圣和散激活FoxO3a增强人恶性胶质母细胞瘤放疗敏感性的机制

Mechanism of Shenghe Powder enhancing radiotherapy sensitivity for human malignant glioblastoma through activiating FoxO3a

摘要

目的 探究圣和散（Shenghe Powder， SHP）通过FoxO3a信号通路增强人恶性胶质母细胞瘤U251细胞放疗敏感性的作用机制。 方法 以U251 细胞为研究对象，设置正常对照（Control）组、SHP组、阴性对照（SHP+si‑NC）组、敲低FoxO3a（SHP+si‑FoxO3a）组，并利用6 MV X线对细胞进行单次剂量为5 Gy照射。采用Western blot、免疫荧光染色、CCK‑8、Edu、流式细胞术、肿瘤干细胞成球法进行检测。通过建立荷瘤裸鼠模型检测瘤体变化，免疫组化检测肿瘤组织相关蛋白。 结果 与Control组相比，SHP组细胞的BNIP3、FoxO3a蛋白表达明显升高，p‑FoxO3a蛋白表达明显降低（P<0.01）；SHP组细胞FoxO3a的红色荧光强表达于细胞核内（P<0.001）；SHP组细胞BNIP3的绿色荧光强表达在线粒体膜上（P<0.001）。SHP +si‑FoxO3a组细胞活力、阳性细胞率、细胞迁移和侵袭数量、细胞成球数量明显高于SHP+si‑NC组，细胞凋亡率明显低于SHP+si‑NC组（P<0.01）；SHP+si‑FoxO3a组细胞的Cl‑caspase3、Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BNIP3、FoxO3a蛋白表达量明显低于SHP+si‑NC组，p‑FoxO3a蛋白表达量明显高于SHP+si‑NC组（P<0.01）。与Control组相比，SHP组的肿瘤生长缓慢；与SHP+si‑NC组相比，SHP+si‑FoxO3a组的肿瘤生长缓慢。与Control组相比，SHP组肿瘤体积和重量明显减少；与SHP+si‑NC组相比，SHP+si‑FoxO3a组肿瘤体积和重量明显增加（P<0.01）。与Control组比较，SHP组肿瘤组织中Cl‑caspase3、Beclin1、BNIP3蛋白表达明显增加（P<0.01），p‑FoxO3a蛋白表达明显降低（P<0.01）；与SHP+si‑NC组相比，SHP+si‑FoxO3a组肿瘤组织中Cl‑caspase3、Beclin1、BNIP3蛋白表达明显降低（P<0.01），p‑FoxO3a蛋白表达明显增加（P<0.001）。 结论 细胞实验表明SHP通过诱导FoxO3a去磷酸化向细胞核转位，BNIP3转位至线粒体膜，增强了FoxO3a‑BNIP3信号通路；敲低FoxO3a后逆转了SHP对胶质瘤U251细胞放射敏感性的增强作用；体内实验结果也验证SHP通过FoxO3a‑BNIP3通路增强人恶性胶质母细胞瘤U251细胞的放疗敏感性。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of Shenghe Powder （SHP） in enhancing the radiotherapy sensitivity of human malignant glioblastoma U251 cells through the FoxO3a signaling pathway. Methods U251 cells were taken as the research subject， and the normal control （Control） group， SHP group， negative control （SHP+si‑NC） group， and knockdown FoxO3a （SHP+si‑FoxO3a） group were set up， and the cells were irradiated with a single dose of 5 Gy 6 MV X‑ray. Western blot， immunofluorescence staining， CCK‑8， Edu， flow cytometry， and cancer stem cell spheroidization were used for detection. Through establishing a tumor‑bearing nude mouse model， tumor changes were detected， and tumor tissue‑related proteins were detected by immunohistochemistry. Results Compared to the Control group， the expressions of BNIP3 and FoxO3a proteins of cells in the SHP group were increased， and the expression of p‑FoxO3a protein was decreased （P<0.01）. The red fluorescence of FoxO3a in the SHP group cells was strongly expressed in the nucleus （P<0.001）. The green fluorescence of BNIP3 was strongly expressed on the mitochondrial membrane in the SHP group cells （P<0.001）. The cell viability， positive cell rate， number of cell migration and invasion， and spheroidal number of cells in the SHP+si‑FoxO3a group were significantly higher than those in the SHP+si‑NC group， and the apoptosis rate was significantly lower than that in the SHP+si‑NC group （P<0.01）. The expressions of Cl‑caspase3， Beclin1， LC3Ⅱ/LC3Ⅰ， BNIP3， and FoxO3a proteins in the SHP+si‑FoxO3a group cells were significantly lower than those in the SHP+si‑NC group， and the expression of p‑FoxO3a protein was significantly higher than that in the SHP+si‑NC group （P<0.01）. Tumors grew slowly in the SHP group compared to the Control group； Tumor growth was slower in the SHP+si‑FoxO3a group compared to the SHP+si‑NC group. Compared to the Control group， the volume and weight of tumors in the SHP group were significantly reduced； Compared to the SHP+si‑NC group， the tumor volume and weight of the SHP+si‑FoxO3a group were significantly increased （P<0.01）. Compared to the Control group， the tumor tissue expression of Cl‑caspase3， Beclin1， and BNIP3 proteins in the SHP group was significantly increased （P<0.01）， and the expression of p‑FoxO3a protein was significantly decreased （P<0.01）. Compared to the SHP+si‑NC group， the tumor tissue expression of Cl‑caspase3， Beclin1， and BNIP3 proteins in the SHP+si‑FoxO3a group was significantly reduced （P<0.01）， and the expression of p‑FoxO3a protein was significantly increased （P<0.001）. Conclusion Cellular experiments shows that SHP enhances the FoxO3a‑BNIP3 signaling pathway by inducing FoxO3a dephosphorylation to the nucleus， and BNIP3 translocation to the mitochondrial membrane. Knockdown of FoxO3a reverses the enhanced effect of SHP on the radiosensitivity of glioma U251 cells. In vivo experiments also confirm that SHP enhances the radiotherapy sensitivity of human malignant glioblastoma U251 cells through the FoxO3a‑BNIP3 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

