转录组学测序鉴定CpG ODN对牙周炎基因疫苗的免疫增强作用

Identification of the immune enhancement effect of CpG ODN on periodontitis gene vaccine by RNA sequencing

摘要

目的 通过转录组测序从分子层面分析CpG ODN佐剂增强牙周炎基因疫苗预防作用的潜在机制，并筛选出关键基因和信号通路用于后续研究。 方法 将9只4~6周雄性Sprague‑Dawley大鼠分成3组，通过鼻黏膜滴注方式对大鼠进行免疫，并于第7周处死。提取脾脏总RNA后进行RNA‑seq建库和测序，通过基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因及基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）路径富集分析筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。将筛选所得DEGs传至STRING数据库建立蛋白质‑蛋白质相互作用（protein‑protein interaction，PPI）网络图，并采用Cytoscape软件进一步绘制网络图，通过RT‑qPCR对关键基因进行验证。 结果 综合GO、KEGG、PPI筛选出Oas2、Irf7、Np4、Defa11及Camp共5个关键基因，这些候选基因可能在牙周炎基因疫苗免疫机制中起关键作用。经RT‑qPCR对关键基因验证显示，实验结果与转录组测序分析一致。 结论 实验结果与基于转录组测序分析牙周炎基因疫苗预防效果的转录组测序结果一致，并筛选出5个参与CpG ODN佐剂与牙周炎基因疫苗协同作用的关键基因，在基因水平上初步探索了牙周炎基因疫苗的免疫机制。

Abstract

Objective To analyze the potential mechanism by which CpG ODN adjuvants enhance the preventive effect of periodontitis gene vaccines at the molecular level by transcriptome sequencing and to screen out key genes and signaling pathways for follow‑up research. Methods A total of nine 4‒6 week‑old male Sprague‑Dawley rats were randomly divided into three groups. The rats were immunized by intranasal instillation， and euthanize at the 7th week. After total RNA was extracted from the spleen， RNA‑seq library construction and sequencing were performed. Gene Ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis were used to screen for differentially expressed genes （DEGs）. The screened DEGs were transferred to the STRING database to establish a protein‑protein interaction （PPI） network map， and the Cytoscape software was used to further draw the network map. RT‑qPCR was used to validate key genes. Results Based on GO， KEGG， and PPI， five key genes were screened， including Oas2， Irf 7， Np4， Defa11 and Camp. These candidate genes may play a key role in the immune mechanism of periodontitis gene vaccines. The verification of key genes by RT‑qPCR showed that the results of the experiment were consistent with the transcriptome sequencing analysis. Conclusion The results of the experiment are consistent with the transcriptome sequencing analysis of the preventive effect of periodontitis gene vaccines based on transcriptomic sequencing， and screens out five key genes involved in the synergistic effect of CpG ODN adjuvant with periodontitis gene vaccines， which provides a preliminary exploration of the immune mechanism of periodontitis genetic vaccines at the genetic level.

