复方扶芳藤合剂对黑色素瘤小鼠脾脏CD4⁺ T细胞的调节作用

The regulatory effect of Compound Fufangteng Mixture on CD4⁺ T cells in the spleen of melanoma mice

摘要

目的 探究复方扶芳藤合剂（compound fufangteng mixture，CFM）对黑色素瘤小鼠脾脏CD4⁺ T细胞的调节作用。 方法 将50只雌性C57BL/6小鼠随机分为5组：空白对照（Blank）组、肿瘤模型（B16）组、高剂量复方扶芳藤合剂（CFM‑H）组、中剂量复方扶芳藤合剂（CFM‑M）组和低剂量复方扶芳藤合剂（CFM‑L）组，预先灌胃纯水或不同剂量CFM 21 d，再皮下注射B16细胞构建黑色素瘤模型。2周后终止实验，取小鼠脾脏，用流式细胞术检测T细胞比例及其活化、增殖、凋亡、抑制、转录因子表达和细胞因子分泌情况。 结果 CFM对小鼠体重及胸腺指数无明显影响，中剂量CFM可提高脾脏指数；中剂量CFM降低了CD4⁺ T细胞比例，提高了CD8⁺ T细胞比例，对总T细胞比例无明显影响；中剂量CFM能促进Th1、Th2细胞数量增加；中剂量CFM能促进T细胞CD69和CD38的表达；高剂量CFM能促进T细胞CD95表达，中、低剂量CFM能促进T细胞PD‑1表达；高剂量CFM促进IL‑4分泌，中剂量CFM促进IL‑2、IFN‑γ、IL‑4和IL‑10分泌，低剂量CFM促进TNF‑α、IL‑4分泌；高、中剂量CFM能增加NF‑κB表达，减少T‑bet和GATA‑3表达，低剂量CFM能降低T‑bet表达。 结论 CFM能够活化CD4⁺ T细胞，促进Th1、Th2细胞亚群的分化。

Abstract

Objective To explore the regulatory effect of Compound Fufangfuteng Mixture（CFM） on CD4⁺ T cells in the spleen of melanoma mice. Methods Randomly divide 50 female C57BL/6 mice into 5 groups： blank group（Blank）， tumor model group（B16）， high‑dose Compound Fufangfuteng Mixture group（CFM‑H）， medium‑dose Compound Fufangfuteng Mixture group（CFM‑M）， and low‑dose Compound Fufangfuteng Mixture group（CFM‑L）. Pre‑treat the mice with pure water or different doses of CFM by gavage for 21 days， followed by subcutaneous injection of B16 cells to establish melanoma model. After 2 weeks， terminate the experiment， harvest the mouse spleens， and use flow cytometry to detect the proportion of T cells and their activation， proliferation， apoptosis， inhibition， transcription factor expression and cytokine secretion. Results CFM had no significant effect on mouse body weight and thymus index， but the medium dose of CFM could increase the spleen index； the medium dose of CFM reduced the proportion of CD4⁺ T cells and increased the proportion of CD8⁺ T cells， with no significant effect on the total T cell proportion； the medium dose of CFM could promote the increase in the number of Th1 and Th2 cells； The medium dose of CFM could promote the expression of CD69 and CD38 on T cells； the high dose of CFM could promote the expression of CD95 on T cells， while the medium and low doses of CFM could promote the expression of PD‑1 on T cells； The high dose of CFM could promote the secretion of IL‑4， the medium dose of CFM could promote the increase of IL‑2， IFN‑γ， IL‑4， and IL‑10， and the low dose of CFM could promote the secretion of TNF‑α and IL‑4； both high and medium doses of CFM could increase the expression of NF‑κB， the medium dose of CFM could decrease the expression of T‑bet and GATA‑3， and the low dose of CFM could reduce the expression of T‑bet. Conclusions CFM can activate CD4⁺ T cells and promote the differentiation of Th1 and Th2 cell subsets.

Graphical abstract

关键词

复方扶芳藤合剂 / 黑色素瘤 / T细胞

Key words

Compound Fufangteng Mixture / Melanoma / T cells

黑色素瘤是一种来源于黑色素细胞的恶性肿瘤，具有高侵袭特性和高转移率，临床上主要以手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗为主，但疗效有限^［1，2］。研究表明，肿瘤内有淋巴细胞浸润的患者，治疗效果较好。肿瘤浸润淋巴细胞包括CD8⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞、Treg细胞、B细胞和NK细胞等^［3］，特别是CD8⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞在抑制黑色素瘤生长和转移方面具有明显作用^［4］。