胶质母细胞瘤 / 放射抵抗 / FoxO3a / 圣和散（SHP）

Key words

Glioblastoma / Tumor radiation resistance / FoxO3a / Shenghe Powder （SHP）

恶性脑胶质瘤是原发于中枢神经系统常见的恶性肿瘤，具有恶性度高、侵袭性强，手术难以彻底切除，预后极差等特点^［1］，联合放疗是目前治疗恶性脑胶质瘤的主要手段，但放疗后肿瘤未得到控制，复发率仍很高^［2，3］。中医药在恶性脑胶质瘤放疗中可发挥增效减毒作用，通过多靶点调控肿瘤微环境、抑制放疗后DNA修复逃逸机制，同时缓解放射性损伤引起的炎性反应及血脑屏障破坏，为改善肿瘤局部控制率及延缓复发转移提供潜在策略。

圣和散（Shenghe Powder，SHP）是临床治疗脑胶质瘤放射抵抗有效的经验方，至今应用已经有十余年^［4］。方中以党参、炒白术、薏苡仁健脾益气，太子参、玄参益气养阴，肉苁蓉温阳补元，共同培补正气不足；土元破瘀散结，白花蛇舌草、蟾酥解毒散结，共除瘀血，破凝滞。全方诸药配伍共奏补益扶正，祛瘀除滞，能很好地防治恶性肿瘤。前期的实验研究与临床应用显示SHP能明显提高脑胶质瘤、乳腺癌、食管癌等多种恶性肿瘤放射治疗效果^［4‑8］。