Graphical abstract

关键词

CpG ODN / 牙周炎 / 基因疫苗 / RNA‑seq测序

Key words

CpG ODN / Periodontitis / Genetic vaccine / RNA‑seq sequencing

牙周炎是由龈下微生物引起的炎性疾病，可通过牙周袋的形成、牙槽骨的吸收、牙齿的松动、牙齿的移位和附着丧失破坏牙周支持组织^［1］。目前研究认为微生物群失调是牙周病发病的主要原因，其中福赛斯坦纳菌、牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）、齿状密螺旋体与牙周炎密切联系，此外遗传变异、环境、饮食等因素同样会影响病情进展^［2‑4］。越来越多的研究证明牙周炎与心血管疾病、阿尔茨海默病、糖尿病、不良妊娠等疾病密切相关^［5‑8］。基于全球疾病负担研究所提供的数据，Chen等^［9］指出2019年全球约有11亿重度牙周炎患者。口腔健康意识薄弱、口腔医疗资源紧缺及社会经济发展水平不均衡进一步加重了发展中国家的牙周病流行病学负担^［10］。目前牙周炎的治疗还不能完全满足临床需要，随着基因疫苗的临床运用，牙周炎疫苗可能成为有力的辅助手段。与传统疫苗相比，基因疫苗具有成本低、安全性高的优势，并且能诱导更强的免疫反应^［11］。本课题组前期将P. gingivalis的2个毒力因子hemagglutinin‑2（HA2）和fimA protein（fimbrillin）作为目的基因成功构建了牙周炎基因疫苗pVAX1‑HA2‑fimA，但存在疫苗抗体水平低和维持时间短的问题。为了保持机体长时间、高水平的抗体状态，本课题组采用添加佐剂的方式优化pVAX1‑HA2‑fimA牙周炎基因疫苗，并证明CpG ODN可作为Sprague‑Dawley（SD）大鼠pVAX1‑HA2‑fimA有效和安全的黏膜佐剂，抑制炎症和减少骨质流失^［12］。CpG ODN作为一种免疫调节合成的寡核苷酸，可通过与模式识别受体结合激活先天免疫细胞^［13］。研究表明添加CpG ODN可以明显增强Toll样受体信号通路活性，激活Toll样受体信号通路可增强先天免疫力，从而增强基因疫苗的免疫原性^［14］。本课题组通过联合运用CpG ODN佐剂增强了牙周炎疫苗免疫原性，与Li等^［15］研究结果相似，但CpG ODN在牙周炎基因疫苗中的具体作用机制尚未明确，因此本实验通过RNA‑seq技术初步探讨CpG ODN作为牙周炎基因疫苗佐剂的作用机制，旨在为基因疫苗用于牙周炎的防治提供实验依据和研究基础。

1 材料与方法

1.1 动物

9只无特异性无病原体（SPF）SD大鼠，重（100±20）g，从长沙市天勤生物技术有限公司购入，实验动物许可证号：SCXK（湘）2019‑0014。所有大鼠采用标准饮食，饲养室温度为（24±2） °C，相对湿度为40%~70%。先将大鼠依次编为1~9，然后从随机数字表抄录9个数字，将各数一律以3除之，并以余数0、1、2代表A、B、C，最终将9只大鼠分为A组（空白组）、B组（pVAX1‑HA2‑fimA对照组）、C组（pVAX1‑HA2‑fimA+CpG ODN实验组）3组，每组3只。大鼠按照组别分别编号为A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3。以吸入七氟烷的麻醉方法麻醉SD大鼠，于第1、2、4周通过鼻黏膜滴注方式进行免疫。免疫时用微量移液枪双侧鼻腔交替滴注，每次每只大鼠免疫剂量为100 μL，疫苗浓度为1 000 μg/mL。于第7周采用吸入过量七氟烷的方式处死所有大鼠后收集脾脏组织。将3组大鼠脾脏RNA提取物分为两部分，一部分送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行转录组测序，另一部分用于后续RT‑qPCR分析。所有动物按照动物福利伦理原则使用，该研究获得遵义医科大学伦理委员会的批准（编号：伦审〔2021〕2‑009号）。

1.2 RNA‑seq制备和测序

按照说明书使用动物组织总RNA提取试剂盒（DP451，TIANGEN，北京，中国）提取3组大鼠脾脏的RNA。通过the NanoPhotometer^® spectrophotometer（IMPLEN，CA，USA）以及the Bioanalyzer 2100 system（Agilent Technologies，CA，USA）检测所获RNA的浓度和完整性。使用3组实验大鼠共9个脾脏提取的等量RNA来构建mRNA‑Seq文库。北京诺禾致源科技有限公司（北京，中国）使用NEBNext^® Ultra™ RNA Library Prep Kit构建mRNA‑Seq文库。通过Oligo dT磁珠富集总RNA中有polyA尾的mRNA，以片段化的mRNA为模版合成cDNA并通过PCR扩增，样本合格后上机测序^［16］。使用Illumina Novaseq 6000测序平台配对端读取执行测序，测序策略为PE150。测序后使用FASTP（version 0.19.7）对测序数据进行质控。