目前，中医药在肿瘤治疗中的作用越来越受到重视，很多方剂对T细胞都具有调节作用，比如增加效应性CD4⁺ T细胞的水平，提高T淋巴细胞的功能，调节Th17和Treg细胞平衡等^［5，6］。复方扶芳藤合剂（compound fufangteng mixture， CFM），是广西首批认定的民族药，由扶芳藤、黄芪和红参组成，具有益气补血、健脾养心的功效^［7］。现有研究表明，CFM对小鼠外周血干细胞具有动员作用^［8］，能够改善亚急性衰老模型小鼠的免疫功能^［9］，具有抗HIV‑1活性^［10］，增加CD4⁺ T细胞数量，促进T和B细胞增殖等功能^［11］。

前期研究聚焦于CFM对免疫抑制小鼠淋巴细胞的调节作用，本研究着重于CFM对黑色素瘤小鼠T细胞的调控作用探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与细胞

雌性6~8周SPF级C57BL/6小鼠（18~20 g）购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（湘）2019‑0004］，饲养于广西中医药大学仙葫校区实验动物中心，实验动物使用许可编号：SYXK（桂）2019‑0001，环境温度22~26 ℃，湿度50%~60%。B16细胞来源于广西中药药效研究重点实验室。

1.1.2 药物

脱糖型复方扶芳藤合剂（广西中医药大学百年乐制药公司，国药准字Z45021781）。

1.1.3 试剂与仪器

小鼠外周血淋巴细胞分离液试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：P8620），红细胞裂解液（安徽白鲨生物科技有限公司，中国，货号：BL503B），荧光素标记单克隆抗体Anti‑mouse CD3 AlexaFluor700（Biolegend公司，美国，货号：100216）、Anti‑mouse CD4 APC‑Fire750（Biolegend公司，美国，货号：100460）、Anti‑mouse CD8 Brilliant Violet610（Bio‑rad公司，美国，货号：MCA609SBV610）、Anti‑mouse CD38 BB700（BD公司，美国，货号：742132）、Anti‑mouse CD69 Brilliant Violet650（Biolegend公司，美国，货号：104541）、Anti‑mouse CD95 APC（Biolegend公司，美国，货号：152604）、Anti‑mouse PD‑1 AlexaFluor488（Bio‑rad公司，美国，货号：MCA2464A488）、Anti‑mouse NF‑κB P65 （Rel a） PE （CST公司，美国，货号：9460S）、Anti‑mouse T‑bet BV650（BD公司，美国，货号：564142）、Anti‑mouse GATA‑3 PE‑Cyanine7（Thermo公司，美国，货号：25‑9966‑41）、Anti‑mouse Ki‑67 AlexaFlour488（Biolegend公司，美国，货号：151204）、Anti‑mouse IL‑2 Brilliant Violet421（Biolegend公司，美国，货号：503826）、Anti‑mouse IL‑4 PE（Biolegend公司，美国，货号：504104）、Anti‑mouse IL‑10 BV650（BD公司，美国，货号：564083）、Anti‑mouse IFN‑γ Brilliant Violet605（Biolegend公司，美国，货号：505840）、Anti‑mouse TNF‑α AlexaFluor488（Biolegend公司，美国，货号：506313）、ZombieRed（Biolegend公司，美国，货号：423110）、True‑Nuclear Transcription Factor Buffer Set（Biolegend公司，美国，货号：424401）、Cell Stimulation Cocktail （plus protein transport inhibitors） （eBioscience公司，美国，货号：85‑00‑4975‑93），光学显微镜（德国Leica公司，德国，型号：505814），CytoFLEX型流式细胞仪（美国Beckman‑Coulter公司，美国，型号：B70016），可调微量移液器（德国Eppendorf公司，德国，10 μL型号：O23781D，100 μL型号：K15146G），低温高速离心机（美国Thermo公司，美国，型号：75002425 ）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

将50只C57BL/6小鼠随机分为复方扶芳藤合剂高剂量组（CFM‑H组）、复方扶芳藤合剂中剂量组（CFM‑M组）、复方扶芳藤合剂低剂量组（CFM‑L组）、空白对照组（Blank组）、模型组（B16组），共5组。经广西中医药大学伦理委员会审查，伦理审批号：DW20240607-401。

1.2.2 给药方法

实验组高（20 g/kg）、中（10 g/kg）、低（5 g/kg）3个剂量复方扶芳藤合剂灌胃21 d，模型组及空白组纯水灌胃21 d，灌胃体积为0.01 mL/g。

