒性作用。肝脏为急慢性镉中毒的主要靶器官^［4］，重金属离子过度积累将导致肝功能异常和肝纤维化。目前研究镉暴露导致肝癌的模型常以高剂量镉暴露（远高于环境中重金属实际暴露浓度）为基础，难以真实反映环境中镉暴露“低剂量、长期、蓄积性”的特点，不足以评估镉暴露在体内长期低毒效应对人体的危害。重金属暴露诱发肝癌细胞的氧化应激、炎症、凋亡、代谢异常等；能量代谢与氧化应激反应异常时，打破肿瘤微环境稳态^［5，6］。肿瘤发生、发展与其肿瘤微环境密切相关，肿瘤细胞可以通过细胞代谢影响肿瘤微环境中代谢物以调节释放细胞外信号，促进肿瘤血管生成、诱导外周免疫耐受性来调节微环境调控肿瘤细胞生长^［7‑9］。然而，慢性镉暴露肿瘤微环境能量失衡的机制尚不明确。本研究将构建低剂量镉暴露的肝癌细胞模型，初步探讨低剂量、长期、蓄积性镉暴露肝癌微环境中组蛋白H3修饰调控肝癌细胞对氧化应激性损伤的影响，阐释慢性镉暴露对肝癌肿瘤抗氧化应激性损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 设备及试剂

本研究使用的主要设备：细胞培养箱（Thermo3111，美国）；酶标仪（BioTek Synergy H1，美国）；倒置显微镜（DMI8型，Leica）；流式细胞仪（CyFlow^® CuBe6型，Sysmex Partec GmBH，美国）。

肝癌细胞株Hep3B购于中国科学院上海细胞库（细胞编号：SCSP‑5045）。MEM基础培养基（gibco，美国）；胎牛血清FBS（ViVa Cell，中国）；青霉素链霉素溶液（索莱宝solarbio，中国）；胰蛋白酶（索莱宝solarbio，中国）；CCK‑8细胞增殖检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；Annexin V‑FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（联科，中国）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒（abcam，英国）；分析纯氯化镉（中国）；组蛋白乙酰化抑制剂（MCE，美国）。

1.2 CCK‑8 检测及细胞形态

按CCK‑8试剂盒操作说明检测细胞活力。Hep3B细胞以4×10³ cells·100 μL^‑1·孔^‑1的密度接种于96孔板中，加入含不同浓度的（25 000、10 000、5 000、2 500、1 000、500、100 ng/mL）氯化镉（CdCl₂） MEM培养基培养24 h，酶标仪测量450 nm处吸光度值，Hep3B细胞在MEM‑CdCl₂培养基中连续培养28 d，分别于7、14、21、28 d以倒置显微镜拍照记录细胞形态。

1.3 细胞培养和暴露

肝癌细胞株Hep3B在5% CO₂、37 ℃环境下培养。对照组使用MEM培养基培养，染毒组在含CdCl₂（20 ng/mL）的MEM培养基中持续暴露28 d。分别于7、14、21、28 d收集细胞进行相关指标检测。

1.4 细胞划痕

Hep3B细胞以2×10⁶ cells·2 mL^‑1·孔^‑1加入6孔板中，37 ℃培养箱中孵育过夜后在各孔板细胞生长的相同位置划垂直直线，于0、24、48、72 h测量细胞迁移距离。

1.5 细胞凋亡

按Annexin V‑FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒操作说明检测凋亡情况。将Hep3B细胞以1×10⁶ cells·2 mL^‑1·孔^‑1密度接种于6孔板，使用20 ng/mL MEM‑CdCl₂培养基处理。于7、14、21、28 d收集细胞，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 细胞ROS水平

依据DCFH‑DA荧光试剂盒使用说明，测量细胞内ROS的产生。

1.7 组蛋白H3乙酰化表达情况

Hep3B细胞以1×10⁵ cells·1 mL^‑1·孔^‑1密度接种于12孔板中，加入基础培养细胞作为对照组，MEM‑CdCl₂培养基为染毒组，检测7、14、21、28 d细胞内H3组蛋白H3表达。固定Hep3B细胞0.1% Triton X‑100（PBS配制）室温通透3 min，加入5%的BSA封闭液，一抗4 ℃孵育过夜。加入荧光二抗稀释液，37 ℃孵育1 h，PBS清洗孔板3次，每孔加入300 μL 1×PBS后拍照。

1.8 组蛋白H3乙酰化抑制剂干预

Hep3B细胞以1×10⁶ cells·1 mL^‑1·孔^‑1密度接种于6孔板中，以基础培养基为对照组，MEM‑ CdCl₂培养基为染毒组。分别于7、14、21 d应用组蛋白H3乙酰化抑制剂（DCH36_06，MCE）对染毒组干预48 h，浓度为60 nmol/L。收集细胞使用流式细胞仪检测细胞凋亡与ROS变化情况。

1.9 统计学处理

使用SPSS 26.0软件进行统计分析，计量资料以\overline{x}\pm s表示。两组间比较采用t检验，3组及以上采用单因素方差分析进行分析。P<0.05为差异具有统计学意义。结果重复3次。