1.3 mRNA‑seq数据的生物信息学分析

由Illumina Novaseq 6000平台读取并生成mRNA‑Seq数据，过滤原始数据中带接头的reads、无法确定碱基信息的reads以及低质量reads（Phred score≤20）^［17］。将过滤后的数据通过DEseq2 v.1.16.1归一化再进行差异表达分析。该软件采用负二项分布模型来检测差异基因表达，其筛选差异基因标准：Benjamini & Hochberg （BH） P adjust<0.05 &|log2FC|>0经过多次比较。基因本体论（Gene Ontology，GO）及京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）路径富集分析采用clusterProfiler进行分析，计算得到的P value通过FDR（BH法）校正。

将上述筛选出的数据上传至检索相互作用基因的搜索工具（STRING，https：//string-db.org/），将最低相互作用评分>0.4的结果导入到Cytoscape v.3.9.0中建立蛋白质‑蛋白质相互作用（protein‑protein interaction，PPI）网络，最后使用CytoHubba插件根据最大集团中心性算法分析排名Top 10的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。最后，综合GO、KEGG、PPI网络图分析筛选CpG ODN佐剂在提高牙周炎基因疫苗的预防效果方面可能起到关键作用的基因。

1.4 基因表达的cDNA合成和RT‑qPCR分析

大鼠脾脏RNA提取物按照制造商EasyScript^® One‑Step gDNA Removal 和 cDNA Synthesis SuperMix（AE311，TransGen，中国）的使用说明进行cDNA合成。之后使用RT‑qPCR试剂盒 Perfect Start^® Green qPCR Super Mix（AQ601，TransGen，中国）检测与NOD样受体信号通路相关的Oas2、Irf7、Np4、Defa11、Camp基因的mRNA表达，引物序列见表1。反应程序Step 1：94 ℃，30 s；Step 2：94 ℃，5 s；Step 3：52 ℃，15 s；Step 4：72 ℃，10 s；重复第二步至第四步40个循环。每个样品3个生物学重复，用β‑Actin内参基因将关键基因的归一化后计算mRNA相对表达量。

1.5 统计学处理

数据使用SPSS18.0（SPSS Inc. Chicago，IL， USA）软件进行统计分析，计量资料以\overline{x}\pm s表示，对于正态分布的数据，采用独立样本t检验（unpaired t test）分析pVAX1‑HA2‑fimA对照组和pVAX1‑HA2‑fimA+CpG ODN实验组之间的明显差异，非正态分布的数据采用Mann‑Whitney U检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 转录组序列的表征

为探讨CpG ODN佐剂提高牙周炎基因疫苗免疫原性的机制，对A、B、C 3组共计9个样本进行测序，并构建转录组文库，见表2。A、B、C 3组分别平均生成4.92万次、4.65万次、4.62万次原始读数，在从原始数据中过滤掉低质量读取和适配器序列后，平均干净读数分别为4.67万次、4.41万次、4.62万次。而A、B、C 3组中平均洁净读取比值分别为90.24%、89.36%、90.43%，平均清洁读取的Q30%值分别为94.72%、94.64%、95.00%，平均GC值分别为50.45%、50.06%和48.32%。在基于FPKM的基因表达分析中，使用了uniquely mapped clean reads。pVAX1‑HA2‑fimA+CpG ODN组pVAX1‑ HA2‑fimA组2组基因表达相比，存在51个上调基因和110个下调基因（图1）。

2.2 差异表达基因的GO富集分析

为了进一步探讨CPG ODN佐剂提高牙周炎基因疫苗免疫原性的机制，对DEGs进行GO功能注释和富集分析，分析了生物过程、细胞组成、分子功能3个部分，选取最明显的30个Term绘制柱状图（图2）。结果表明，上述3类基因功能中的大多数基因参与了免疫过程，如抗菌体液反应、对其他生物体的防御反应、对细菌的防御反应、革兰氏阴性菌的防御反应等。GO富集分析表明，CpG ODN佐剂可能在牙周炎基因疫苗减轻实验性牙周炎中发挥重要作用。