1.2.3 模型制备

复苏B16细胞，传代1次，取对数生长期细胞，调整细胞浓度，约为1×10⁶个/mL，每只接种100 μL。小鼠灌胃结束后，右侧大腿外侧剃毛，用75%的酒精擦拭消毒皮肤后皮下注射，每日触摸小鼠肿瘤部位，观察是否有肿块出现，并记录肿瘤的生长情况。

1.2.4 标本的采集与处理

皮下植瘤两周后，异氟烷麻醉摘眼球采血后颈椎脱臼处死，剥离胸腺、脾脏后称重；分别收集外周血、脾脏并通过密度梯度法分离单个核细胞，细胞计数，加入RPMI‑1640制备成浓度为1×10⁷个/mL的细胞悬液。

1.2.5 流式细胞术检测T细胞比例、活化、增殖、凋亡、抑制分子

取100 μL单个核细胞悬液，加入Anti‑mouse CD3 AlexaFluor700、Anti‑mouse CD4 APC‑Fire750、Anti‑mouse CD38 BB700、Anti ‑mouse CD69 Brilliant Violet650、Anti‑mouse CD95 APC、Anti‑mouse PD‑1 AlexaFluor488和ZombieRed，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗去未结合抗体。使用CytoFLEX流式细胞仪检测样本，FlowJo软件进行流式数据分析。

1.2.6 流式细胞术检测转录因子 取100 μL单个核细胞悬液，加入Anti‑mouse CD3 AlexaFluor700、Anti‑mouse CD4 APC‑Fire750和ZombieRed，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗去未结合抗体。加入破膜剂，4 ℃避光孵育40 min，缓冲液洗去破膜剂，加入Anti‑mouse NF‑κB P65 （Rel a） PE 、Anti‑mouse T‑bet BV650、Anti‑mouse GATA‑3 PE‑Cyanine7和Anti‑mouse Ki‑67 AlexaFlour488，PBS洗去未结合抗体。使用CytoFLEX流式细胞仪检测样本，FlowJo软件进行流式数据分析。

1.2.7 流式细胞术检测细胞因子

取100 μL单个核细胞悬液，加入刺激剂，37 ℃，5% CO₂，避光孵育6 h，离心弃上清后加入Anti‑mouse CD3 AlexaFluor700、Anti‑mouse CD4 APC‑Fire750、Anti‑mouse CD8 StarBrightViolet610和 ZombieRed，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗去未结合抗体。加入破膜剂，4 ℃避光孵育40 min，缓冲液洗去破膜剂，加入Anti‑mouse IL‑2 Brilliant Violet421、Anti‑mouse IL‑4 PE、Anti‑mouse IL‑10 BV650 、Anti‑mouse IFN‑γ Brilliant Violet605和Anti‑mouse TNF‑α AlexaFluor488，PBS洗去未结合抗体。使用CytoFLEX流式细胞仪检测样本，FlowJo软件进行流式数据分析。

1.2.8 设门策略

使用FlowJo软件进行流式数据分析，通过SSC‑H、FSC‑H圈出淋巴细胞，通过FSC‑A、FSC‑H去除黏连细胞，ZombieRed排除死细胞，从选定的淋巴细胞中根据标记的荧光抗体设门。

（1）表面分子：①流式细胞术检测T细胞比例： CD3⁺T：CD3⁺，CD4⁺ T：CD3⁺、CD4⁺；②流式细胞术检测CD4⁺ T细胞活化与耗竭：CD38、CD69、CD95、PD‑1（图1）。

（2）核转录因子：①流式细胞术检测T细胞亚群比例：CD3⁺T：CD3⁺，CD4⁺ T：CD3⁺、CD4⁺；②流式细胞术检测CD4⁺ T细胞转录因子：Ki‑67、T‑bet、NF‑κB、GATA‑3（图2）。

（3）细胞因子：①流式细胞术检测T细胞比例：CD3⁺T：CD3⁺，CD4⁺ T：CD4⁺、CD8^‑，CD8⁺ T：CD4^‑ CD8⁺；②流式细胞术检测CD4⁺ T细胞细胞因子：IL‑2、IL‑4、IL‑10、INF‑γ、TNF‑α（图3）。

1.3 统计学处理

采用Graphpad Prism10.1分析实验数据并绘制统计图，定量资料若符合正态分布，以\overline{x}\pm s表示；定量资料若不符合正态分布，以中位数（四分位数间距）表示。符合正态分布的多组数据采用单因素方差分析检验，不符合正态分布的多组数据采用秩和检验，其中多重比较采用Dunnett 检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CFM对小鼠体重没有影响

灌胃第1天，Blank和CFM‑H组小鼠体重有差异（图4A、D）；灌胃21 d后，各组小鼠体重在20 g左右（图4B、D）；皮下注射黑色素瘤细胞至实验终点第36天，各组小鼠体重在21 g左右（图4C、D）。以上结果表明CFM对小鼠体重没有明显影响。