2 结果

2.1 重金属镉浓度抑制Hep3B细胞活力、最优干预浓度及细胞形态变化

本研究发现重金属镉暴露微环境对Hep3B细胞活力呈浓度依赖性递降，不同镉浓度染毒组差异具有统计学意义（P<0.05），见图1。IC₅₀浓度值为607 ng/mL，而低于500 ng/mL浓度时，Hep3B细胞活力达65%以上。本实验目的在于观察低剂量镉暴露对Hep3B细胞的影响及慢性毒性效应，干预浓度既满足诱导Hep3B细胞的形态、凋亡、氧化应激等变化，又要确保细胞在28 d生长、传代，因此选取20 ng/mL浓度用于构建慢性低剂量镉暴露模型。对照组正常培养28 d，细胞呈多边形，胞体饱满；染毒组7 d后，无明显变化；14 d后，可见少部分细胞触角变细、变长，死细胞碎片增多；21 d可见部分细胞萎缩成圆形，有少量细胞碎片堆积，细胞触角变长、增多；28 d后，细胞形态可见大量细胞触角变长、增多，细胞胞体萎缩严重。随着暴露时间增加，细胞形态具有明显差异，提示慢性低剂量镉暴露微环境可诱导肝癌细胞损伤，见图2。

2.2 重金属镉对Hep3B细胞迁移能力的影响

本研究通过划痕试验观察不同镉浓度对Hep3B细胞迁移的影响，见图3。对照组在培养72 h后其划痕趋向愈合，10 ng/mL CdCl₂染毒组划痕愈合情况与其相似；100 ng/mL试验组划痕愈合程度弱于10 ng/mL组，其中1 mg/mL染毒组细胞迁移速度最慢。该结果显示，染毒组划痕迁移愈合速度与镉浓度呈负相关；随着镉浓度的增加，划痕迁移速度减慢，呈浓度相关性，提示高浓度镉暴露可抑制Hep3B细胞修复、迁移能力。

2.3 重金属镉对Hep3B细胞凋亡的影响

流式细胞技术测定低剂量（20 ng/mL）细胞凋亡水平。与对照组相比，染毒组在7、14、21 d细胞晚期凋亡率随着镉干预时间延长明显升高（P<0.01），21 d凋亡率最高。染毒组28 d细胞凋亡率下降至对照组水平维持，差异无统计学意义（P>0.05），见表1、图4。实验表明低剂量镉暴露微环境早期能促进肝癌细胞的凋亡，但长期暴露可使肝癌细胞的耐受性加强，稳定性恢复，细胞凋亡趋向缓和或正常。

2.4 重金属镉暴露对Hep3B细胞ROS的影响

应用DCFH‑DA荧光探针检测细胞ROS表达水平。Hep3B细胞暴露于20 ng/mL CdCl₂持续培养，染毒组在7、14、21 d内细胞ROS积累水平明显高于对照组（P<0.05）；28 d对照组与染毒组ROS表达水平相近，差异无统计学意义（P>0.05），见表2、图5。低剂量镉暴露在早期能导致肝癌细胞氧化应激性损伤肝癌细胞ROS表达上升，长期持续暴露导致肝癌细胞氧化应激性损伤耐受性增强，细胞ROS表达趋向正常。

2.5 镉暴露对Hep3B细胞组蛋白H3乙酰化表达的影响

应用免疫荧光技术检测组蛋白H3乙酰化在细胞内表达。结果发现，7、14、21、28 d染毒组组蛋白H3表达明显高于对照组（P<0.01）；在染毒组7、14、21、28 d中，组蛋白H3在14 d表达最高，逐渐降低后趋向平稳。提示低剂量镉暴露可明显促进肝癌细胞H3乙酰化蛋白表达，增强细胞代谢水平，见表3、图6。

2.6 组蛋白乙酰化对Hep3B细胞凋亡/ROS的影响

采用 Annexin V‑FITC/PI法双染色检测使用组蛋白乙酰化抑制剂后，7、14、28 d染毒组Hep3B细胞凋亡水平与ROS水平，见表4、5。7、14、21 d抑制剂组与对照组相比，抑制剂组细胞凋亡率明显下降（P<0.01），以上结果提示在慢性镉暴露的环境下，组蛋白H3乙酰化参与Hep3B细胞凋亡与ROS的发生，见图7。