前期研究表明SHP可以通过增强胶质瘤U251细胞的自噬作用治疗脑胶质瘤放射抵抗^［8］，但是自噬通路尚不清楚。前期预实验提示：SHP联合高剂量射线辐射能促使胶质瘤U251细胞FoxO3a去磷酸化（p‑FoxO3a），发生核转位，BNIP3激活并转位至线粒体膜，自噬相关基因LC3Ⅱ、Beclin1表达逐渐增强；可见FoxO3a、BNIP3激活转位可提高胶质瘤干细胞的自噬死亡水平。本研究通过体内、外实验，拟从FoxO3a‑BNIP3信号通路探索SHP增强人恶性胶质母细胞瘤U251细胞放疗敏感性的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞与动物

实验用细胞为人恶性胶质母细胞瘤细胞株U251，购于中科院上海细胞所。SD大鼠、Balb/c裸鼠购于西安交通大学动物实验中心，实验单位使用许可证号：SYXK（陕）2020‑005，动物实验通过山西中医药大学实验动物伦理委员会伦理审查（2021DW137）。

1.1.2 药物

SHP组成：党参9 g，太子参6 g，玄参8 g，白花蛇舌草30 g，炒白术12 g，土鳖虫6 g，薏苡仁30 g，肉苁蓉3 g，蟾酥0.2 g，甘草6 g。实验用药由山西中医药大学中药鉴定教研室张朔生教授鉴定为正品，药物经多酶乳化流程水提法提取^［7］，生药含量为3.5 g/mL。

1.1.3 试剂及仪器

HRP‑conjugated Goat Anti‑ Rabbit IgG（H+L）（武汉三鹰公司，批号：SA00001‑2）；ECL发光底物检测试剂盒（西安晶彩公司，批号：JC‑PC001‑10）；多聚甲醛（北京BioSharp公司，批号：BL539A）；0.25% Trypsin（1×）（美国HyClone公司，批号：J180025）；BSA（美国VWR公司，批号：0332‑100G）；DAB显色液（北京中杉金桥供公司，批号：ZLI‑9017）；TEMED （美国Sigma公司，批号：T8133）；抗体［Phospho‑FoxO3a（Ser253）（批号：AF3020）、FoxO3（批号：AF6020）、Beclin1（批号：AF5128）、Cleaved‑Caspase3（Asp175）（批号：AF7022）、β‑actin（批号：AF7018）］购于澳大利亚Affinity公司；BNIP3（美国Proteintech公司，批号：68091‑1‑Ig）；BCA蛋白定量试剂盒（批号：Top1003）、TritonX‑100（批号：90002‑93‑1）购于北京Biotopped公司；RIPA细胞裂解液（北京Bioworld公司，批号：BD0032）；Mito‑Tracker Deep Red FM（批号：C1032‑50 μg）、抗荧光淬灭剂（含DAPI）（批号：P0131‑25 mL）、BeyoClick™Edu‑488细胞增殖检测试剂盒（批号：C0071S）、AnnexinV‑FITC细胞凋亡检测试剂盒（批号：C1062）、胰岛素（批号：P3376‑100IU）、质粒购于上海碧云天公司；B27（50×）（批号：17504‑044）、重组表皮生长因子（EGF，批号：PHG0311）、碱性成纤维生长因子（bFGF，批号：13256‑029）购于美国Gbico公司。

CO₂细胞培养箱（美国赛默飞公司，型号：Thermofisher371）；Western blot电泳仪（美国BioRad公司，型号：OtSD）；高速冷冻离心机（美国奥豪斯，型号：FC5515R）；酶标仪（美国BioTek公司，型号：BioTekGen5）；荧光显微镜（德国LEICA公司，型号：S/N479602）；倒置荧光显微镜（德国LEICA公司，型号：S/N479602）；高速冷冻离心机（美国奥豪斯公司，型号：FC5515R）；流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 细胞实验