2.2 CFM对小鼠胸脾指数的调节作用

CFM对小鼠胸腺指数的影响不明显，各组之间差异无统计学意义（P>0.05）（图5A），CFM‑H组胸腺指数高于B16组，而CFM‑M和CFM‑L组胸腺指数低于B16组，且CFM‑L与Blank组胸腺指数最接近。随着CFM剂量降低，胸腺指数呈V字形变化，而脾脏指数则呈倒V字形变化（图5B）。CFM‑M与B16组的脾脏指数有明显差异（Kruskal‑Wallis=19.28，P<0.05），CFM‑H组脾脏指数与B16组相当且更接近Blank组，CFM‑L组脾脏指数略高于B16组。由此可以看出，皮下接种黑色素瘤细胞后，胸脾指数升高；预先给予CFM处理，再皮下接种黑色素瘤细胞，胸腺指数和脾脏指数的变化趋势正好相反，并与CFM剂量相关。

2.3 CFM对小鼠脾脏T细胞的调节作用

皮下接种黑色素瘤细胞14 d后，检测了脾脏中T细胞的比例（图6A、B）。B16组脾脏CD3⁺ T细胞比例有所上升，高、中剂量CFM可下调脾脏CD3⁺ T细胞比例，与Blank组接近；低剂量CFM可上调脾脏CD3⁺ T细胞比例，各组之间差异无统计学意义（P>0.05）（图6C）。

B16组小鼠脾脏CD4⁺ T细胞比例高于Blank组（F=9.511，P<0.05）和CFM‑M组（F=9.511，P<0.001）（图3D），而CD8⁺ T细胞比例低于Blank组（F=14.19，P<0.01）和CFM‑M组（F=14.190，P<0.001）（图6E）。从CD4/CD8比例来看，B16组高于Blank组（F=11.520，P<0.01）和CFM‑M组（F=11.520，P<0.001）（图6F）。

以上结果表明，中剂量CFM能够下调黑色素瘤小鼠脾脏CD4⁺ T细胞比例，上调CD8⁺ T细胞比例，而高、低剂量CFM没有明显作用。

2.4 CFM对小鼠脾脏CD4⁺T细胞亚群Th1和Th2的调节作用

进一步检测了小鼠脾脏CD4⁺T细胞亚群Th1和Th2的变化情况（图7A、B）。皮下注射黑色素瘤细胞B16后，Th1细胞比例下降，Th2细胞比例上升，差异无统计学意义（P>0.05）（图7C、D）。预先给予CFM处理后，中剂量CFM能够明显上调Th1和Th2细胞比例，高剂量和低剂量CFM则没有明显影响（图7C、D）。这说明中剂量CFM能促进小鼠脾脏CD4⁺ T细胞亚群Th1和Th2的比例上调，而中剂量CFM能下调CD4⁺ T细胞比例，因此中剂量CFM对其他CD4⁺ T细胞亚群可能具有下调作用。

2.5 CFM对小鼠脾脏CD4⁺ T细胞活化、增殖的调节作用

进一步检测CD4⁺ T细胞活化和增殖相关分子CD69、CD38和Ki‑67的变化情况（图8A~C）。B16组CD69、CD38和Ki‑67表达量相比Blank组有所降低，其中CD38的下调有统计学差异（F=4.284，P<0.05）（图8D~F）。预先给予CFM处理的3组中，CFM‑H组CD69和CD38表达量进一步降低，而CFM‑M组CD69和CD38表达量回升（F=12.99，P<0.01；F=4.284，P<0.05），CFM‑L组CD69表达量上升（F=12.99，P<0.001）。Ki‑67在CFM‑M组有所回升，CFM‑H和CFM‑L组则持续下降，差异无统计学意义（P>0.05）。以上结果表明，中、低剂量CFM能够促进CD4⁺ T细胞的活化，对于CD4⁺ T细胞的增殖，则没有明显作用。

2.6 CFM对小鼠脾脏CD4⁺ T细胞CD95和PD‑1表达的调节作用

死亡受体CD95通常在活化的T细胞上表达，与T细胞的凋亡相关。B16组CD95表达率与Blank组持平，高剂量CFM则会诱导CD95的表达上调（Kruskal‑Wallis=38.12，P<0.001），中、低剂量CFM则下调CD95的表达（图9A、C），说明高剂量CFM能够促进CD4⁺ T细胞的活化。