3 讨论

重金属环境污染已成为当前影响人类健康的一个重要危险因素。重金属镉是农业领域的主要污染物^［10］，普遍存在于大气、水体和土壤中^［3］。镉因具有持久性、生物毒性和生物累积性的特点，使其生物暴露存在极大的潜在健康风险^{［11，12］}。慢性镉环境暴露会促进肝细胞炎症、组织损伤，诱发晚期肝纤维化和肝癌^［13］。水溶性镉暴露可促进肝细胞氧化应激、自噬和线粒体功能障碍，诱导肝细胞凋亡^{［14，15］}。近年来的研究逐渐揭示，镉暴露不仅诱导氧化应激损伤，同时影响组蛋白翻译后修饰^［16］，特别是乙酰化、甲基化等修饰。组蛋白的修饰，如乙酰化，已被证明与基因表达的激活密切相关，可引起表观遗传修饰，氧化应激及代谢重编程^［17］。在慢性低剂量镉暴露的情况下，组蛋白H3修饰累积可能导致肿瘤微环境的变化，加速肝癌的发生与进展。因此，镉暴露通过影响组蛋白的翻译后修饰，改变细胞的表观遗传状态，为肝癌的发生提供了新的分子机制视角^［18］。依据此，本研究构建了慢性低剂量镉暴露肝癌细胞模型，旨在探索慢性镉暴露对肝癌细胞的增殖、氧化损伤、能量代谢与组蛋白修饰等影响，以明确镉暴露对肝癌肿瘤微环境的调控作用。

低毒长时间的镉暴露，因细胞中大量蓄积镉离子，导致镉离子超载，细胞无法通过正常的离子代谢途径清除，导致氧化应激性损伤，致使细胞内的ROS升高，促使大量细胞凋亡。细胞形态由胞体饱满、多边形状变成细胞触角增多、细长，伴胞体萎缩，细胞碎片增多改变；随着镉浓度的增高，细胞活性及迁移速度减慢，细胞迁移愈合速度与镉浓度呈负相关。慢性低剂量镉暴露可诱导Hep3B细胞损伤、调亡。线粒体是细胞能量代谢中心，直接参与细胞凋亡，也是镉暴露的主要细胞靶点之一^{［19，20］}。镉暴露导致明显的肝细胞线粒体功能障碍^［21］，致使肝细胞ROS生成增多，诱发肝细胞的氧化应激与炎症反应^{［22，23］}。低剂量镉暴露在早期能促进肝癌细胞ROS表达增加，并促使细胞凋亡，该研究结果与上述研究类似。然而，长期低剂量镉暴露，肝癌细胞ROS表达及凋亡率趋向正常水平，其机制可能与肿瘤细胞的自我调节或其对镉毒性的适应性，或者抑制凋亡有关^［24］。有研究表明，致癌的初始阶段，NF‑κB可能发挥肿瘤抑制因子作用，在恶性微环境中，NF‑κB激活已被证明能赋予细胞对凋亡的抵抗力^［25］。肿瘤细胞代谢与其微环境代谢变化间可相互调节，肿瘤细胞可根据微环境代谢物的可用性和细胞需求来调整能量代谢过程^［26］，但其内在调节机制，未来尚需进一步研究。研究证实，镉暴露可诱导大鼠肝细胞氧化损伤，破坏其细胞能量、氨基酸和脂肪酸代谢^［27］。低剂量镉暴露可影响肝细胞转录产物、代谢物及相关代谢途径和功能^［28］。乳酸通过塑造酸性肿瘤微环境、募集免疫细胞等为肿瘤发生提供有利条件，乙酰化进一步推动乳酸产生、循环和利用的促肿瘤发生^［29］。本研究中发现低剂量镉暴露可明显促进肝癌细胞H3乙酰化蛋白表达，增强细胞代谢活性，此结果与上述研究发现相近。肿瘤细胞代谢的可塑性是其生长和转移的决定因素^［30］。本研究模拟环境慢性镉暴露，探究代谢重编程驱动组蛋白乙酰化修饰、渐进性累积，损伤机体，重塑肿瘤微环境。组蛋白修饰参与多种疾病的进展，H3磷酸化参与小鼠卵母细胞镉诱导的生殖毒性跨代遗传^［16］同时参与肝细胞癌发病^［31］；H3乙酰化介导去甲基化的抗肝癌作用^［32］。目前重金属镉致病研究多聚焦DNA损伤、炎症等传统模型，但表观遗传调控，组蛋白以及其修饰、突变，在镉暴露致病的作用仍需深入研究。本研究聚焦代谢重编程、组蛋白修饰，结合镉暴露对肿瘤微环境代谢的影响，为肝癌发展机制研究提供了新的视角。结合本研究模型的发现，本课题组推测，低剂量镉暴露可能促使肿瘤微环境的代谢物质缺乏，促进ROS生成过多，而肿瘤细胞通过增强能量代谢来对此做出自适应。综上，本研究构建了低剂量镉暴露肝癌细胞模型，发现低剂量镉暴露可诱导肝癌细胞能量代谢异常，并促进细胞氧化应激、调亡，其机制可能与重金属镉诱导能量代谢异常、组蛋白修饰积累改变及肿瘤微环境失衡有关；组蛋白乙酰化参与慢性镉暴露所诱导的肝癌细胞凋亡与氧化应激。本研究存在一定的局限性：对于在更高剂量或更长时间镉暴露条件下，细胞能量代谢、凋亡、组蛋白修饰的机制本研究未能详细阐明，这将是课题组未来深入研究的方向。

作者贡献度说明：

苏思标：提出课题思路和进行实验指导；刘祎琳：开展相关实验并进行文章书写；梁晓乐：进行数据分析；陈骄华、李秀芳：进行图表制作和核对。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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