1.2.1 含药血清的制备

采用SPF级雄性SD大鼠，体质量（200±20） g，制备含药血清，随机分为对照组与SHP组（n=10）。经1周环境适应后，参照体表面积剂量换算法^［9］设定给药方案：SHP组给予2.79 g·kg^‑1·d^‑1水提液（等效于成人剂量0.45 g·kg^‑1·d^‑1），对照组按等体积生理盐水灌胃，分早晚2次给药，连续干预10 d。末次给药后1 h行腹主动脉采血，血液样本静置30 min后以3 000 r/min离心15 min获取血清。血清经56 ℃水浴灭活30 min、0.22 μm微孔滤膜除菌后，分装保存于-80 ℃超低温冰箱。

1.2.2 细胞培养

U251细胞采用含10% FBS的DMEM高糖培养基，于37 ℃、5% CO₂条件下常规培养（隔日换液）。经0.25%胰酶消化传代3~4次后，选取对数生长期细胞开展后续实验。

1.2.3 细胞分组

U251细胞随机分为4组：（1）正常对照（Control）组：进行空白血清培养；（2）SHP组：弃原培养基，更换含成SHP药效成分的血清培养基，持续培养6 h；（3）阴性对照（SHP+si‑NC）组：采用脂质体法转染阴性对照siRNA（si‑NC）48 h后，更换成含药血清培养基孵育6 h；（4）敲低FoxO3a（SHP+si‑FoxO3a）组：转染FoxO3a特异性siRNA（si‑FoxO3a）48 h后，同法进行含药血清处理。各组细胞经上述处理后，统一接受5 Gy X射线辐射，继续培养2 h。

1.2.4 细胞转染方法

将生长状态良好的细胞接种6孔板，24 h弃培养基，PBS洗涤后换无血清培养基饥饿2 h。按lipo3000说明书制备转染液，加至各孔混匀，37 ℃培养6~8 h。弃液PBS清洗，换完全培养基续养24 h后收样检测转染有效。

1.2.5 Western blot检测相关蛋白

取各组细胞PBS漂洗后，RIPA裂解液冰浴裂解15 min，12 000 r/min离心取上清。BCA定量后等量蛋白与loading buffer混合煮沸变性，进行电泳。湿转法转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗（1∶500）室温孵育1 h，TBST洗膜后加HRP二抗（1∶5 000）反应1 h。ECL显影液浸润后化学发光成像。

1.2.6 免疫荧光染色激光共聚焦显微镜观察FoxO3a核转位

将各组细胞按5×10⁴/孔接种共聚焦皿，24 h后4%多聚甲醛固定15 min，0.1% TritonX‑100室温透化20 min。5% BSA封闭1 h，一抗（5% BSA稀释）4 ℃过夜。PBST清洗后加FITC二抗（5% BSA稀释）37 ℃避光反应2 h，DAPI染核5 min，荧光显微镜采集图像。

1.2.7 免疫荧光验证线粒体膜转位

将各组细胞以5×10⁴/孔接种共聚焦皿，培养24 h后弃去培养基。加入预配Mito‑Tracker工作液（按说明书配制），37 ℃避光孵育15 min。弃去工作液，更换预温（37 ℃）完全培养基，荧光显微镜下观察成像。

1.2.8 Edu检测细胞增殖

取各组细胞弃培养基，PBS洗涤后胰酶消化制备单细胞悬液，计数后按3×10⁴/孔（500 μL/孔）密度接种24孔板（5孔/组），常规培养过夜后用于Edu检测各组增殖活性。

1.2.9 平板克隆形成检测细胞增殖能力

取各组细胞弃培养基，PBS洗涤后胰酶消化制单细胞悬液。细胞计数后梯度稀释，按500个/皿接种6 cm²培养皿（含2 mL培养基），37 ℃培养2周（隔日换液）。待肉眼可见克隆形成终止培养，PBS洗涤2次，4%多聚甲醛固定15 min。0.5%结晶紫染色10 min，流水轻柔冲洗、晾干后拍照记录。

1.2.10 流式检测细胞凋亡

取各组细胞，195 μL Annexin V结合液重悬后依次添加5 μL Annexin V‑FITC（1∶500）与10 μL PI染液（1∶10），避光反应10 min，冰浴后行流式细胞术检测。