共抑制分子PD‑1的表达会抑制T细胞的功能，B16组的PD‑1表达率低于Blank组，与CFM‑H组接近。中、低剂量CFM处理组PD‑1表达率明显升高（Hc=27.45，P<0.001，P<0.001）（图9B、D），这意味着中、低剂量CFM对CD4⁺ T细胞有活化作用。综上所述，高剂量CFM活化CD4⁺ T细胞后通过CD95诱导其凋亡，中、低剂量CFM活化活化CD4⁺ T细胞后，通过PD‑1抑制其功能。

2.7 CFM对小鼠脾脏CD4⁺ T细胞细胞因子分泌的调节作用

进一步检测CD4⁺ T细胞细胞因子的分泌情况（图10A~E）。B16组中IL‑10分泌量较Blank组明显下降（F=33.78，P<0.05），IL‑2、IFN‑γ、TNF‑α和IL‑4等没有明显改变。预先给予CFM处理后，高剂量CFM促进了IL‑4的分泌（F=30.67，P<0.001）；中剂量CFM增加了IL‑2、IFN‑γ、IL‑4和IL‑10的分泌量（Hc=22.05，P<0.001；Hc=26.55，P<0.001；F=30.67，P<0.001；F=33.78，P<0.001）；低剂量CFM对TNF‑α和IL‑4的分泌有促进作用（Hc=11.09，P<0.01；F=30.67，P<0.001）（图10F~J）。以上结果表明，高剂量CFM促进了Th2细胞分化，中、低剂量CFM能促进Th1和Th2细胞分化。

2.8 CFM对小鼠脾脏CD4⁺ T细胞NF‑κB、T‑bet和GATA‑3的调节作用

NF‑κB与CD4⁺ T细胞的分化关系密切，因此检测NF‑κB的表达情况。黑色素瘤细胞注射后，B16组NF‑κB表达下调，而预先给予CFM处理组中，高、中剂量CFM能诱导NF‑κB表达上调，低剂量CFM差异无统计学意义（P>0.05）（图11A、D）。

同时检测Th1和Th2细胞亚群核转录因子T‑bet和GATA‑3的表达情况。高剂量CFM诱导T‑bet表达上调，中、低剂量CFM作用相反，诱导T‑bet表达下降，3组具有统计学差异（F=34.68，P<0.01）（图11B，E）。GATA‑3的表达情况与T‑bet趋势类似，高剂量CFM诱导GATA‑3表达上调，中、低剂量CFM诱导GATA‑3表达下调，只有CFM‑M组有统计学差异（F=11.80， P<0.001）（图11C、F）。以上结果表明，高剂量CFM促进了CD4⁺ T细胞向Th1方向分化，中剂量CFM对Th1和Th2细胞亚群有抑制作用，低剂量CFM对Th1细胞亚群有抑制作用。

3 讨论

本研究主要探讨CFM对黑色素瘤小鼠脾脏T细胞，尤其是CD4⁺ T细胞活化、增殖、分化、功能抑制和凋亡等的调节作用。从细胞因子水平来看，高剂量CFM促进了IL‑4的分泌，IL‑4是Th2细胞分泌的主要细胞因子，因此高剂量CFM可诱导CD4⁺ T向Th2细胞方向分化。中剂量CFM上调了IL‑2、IFN‑γ、IL‑4和IL‑10的分泌，IL‑2和IFN‑γ主要由Th1细胞分泌，而IL‑4和IL‑10主要由Th2细胞分泌，这表明中剂量CFM可同时促进Th1和Th2细胞的分化。低剂量CFM主要促进了TNF‑α和IL‑4的分泌，这两种细胞因子主要由Th1和Th2细胞分泌，这表明低剂量CFM与中剂量作用类似，促进Th1和Th2细胞分化。从Th1和Th2细胞亚群比例的结果来看，也证明了中剂量CFM能够促进Th1和Th2细胞的分化。现有研究表明，多种中药方剂^{［12‑14］}，都能够调控Th1和Th2细胞亚群的分化，其共同点为促使T细胞向Th1细胞分化，减少向Th2细胞分化。

NF‑κB与T细胞亚群分化密切相关，NF‑κB的上调会促进T‑bet的表达，从而促进Th1相关细胞因子的分泌。高剂量CFM对NF‑κB和T‑bet的表达具有促进作用，但是并没有促进Th1型细胞因子的分泌，而是增加了Th2型细胞因子的分泌，这可能是由于高剂量CFM对NF‑κB和T‑bet的上调对Th1细胞产生了负反馈调节作用。研究表明，T‑bet表达增加，但是Th1型细胞因子减少，可能与T‑bet与GATA‑3的平衡失调相关^［15］。中剂量CFM上调了NF‑κB的表达，下调了T‑bet和GATA‑3的表达，而Th1和Th2型细胞因子分泌增加，这可能是由于Th1和Th2细胞因子相互之间的拮抗作用导致的。低剂量CFM对NF‑κB和GATA‑3表达没有影响，下调了T‑bet的表达，这促进了Th2细胞分泌IL‑10，但同时Th1细胞分泌的TNF‑α也增加了。不同细胞因子间的相互作用，也可能会导致转录因子和细胞因子表达不一致的情况出现，如IL‑12可以增加IFN‑γ的产生并减少IL‑17的分泌，而IL‑23则增加IL‑17并减少IFN‑γ的分泌^［16］。同时，这也与疾病状态和信号通路的多样性有关^{［17‑19］}。