2.3 差异表达基因的KEGG富集分析

为了阐明CPG ODN对牙周炎基因疫苗的影响，对DEGs的前20种最富集途径进行了KEGG富集分析（图3）。NOD样受体信号通路的KEGG富集图中Np4、Defa5、Camp、Defa11基因明显下调，Irf7、Oas2、Oas1a基因明显上调（图4）。结果表明，NOD样受体信号通路、金黄色葡萄球菌感染、核糖体等信号通路发生明显变化，而其中NOD样受体信号通路与免疫过程联系密切，因此本课题组推测NOD样受体信号通路可能在CpG ODN提供牙周炎基因疫苗的免疫原性中起到了至关重要的作用。

2.4 PPI网络互作图的构建和分析

将基于上述筛选标准的DEGs映射到STRING数据库中，导出后的文件上传至Cytoscape软件，构建了这些基因的PPI网络图，该图具有58个节点和155个边缘（图5）。在PPI网络中，高度连接的蛋白被称之为hub基因，hub基因通常在生物学过程中发挥重要作用。Cytoscape软件中的CytoHubba插件被用来筛选Top 10的hub基因，以下10个hub基因具有最高程度的节点：Mx2、Irf7、Usp18、Mx1、Oasl、Herc6、Oas1a、Xaf1、Epsti1、Oas2，其中Irf7、Oasl、Oas1a、Oas2与免疫反应联系密切。

2.5 鼻滴免疫大鼠后脾脏关键基因的表达

基于转录组序列并结合GO、KEGG、PPI网络图分析，本课题组推测CpG ODN增强牙周炎基因疫苗免疫原性可能与Oas2、Irf7、Np4、Defa11、Camp相关。而RT‑qPCR结果显示，与对照组相比，在CpG ODN作用下，Defa11、Camp、Np4明显下调，Oas2、Irf7明显上调（P<0.001）。这一实验结果与转录组测序结果相一致（图6）。

3 讨论

牙周炎是一种主要由细菌引起的慢性炎症性疾病，可导致牙周组织炎症、牙槽骨吸收及牙齿脱落^［18］。目前针对牙周炎的治疗主要围绕消除病因、减少危险因素和牙周维持治疗等方面，一些例如宿主调节疗法、抗菌光动力治疗、激光治疗、益生菌等新的治疗方法以辅助治疗^［19］。近年来有关新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019）的DNA疫苗和mRNA疫苗在临床运用中取得了令人振奋的结果，而其价格低廉和便于制备的优点让科研人员看到了基因疫苗的发展潜力^{［20‑22］}。为寻找一种更加便捷、高效的治疗方法，本课题组前期提取了W83型P. gingivalis的总DNA，获取P. gingivalis的核心功能区HA2和fimA，并将HA2、fimA以及IRES序列基因拼接获得HA2‑fimA片段，以pIRES2‑EGFP为模板，以pVAX1质粒为载体构建牙周炎基因疫苗，将重组后的质粒转入感受态DH5α细胞，挑选阳性重组子进行测序、扩增及保菌。后期的实验表明重组质粒体外成功转染真核细胞293T，经Western blot检测pVAX1‑HA2‑fimA能成功在体外293T细胞中表达。以双鼻滴注的方式对SD大鼠进行免疫，并观察到免疫后的大鼠其特异性抗体水平较空白组有所升高，但特异性抗体维持时间并不长。随后本课题组试图通过加入CpG ODN佐剂来提高疫苗的免疫原性。虽然添加佐剂的牙周炎疫苗取得了更佳的预防效果，但CpG ODN如何协同牙周炎基因疫苗发挥作用的机制尚不明确。