1.2.11 肿瘤干细胞成球实验

取各组细胞离心收集，PBS洗涤2次。计数后按500细胞/孔接种6孔超低吸附板，每日镜检观察并记录细胞成球动态。

1.3 动物实验

1.3.1 实验动物

取24只5周龄雌性裸鼠，体质量（20±2） g，SPF级环境饲养（26 ℃恒温），高压灭菌饲养器具，每周更换灭菌垫料及饮食。耳标标记个体后，将“1.2.3”项下细胞，于右腋皮下接种5×10⁶细胞/100 μL（分为Control组、SHP组、SHP+si‑NC组、SHP+si‑FoxO3a组），常规饲养并定期观察成瘤情况。

1.3.2 绘制肿瘤体积生长曲线

实验动物接种后常规饲养，监测成瘤时间。每5日游标卡尺测量瘤体长径（a）、短径（b），按V=1/6πab²公式计算体积，绘制时序性生长曲线动态记录肿瘤进展。

1.3.3 瘤体测量

接种5周后行颈椎脱臼处死裸鼠，完整剥离瘤体拍照称重，记录各组肿瘤质量。

1.3.4 免疫组化检测肿瘤组织中Cl‑caspase3、Beclin 1、BNIP3、p‑FoxO3a蛋白表达

将肿瘤组织经4%多聚甲醛固定、梯度脱水及常规石蜡包埋后备制4 μm切片。脱蜡水化后行EDTA抗原热修复，3% H₂O₂处理10 min消除内源酶。5%山羊血清封闭1 h，滴加一抗（5% BSA稀释）4 ℃湿盒过夜。次日37 ℃孵育二抗2 h，DAB显色控制反应终点，苏木素复染核，梯度乙醇脱水透明后固定封片，显微镜下分析染色结果。

1.4 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量资料以\overline{x}\pm s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD‑t检验；P<0.05为差异具有统计学意义。应用GraphPad Prism和ImageJ进行数据分析绘图。

2 结果

2.1 SHP对放射后胶质瘤U251细胞FoxO3a、BNIP3蛋白及转位的影响

Western blot结果显示，与Control组相比，SHP组的细胞BNIP3、FoxO3a蛋白表达含量明显升高（P<0.01）、p‑FoxO3a蛋白表达含量明显下降（P<0.01），见图1A。免疫荧光染色激光共聚焦显微镜观察FoxO3a核转位结果显示，与Control组相比，SHP组细胞FoxO3a的红色荧光在细胞核内明显增强（P<0.001），见图1B，观察到FoxO3a转位至细胞核。免疫荧光验证线粒体膜转位实验结果显示，与Control组相比，SHP组细胞BNIP3的绿色荧光强度在线粒体膜上明显增强（P<0.001），见图1C，观察到BNIP3转位至线粒体膜。以上研究结果表明，SHP通过诱导FoxO3a去磷酸化向细胞核转位，BNIP3向线粒体膜转位，增强了胶质瘤U251细胞的放疗敏感性。

2.2 敲低FoxO3a后SHP对胶质瘤U251细胞活力、增殖、凋亡的影响

CCK‑8实验检测细胞活力结果显示，与Control组相比，SHP组细胞活力明显降低（P<0.001）；与SHP+si‑NC组相比，SHP+si‑FoxO3a组细胞活力明显升高（P<0.001），见图2A。Edu检测细胞增殖结果显示，与Control组相比，SHP组阳性细胞率明显降低（P<0.001）；与SHP+si‑NC组相比，SHP+si‑FoxO3a组阳性细胞率明显上升（P<0.01），见图2B。细胞克隆形成实验结果显示，与Control组相比，SHP组细胞迁移和侵袭数量明显减少（P<0.01）；与SHP+si‑NC组相比，SHP+si‑FoxO3a组细胞迁移和侵袭数量明显增加（P<0.001），见图2C。流式检测细胞凋亡结果显示，与Control组相比，SHP组细胞凋亡率明显升高（P<0.05）；与SHP+si‑NC组相比，SHP+si‑FoxO3a组细胞凋亡率明显降低（P<0.05），见图2D。细胞成球实验结果显示，与Control组相比，SHP组细胞成球数量明显减少（P<0.01）；与SHP+si‑NC组相比，SHP+si‑FoxO3a组细胞成球数量明显增加（P<0.01），见图2E。以上实验结果显示，在敲低FoxO3a信号后，SHP增强了胶质瘤U251细胞的活力和增殖、抑制了细胞凋亡，表明敲低FoxO3a信号后，SHP对胶质瘤U251细胞放射敏感性降低。