在T细胞活化方面，高剂量CFM对T细胞具有一定的抑制作用，中、低剂量则有一定的促进作用，但对T细胞没有明显的促增殖作用，这也与T细胞比例在各组间没有差异是一致的。从CD4和CD8亚群来看，高剂量CFM能抑制CD4和CD8两群T细胞的比例；中剂量的作用正好相反，降低CD4⁺ T比例，增加CD8⁺ T比例；低剂量CFM作用效果不明显。多项研究表明，中药复方等能促进T细胞的活化和增殖，且与剂量相关^{［20‑22］}。在活化诱导的细胞凋亡方面，高、中、低剂量CFM能明显诱导CD95的表达，这也说明了CFM对T细胞的活化具有促进作用。而其他研究显示，中药复方能够通过调控凋亡相关基因和影响凋亡相关蛋白活性降低T细胞的凋亡率^{［23‑26］}。在功能方面，3个剂量CFM能增加PD‑1的表达，不过只有低剂量具有统计学差异。

从小鼠个体层面来看，不同剂量CFM对体重、胸脾指数没有明显影响，只有中剂量CFM会增加脾脏指数。这表明CFM的作用主要体现在外周免疫器官。

综上所述，CFM能够活化黑色素瘤小鼠脾脏T细胞，影响Th1和Th2的分化及其细胞因子的产生，而且依赖于剂量的变化，这为后续进一步研究CFM在预防肿瘤方面的作用机制提供了基础。

作者贡献度说明：

杨晨一：实验及文章撰写；徐思溢、刘思嘉、刘显：部分实验及实验数据整理、分析；吴展帅、肖健：课题的构思与论文指导与修改，经费支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

参考文献

[1] Yang X， Chen C， Zhou S， et al. Antitumor effects of plasma‑activated solution on a murine melanoma model in vivo and in vitro ［J］. Oncol Lett， 2024，29（2）：75.

[2] Dumitras DA， Andrei S. Recent advances in the antiproliferative and proapoptotic activity of various plant extracts and constituents against murine malignant melanoma［J］. Molecules， 2022，27（8）：2585.

[3] Tietze JK. Tumorinfiltrierende T‑zellen und natürliche killerzellen im melanom ［Tumor‑infiltrating natural killer and T cells in melanoma］［J］. Dermatologie （Heidelb）， 2022，73（12）：929‑936.

[4] 邹锐涛，蔡桂月，谢嘉豪，等. CD8⁺与CD4⁺ T细胞遏制黑色素瘤的相关机制研究进展［J］. 皮肤性病诊疗学杂志，2020，27（6）：451‑454，459.

[5] Zou RT， Cai GY， Xie JH， et al. Research progress on the mechanisms of CD8⁺ and CD4⁺ T cells in inhibiting melanoma ［J］. J Diag Ther Dermato‑Venered，2020，27（6）：451‑454，459.

[6] Feng G， Li D， Liu J， et al. The herbal combination of radix astragali， radix angelicae sinensis， and caulis lonicerae regulates the functions of type 2 innate lymphocytes and macrophages contributing to the resolution of collagen‑induced arthritis［J］. Front Pharmacol， 2022，13：964559.

[7] 张译丹，薛凯元，孙起超，等.中医药调节肠道微生态维持Th17/Treg平衡防治银屑病的机制［J］.生命的化学， 2025，45（1）：25‑34.

[8] Zhang YD， Xue KY， Sun QC， et al. Mechanisms of traditional chinese medicine in regulating gut microbiota to maintain Th17/Treg balance for the prevention and treatment of psoriasis［J］. Chem Life， 2025，45（1）：25‑34.

[9] 何天富，陈洪涛，陈晓艺，等.壮药复方扶芳藤合剂技术提升及再评价研究进展［J］.中国当代医药，2021，28（18）：30‑35.

[10] He TF， Chen HT， Chen XY， et al. Research progress on technology improvement and re‑evaluation of Zhuang medicine compound Fufangteng mixture［J］. Contemporary Med Chin，2021，28（18）：30‑35.