RNA‑Seq是量化基因表达水平和基因表达模式的技术，被广泛用于揭露转录组样本间基因组的变化^［23］。为了探究牙周炎基因疫苗在分子水平上的作用机制，课题组采用RNA‑Seq技术采集不同组别间基因的表达情况。本研究综合分析了RNA‑Seq测序数据，筛选pVAX1‑HA2‑fimA和pVAX1‑HA2‑fimA+CpG ODN 2组间的DEGs，为了充分了解这些DEGs的功能和机制，利用clusterProfiler包进行了GO和KEGG富集分析，GO分析表明DEGs主要参与抗菌体液反应、对细菌的防御反应、革兰氏阴性菌的防御反应等，这些生物学过程可能有助于减轻实验性牙周炎对牙周组织的破坏。KEGG通路分析表明，某些通路表达上调可能有助于调节炎症，例如NOD样受体通路，以往的研究表明NOD样受体通路是介导先天免疫的关键因素，NOD样受体能通过触发炎症小体的组装，通过调控NF‑κB和MAPK通路来调控炎症^［24］。因此，对NOD样受体通路进行调控可能是牙周炎的治疗策略。

经过分析本研究筛选出5个关键基因：Oas2、Irf7、Np4、Defa11、Camp。有研究发现这些关键基因与牙周炎的预后有所关联。Rodriguez‑Hernandez等^［25］的研究表明P. gingivalis强烈抑制了机体的Ⅰ型干扰素（interferon，IFN）反应，抗病毒限制性因子家族成员大量下调，P. gingivalis通过损害“抗病毒状态”增加宿主易感性。2'~5'寡腺苷酸合成酶（2'‑5' oligoadenylate synthetase，OAS）是IFN或病毒诱导产生的抗病毒酶，这种酶参与病毒感染期间核糖核酸酶L（RNaseL）的活化，起到阻断病毒复制并抑制病毒蛋白合成的作用^［26］。与人类2'~5' OAS基因分型一致，在大鼠基因组中也可鉴定出OAS1、OAS2、OAS3基因以及OAS样基因（OASL）^［27］。OAS2通过增强Ⅰ型IFN激活免疫反应抑制病毒复制，当OAS2与NOD2结合时RNaseL活性增强有助于先天免疫和细胞代谢^［28］。Irf7是IFN调节因子（interferon regulatory factors，IRFs）家族的关键成员，Irf7可以积极调节IFN‑α和IFN‑β的表达^［29］。IFN‑α以激活成骨细胞分化并抑制破骨细胞融合发挥促成骨作用，而IFN‑β抑制成骨细胞介导的骨重塑以及破骨细胞分化，减弱骨吸收^［30］。但有研究表明I型IFN通过诱导树突状细胞长时间启动CD4 Th1细胞，提高牙龈RANKL表达，导致牙槽骨丢失^［31］。Np4、Defa11和cathelicidins是由大鼠产生的抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）。AMPs是生物体自然产生的小蛋白质，作为先天免疫的第一道防线抵御微生物的攻击，又称被为宿主防御肽^［32］。哺乳动物根据AMPs的结构组成主要分为防御素和cathelicidins两类^［33］。AMPs在牙周和口腔组织稳态中有着重要的意义，AMPs除了对牙周病原菌具有抗菌活性，在免疫反应中发挥调节作用，还具有促进成骨分化并减少骨质流失的能力^{［34，35］}。LL‑37是人类一种抗菌肽，研究表示LL‑37通过口腔角质形成细胞中的 RIG‑I 调节 dsRNA 介导的炎症反应，这可能在口腔炎症性疾病的发病机制中发挥重要作用^［36］。最新的研究还揭示了LL‑37与细菌DNA结合形成复合物，这些复合物可能沉淀为细胞外基质^［37］。然而，Oas2、Irf7、Np4、Defa11、Camp是否与牙周炎基因疫苗的免疫机制有关，可在未来的实验中进行研究。

本研究通过CpG ODN佐剂优化了牙周炎基因疫苗，和测序数据分析了其潜在的作用机制，本团队将进一步深入研究其关键基因及通路。

作者贡献度说明：

王汝佳：实验设计、执行实验；王汝佳、王月月：数据分析，论文初稿；陈彬：实验设计，试验结果分析；白国辉：项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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