2.3 敲低FoxO3a信号后SHP对U251细胞中Cl‑caspase3、Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BNIP3、FoxO3a、p‑FoxO3a 蛋白的影响

Western blot结果显示，与Control组相比，SHP组细胞中的Cl‑caspase3、 Beclin1、 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BNIP3、FoxO3a蛋白表达量明显升高（P<0.01），p‑FoxO3a蛋白表达量明显降低（P<0.01）；与SHP+si‑NC组相比，SHP+si‑FoxO3a组Cl‑caspase3、Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BNIP3、FoxO3a蛋白表达量明显降低（P<0.01），p‑FoxO3a蛋白表达量明显升高（P<0.01），见图3。敲低FoxO3a信号后，SHP降低了胶质瘤U251细胞中Cl‑caspase3、Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BNIP3、FoxO3a蛋白表达，增强了p‑FoxO3a蛋白表达，表明SHP通过FoxO3a‑BNIP3信号通路增强胶质瘤U251细胞对放射的敏感性。

2.4 敲低FoxO3a信号后SHP对荷瘤裸鼠肿瘤及肿瘤组织中Cl‑caspase3、Beclin1、BNIP3、p‑FoxO3a蛋白的影响

瘤肿生长曲线显示：与Control组相比，SHP组的肿瘤生长缓慢；与SHP+si‑NC组相比，SHP+si‑FoxO3a组的肿瘤生长缓慢（P<0.01），见图4A。移植瘤大小结果显示：与Control组相比，SHP组肿瘤体积明显减小，且肿瘤重量明显减小；与SHP+si‑NC组相比，SHP+si‑FoxO3a组肿瘤体积明显增加，且肿瘤重量明显增加（P<0.01），见图4B、C。免疫组化结果显示，与Control组比较，SHP组肿瘤组织中Cl‑caspase3、Beclin1、BNIP3蛋白表达结果明显增加（P<0.01），p‑FoxO3a蛋白表达结果明显降低（P<0.01）；与SHP+si‑NC组相比，SHP+si‑FoxO3a组肿瘤组织中Cl‑caspase3、Beclin1、BNIP3蛋白表达结果明显降低（P<0.01），p‑FoxO3a蛋白表达结果明显增加（P<0.001），见图4D。以上实验结果显示，在敲低FoxO3a信号后，SHP增加了裸鼠肿瘤的体积、重量及生长速度，降低了肿瘤组织中Cl‑caspase3、Beclin1、BNIP3蛋白表达，增强了p‑FoxO3a蛋白表达，表明SHP通过FoxO3a‑BNIP3信号通路增强了荷瘤裸鼠对放射的敏感性。