[11] 吴玲玲，陈继冰，蒋鹏，等.复方扶芳藤合剂含药血清促进骨髓间充质干细胞增殖的作用机制［J］.器官移植，2022，13（3）：363‑370.

[12] Wu LL， Chen JB， Jiang P， et al. Mechanism of compound fufangteng mixture‑containing serum in promoting the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells［J］. Organ Transplantat， 2022， 13（3）： 363‑370.

[13] 唐红珍，张曼，黄宏妙，等.复方扶芳藤合剂对亚急性衰老模型小鼠免疫功能的影响［J］.中国老年学杂志，2016，36（24）：6095‑6096.

[14] Tang HZ， Zhang M， Huang HM， et al. Effects of compound fufangteng mixture on the immune function of subacute aging model mice［J］. Chin J Gerontol， 2016， 36（24）： 6095‑6096.

[15] 覃秋珍，蔡丹昭，温奇龙，等. 扶芳藤提取物抗HIV‑1活性及作用机制［J］. 中国热带医学，2024，24（8）：967‑971，1005.

[16] Qin QZ， Cai DZ， Wen QL， et al. Anti‑HIV‑1 activity and mechanism of euonymus fortunei extract［J］. Chin Tropical Med， 2024， 24（8）： 967‑971， 1005.

[17] Li Yue. Research progress on the prevention and treatment of aids with traditional chinese medicine［J］. Int J Front Med，2022，4（5）： 5‑10.

[18] 洪译，王真权，罗雯鹏.复方芩柏颗粒对溃疡性结肠炎大鼠Th1/Th2、Th17/Treg细胞稳态影响［J］.环球中药，2024，17（4）：565‑571.

[19] Hong Y， Wang ZQ， Luo WP. Effects of compound qinbai granules on the balance of Th1/Th2 and Th17/Treg cells in rats with ulcerative colitis［J］. Global Tradit Chin Med， 2024， 17（4）： 565‑571.

[20] 丁波，李智敏，李雅莉，等.复方芩兰口服液联合乙酰半胱氨酸治疗小儿支气管肺炎临床疗效及对Th1/Th2、免疫球蛋白水平的影响［J］.微循环学杂志，2023，33（2）：74‑79.

[21] Ding B， Li ZM， Li YL， et al. Clinical efficacy of compound qinlan oral liquid combined with acetylcysteine in the treatment of bronchial pneumonia in children and its effects on Th1/Th2 and immunoglobulin levels［J］. J Microcirculat， 2023， 33（2）： 74‑79.

[22] 朱凤，韦春珠，范恒，等.复方苦参汤通过调节肠道Th1及Th17细胞分化缓解溃疡性结肠炎肠道损伤［J］.华中科技大学学报（医学版），2022，51（2）：146‑151.

[23] Zhu F， Wei CZ， Fan H， et al. Compound kushen decoction alleviates intestinal injury in ulcerative colitis by regulating the differentiation of intestinal Th1 and Th17 Cells［J］. J Huazhong Univ Sci Technol （Med Sci）， 2022， 51（2）： 146‑151.

[24] Ahmadzadeh F， Esmaili M， Ehsan Enderami S， et al. Epigallocatechin‑3‑gallate maintains Th1/Th2 response balance and mitigates type‑1 autoimmune diabetes induced by streptozotocin through promoting the effect of bone‑marrow‑derived mesenchymal stem cells［J］. Gene， 2024，894：148003.

[25] Abromson‑Leeman S， Bronson RT， Dorf ME. Encephalitogenic T cells that stably express both T‑bet and RORγt consistently produce IFN gamma but have a spectrum of IL‑17 profiles［J］. J Neuroimmunol， 2009，215（1‑2）：10‑24.

[26] 董明治，吴敏芳.成人急性髓性白血病患者血清Th1/Th2型细胞因子、PCT、CRP检测及其临床意义［J］.海南医学，2024，35（22）：3284‑3288.

[27] Dong MZ， Wu MF. Detection of Th1/Th2 cytokines， PCT， and CRP in serum of patients with adult acute myeloid leukemia and their clinical significance［J］. Hainan Med J， 2024， 35（22）： 3284‑3288.

[28] 陈颖，丁妍，初晓玲，等.华蟾素胶囊联合TP方案对晚期卵巢癌患者Th1/Th2细胞因子、血管生长因子及细胞凋亡调控因子的影响［J］.现代生物医学进展，2024，24（20）：3851‑3853.