3 讨论

脑胶质瘤是成人中枢神经系统发病率最高的原发恶性肿瘤，年发病率约为6.4/10万，其中世界卫生组织数据显示Ⅳ级胶质母细胞瘤发病率最高约为4.03/10万，占所有中枢神经系统原发恶性肿瘤的50.1%^［10］。尽管目前已有包括手术切除、放疗及化疗在内的多种治疗方案，患者生存期仍较短。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号是控制细胞自噬的主要信号途径，mTOR介导的辐射效应受其上游磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）和磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP‑dependent/activated protein kinase，AMPK）通路双重调节^［11］。FoxO3a作为mTOR信号通路下游的关键转录因子，在胶质瘤自噬调控中呈现动态双向调节特性。研究表明，辐射或化疗诱导的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可通过激活PI3K/Akt通路，磷酸化的FoxO3a滞留于胞质，从而抑制其对自噬相关基因如ULK1、LC3、BNIP3等蛋白的转录激活，从而阻断保护性自噬，其去磷酸化后入核可激活凋亡及自噬相关基因^［12］。AMPK被激活时，其磷酸化FoxO3a的Ser413位点或去磷酸化其他抑制性位点，可增强FoxO3a核转位，进而上调促生存基因以缓解氧化应激^［13］。在PI3K/Akt持续激活的胶质瘤中，FoxO3a的促自噬功能被Akt依赖性磷酸化抑制，可能导致自噬失衡，这可能部分解释肿瘤对放化疗的抵抗性^［14］。由于FoxO3a能激活自噬相关基因，所以它与自噬存在交叉调控关系。而自噬在放疗中的双重作用，使得FoxO3a与自噬的交叉调控有可能成为突破放疗抵抗的新靶点。本研究通过体内外实验发现SHP通过FoxO3a‑BNIP3信号通路协调自噬与凋亡，从而增强胶质母细胞瘤放疗敏感性。

3.1 SHP通过FoxO3a‑BNIP3信号增强了对胶质瘤U251细胞的放疗敏感性

FoxO3a是Fork head（Fox）家族中重要的转录因子，参与细胞周期、DNA损伤后修复、凋亡、自噬等多种信号转导及调控^［15］。其活性受磷酸化状态为动态调节：氧化应激可触发FoxO3a去磷酸化，促使其向细胞核转位并激活下游靶基因。研究结果显示，SHP通过抑制溶酶体相关蛋白LAMP2的表达^［7，8］，削弱细胞自噬对ROS的清除能力，导致放疗诱导的ROS在胞内持续累积。过量ROS可攻击DNA、蛋白质及脂质等生物大分子，引发不可逆的氧化损伤。同时，SHP明显抑制 DNA‑PKcs的表达^［8］，并通过上调核苷酸切除修复交叉互补基因1（ERCC1）启动子甲基化水平，双重阻断胶质瘤细胞的DNA修复能力，从而放大放疗的细胞毒性效应。在SHP联合高剂量辐射干预下，p‑FoxO3a明显降低，促使其从胞质转位至细胞核。入核后，核内FoxO3a可上调BNIP3的表达^{［16，17］}。BNIP3作为线粒体外膜蛋白，通过破坏Bcl‑2家族蛋白复合体诱导线粒体通透性转换，激活caspase依赖性凋亡；同时，BNIP3可诱导保护性自噬向过度自噬性死亡转化^{［18‑21］}。Western blot结果显示，SHP干预后总FoxO3a蛋白表达量明显增加，而p‑FoxO3a水平下降。这一现象与FoxO3a经典调控机制一致：去磷酸化使FoxO3a逃逸Akt等激酶的胞质锚定作用，核内富集的FoxO3a通过转录激活BNIP3靶基因，协同放疗诱导的ROS累积与DNA损伤，最终克服胶质瘤的放化疗抵抗。

本研究证实，中药复方SHP通过调控FoxO3a‑ BNIP3信号通路明显增强胶质瘤U251细胞的放疗敏感性。SHP处理诱导FoxO3a发生去磷酸化修饰并核转位，同时促进其下游靶标BNIP3蛋白表达量上调并转位至线粒体膜。细胞实验显示，SHP明显抑制U251细胞活力、克隆形成能力，并诱导细胞凋亡率升高。裸鼠移植瘤模型中，SHP组瘤体体积及重量明显降低。并且在敲低FoxO3a表达后，SHP的放疗增敏效应被完全逆转：与SHP+si‑NC组相比，SHP+si‑FoxO3a组细胞活力增强，凋亡率下降，且瘤体体积及重量明显回升。上述结果表明，FoxO3a‑BNIP3信号通路是SHP增强胶质瘤放疗敏感性的核心分子靶点，为临床应用SHP增强脑胶质瘤放疗敏感性提供分子依据。

3.2 SHP通过FoxO3a‑BNIP3信号通路增强了对胶质瘤U251细胞的自噬与凋亡

在肿瘤放疗过程中，自噬与凋亡之间的交互调控机制是决定放疗疗效的关键因素。Caspase3原本以无活性的酶原形式存在于细胞内，当细胞接收到凋亡信号启动凋亡程序时，它会被激活并裂解形成有活性的Cl‑caspase3，Cl‑caspase3是执行细胞凋亡过程的关键蛋白之一。Beclin1是参与自噬的重要基因之一， 其表达水平直接影响自噬的启动和进程。LC3Ⅰ是LC3蛋白的初始形式，定位在胞质中。当自噬发生启动时，LC3Ⅰ会经过一系列修饰加工，与磷脂酰乙醇胺结合，进而转变为LC3Ⅱ。LC3Ⅱ能特异性地结合到自噬体膜上，故LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可作为自噬活性的一个重要检测指标。其比值升高，往往意味着自噬活动增强；反之，比值降低一般代表自噬水平下降。

Western blot分析结果显示，经SHP处理后，胶质瘤U251细胞中FoxO3a总蛋白、BNIP3、自噬标志物Beclin‑1以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值明显上调。同时，p‑FoxO3a被抑制，并且凋亡执行蛋白Cl‑caspase3得到了激活。在对FoxO3a进行siRNA敲低处理后，SHP的调节效应受到了明显的逆转：在SHP+si‑FoxO3a组中，BNIP3、Beclin‑1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Cl‑caspase3的表达量较SHP+si‑NC组明显降低，这表明FoxO3a能直接调控BNIP3的转录，并且推动自噬与凋亡的协同激活。在裸鼠移植瘤模型中，SHP+si‑FoxO3a组的肿瘤组织免疫组化结果显示：BNIP3、Beclin‑1及Cl‑caspase3的表达明显下调，而p‑FoxO3a的水平明显回升，这与细胞实验结果一致。FoxO3a通过去磷酸化激活BNIP3的转录，通过清除受损的线粒体以及诱导线粒体凋亡，增强了放疗的敏感性。在敲低FoxO3a表达后给予SHP干预后细胞凋亡水平明显降低，敲低FoxO3a会抑制BNIP3的转录，自噬的活动被中断，即使药物干预也无法恢复，从而明显抑制凋亡信号的执行，最终表现为细胞凋亡水平降低。上述数据揭示SHP通过FoxO3a‑BNIP3信号通路激活线粒体自噬（BNIP3），并且协同诱导caspase依赖性凋亡（Cl‑caspase3），形成双重抗肿瘤机制。同时，证明了FoxO3a是自噬和凋亡之间的核心枢纽，显示SHP通过激活FoxO3a‑BNIP3信号通路，同时协调自噬与凋亡，增强脑胶质瘤的放疗敏感性。

本研究表明，FoxO3a‑BNIP3信号通路在胶质瘤中发挥着调节放疗敏感性的作用，具体通过整合自噬和凋亡信号，为SHP靶向“自噬‑凋亡平衡”以增强脑胶质瘤放疗敏感性提供了科学依据。今后应该继续研究SHP中的活性成分对FoxO3a去磷酸化的直接影响，以及该信号通路在缺氧和免疫浸润等肿瘤微环境中的变化机制。这项研究的限制在于没有单独分析SHP中某一活性成分的作用靶点，未来需要通过成分筛选来确认关键的药效物质。

作者贡献度说明：

陈媛：实验实施、文稿撰写；樊凯芳：实验技术指导；岳小楠、王腾岳：数据分析；赵铭岳、卢长青：样本收集、文稿审校；王欢：实验设计。

所有作者声明本文不存在利益冲突。

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基金资助

山西省基础研究计划(20210302123230)