[29] Chen Y， Ding Y， Chu XL， et al. Effects of cinobufacini capsules combined with TP regimen on Th1/Th2 Cytokines， vascular growth factors， and apoptosis regulatory factors in patients with advanced ovarian cancer［J］. Progress Mod Biomed， 2024， 24（20）： 3851‑3853.

[30] 王卓亚，李长凤，田开莉.培土固肾汤联合西药治疗黄体功能不全型先兆流产的保胎效果及对血清性激素、Th1/Th2细胞因子水平的影响［J］.辽宁中医杂志，2024，51（9）：98‑101.

[31] Wang ZY， Li CF， Tian KL. Effects of peitu guishen decoction combined with western medicine on the fetal preservation in patients with threatened abortion due to luteal insufficiency and its impact on serum sex hormones and Th1/Th2 cytokine levels［J］. Liaoning J Tradit Chin Med， 2024， 51（9）： 98‑101.

[32] 姜枫.从CD4⁺、CD8⁺ T细胞免疫活化分子及其上游调控因子表达探究健脾祛湿法治疗艾滋病免疫调节机制［D］.南宁：广西中医药大学，2019.

[33] Jiang F. Investigating the immunomodulatory mechanisms of invigorating spleen and eliminating dampness therapy in aids treatment through the expression of CD4⁺ and CD8⁺ T cell immune activation molecules and their upstream regulatory factors［D］. Nanning：Guangxi University of Chinese Medicine， 2019.

[34] 魏昌然.乳康饮活化Vγ9Vδ2‑T细胞治疗三阴性乳腺癌的作用研究［D］.济南：山东中医药大学，2022.

[35] Wei CR. Research on the role of rukangyin in activating Vγ9Vδ2‑T cells for the treatment of triple‑negative breast cancer［D］. Jinan：Shandong University of Traditional Chinese Medicine， 2022.

[36] 沈晗，聂建云，胡杨朔，等.益气补血方对化疗后小鼠T淋巴细胞增殖能力及细胞因子IL‑2和IL‑6分泌的影响［J］.中药材，2013，36（2）：287‑291.

[37] Shen H， Nie JY， Hu YS， et al. Effects of yiqi buxue prescription on the proliferation of T lymphocytes and the secretion of cytokines IL‑2 and IL‑6 in mice after chemotherapy［J］. Chin Med Material， 2013， 36（2）： 287‑291.

[38] 杨玉洁，朱中博，张艳美，等.急性肺损伤对大鼠脾T细胞凋亡的影响及益肺健脾方的干预作用研究［J］.中国实验动物学报，2024，32（9）：1160‑1170.

[39] Yang YJ， Zhu ZB， Zhang YM， et al. Effects of acute lung injury on apoptosis of spleen T cells in rats and the interventional role of yifei jianshuo prescription［J］. Chin J Laboratory Animal Sci， 2024，32（9）： 1160‑1170.

[40] 朱闽.基于IL‑6‑JAK2‑STAT3通路探讨前列消汤调控自身免疫性前列腺炎CD4⁺ T细胞凋亡的研究［D］.南宁：广西中医药大学，2022.

[41] Zhu M. Research on the regulation of CD4⁺ T cell apoptosis in autoimmune prostatitis by qianlie xiaotang based on the IL‑6‑JAK2‑STAT3 pathway［D］. Nanning：Guangxi University of Chinese Medicine， 2022.

[42] 李媛，龙富立，张衎，等.健肝颗粒诱导线粒体自噬抑制乙肝肝硬化CD4⁺ T细胞凋亡［J］.实用医学杂志，2021，37（15）：1921‑1927.

[43] Li Y， Long FL， Zhang K， et al. Induction of mitochondrial autophagy by jian gan granules to inhibit apoptosis of CD4⁺ T cells in hepatitis B cirrhosis［J］. J Practical Med， 2021， 37（15）： 1921‑1927.

[44] 陈思言.青蒿琥酯片干预HAART后免疫重建不良患者的临床研究［D］.广州：广州中医药大学，2021.

[45] Chen SY. Clinical research on the intervention of artesunate tablets in patients with immune reconstitution failure after HAART［D］. Guangzhou：Guangzhou University of Chinese Medicine， 2021.

基金资助

国家自然科学基金地区科学基金(82460863)

广西自然科学基金面上项目(2025GXNSFAA069826)

广西自然科学基金面上项目(2020GXNSFAA297162)

广西中医药大学青年研究创新团队项目(2023TD001)

广西中医药大学高层次人才培育创新团队项目(2022B006)

广西自然科学基金青年科学基金(2020GXNSFBA159064)

广西中医药大学大学生创新创业训练计划项目(S202310600083)

广西中医药大学大学生创新创业训练计划项目(S202310600117)