lncRNA CASC2靶向miR‑K11‑3p调控内皮细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭

lncRNA CASC2 regulating the proliferation, apoptosis, migration, and invasion of endothelial cells through targeting miR‑K11‑3p

摘要

目的 公认的并广泛用于卡波西肉瘤研究的细胞株是人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），研究长链非编码RNA癌易感性候选基因2（long non‑coding RNA cancer susceptibility candidate 2，lncRNA CASC2）靶向miR‑K11‑3p调控HUVECs增殖、凋亡、迁移和侵袭的分子机制。 方法 qPCR检测lncRNA CASC2的表达水平；生物信息学预测lncRNA CASC2与miR‑K11‑3p的靶向关系并用双荧光素酶实验及qPCR加以验证；CCK‑8实验检测细胞增殖水平；AnnexinV/Propidium Iodide实验检测细胞凋亡率；细胞划痕实验检测细胞迁移能力；Transwell实验检测细胞侵袭能力。 结果 pcDNA‑CASC2组CASC2的表达水平明显高于Control组及pcDNA3.1组（P<0.01）；lncRNA CASC2靶向负调控miR‑K11‑3p的表达（P<0.01）；lncRNA CASC2抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、降低细胞迁移及侵袭能力（P<0.01）；而外源回补miR‑K11‑3p可逆转lncRNA CASC2对内皮细胞的作用（P<0.01）。 结论 lncRNA CASC2通过下调miR‑K11‑3p的表达，可抑制HUVECs的增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。

Abstract

Objective The cell line recognized and widely used in Kaposi's sarcoma research is human umbilical vein endothelial cells （HUVECs），to explore the molecular mechanisms of long non‑coding RNA cancer susceptibility candidate 2 （lncRNA CASC2） on the proliferation， apoptosis， migration， and invasion of HUVECs by targeting miR‑K11‑3p. Methods qPCR was used to detect the expression level of lncRNA CASC2； the targeting relationship between lncRNA CASC2 and miR‑K11‑3p was predicted by bioinformatics and verified by double‑luciferase assay and qPCR； CCK‑8 assay was used to detect cell proliferation； AnnexinV/ Propidium Iodide assay was used to detect cell apoptosis rate； scratch assay was used to detect cell migration ability； Transwell assay was used to detect cell invasion ability. Results The expression level of CASC2 in the pcDNA‑CASC2 group was significantly higher than that in the Control group and pcDNA3.1 group （P<0.01）； lncRNA CASC2 negatively regulated the expression of miR‑K11‑3p （P<0.01）； lncRNA CASC2 inhibited cell proliferation， promoted cell apoptosis， and reduced cell migration and invasion ability （P<0.01）； exogenously overexpressed miR‑K11‑3p reversed the effects of lncRNA CASC2 on endothelial cells （P<0.01）. Conclusion LncRNA CASC2 can inhibit HUVECs' proliferation， migration and invasion， and promote cell apoptosis by down‑regulating the expression of miR‑K11‑3p.

Graphical abstract

关键词

长链非编码RNA癌易感性候选基因2（lncRNA CASC2） / miR‑K11‑3p / 人脐静脉内皮细胞（HUVECs） / 卡波西肉瘤

Key words

lncRNA CASC2 / miR‑K11‑3p / HUVECs / Kaposi's Sarcoma

卡波西肉瘤是由卡波西肉瘤病毒（Kaposi's sarcoma‑associated herpesvirus，KSHV）感染内皮细胞引起的血管异常增殖，伴侵袭转移的恶性肿瘤^［1，2］。在中国，大多数卡波西肉瘤发生在新疆，主要见于维吾尔族、哈萨克族。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度大于200 nt的非编码RNA，微小RNA（miRNA）是一类长度约为22 nt的RNA，研究表明lncRNA通过靶向miRNA在肿瘤中发挥重要作用^［3］。长链非编码RNA癌易感性候选基因2（long non‑coding RNA cancer susceptibility candidate 2，lncRNA CASC2）作为一种重要的抑癌因子，参与细胞的生长、迁移、侵袭等过程^［4］。本课题组前期研究发现，在卡波西肉瘤组织中检测到13条差异表达的KSHV miRNAs，其中miR‑K11‑3p表达明显上调^［5］。miR‑K11‑3p在转录后下调与天然免疫有关的IKKε的表达，稳定KSHV在宿主中的潜伏感染^［6］。生物信息学预测lncRNA CASC2与miR‑K11‑3p具有靶向关系。自从卡波西肉瘤细胞株被证实为肾癌细胞来源后，目前公认的并广泛用于卡波西肉瘤研究的细胞株是人脐静脉内皮细胞（HUVECs）^［7‑9］。本文研究lncRNA CASC2与miR‑K11‑3p的靶向调控关系，及其对内皮细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，旨在为治疗卡波西肉瘤提供有效的药物靶点。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

HUVECs购自美国ScienCell生物公司；293T细胞购自美国Open Biosystems公司；Trizol购自美国Ambion公司；SYBR FAST qRT‑PCR Master Mix购自美国KAPA Biosystems公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；RIPA裂解液购自上海Beyotime生物技术有限公司；FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2试剂购自南京Vazyme公司；双荧光素酶检测试剂盒购自上海Beyotime生物技术有限公司；CCK‑8检测试剂盒购自武汉Bioswamp公司；AnnexinV/Propidium Iodide（Annexin V/PI）凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；细胞侵袭检测试剂盒购自上海Beyotime生物技术有限公司；lncRNA CASC2过表达质粒（pcDNA‑CASC2）、空载质粒（pcDNA3.1）、miR‑ K11‑3p模拟物（mimics）、mimics阴性对照（negative control，NC）、CASC2‑野生型（wild type，WT）、CASC2‑突变型（mutant type，MUT）购自武汉科拜生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 生物信息学分析筛选miR‑K11‑3p相关的lncRNA

使用DIANA、lncRNASNP等lncRNA分析软件，结合lncRNA2Target v2.0和lncTarD数据库的预测结果，筛选miR‑K11‑3p相关lncRNA。

1.2.2 细胞培养及转染分组

将HUVECs按每孔5×10⁵细胞接种于6孔板中（细胞密度90%），培养24 h。使用Lipofectamine 2000将各实验组转染到HUVECs中，转染时间48 h。实时荧光定量PCR（qPCR）实验及细胞功能（细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移及细胞侵袭）实验分为3组：对照（Control）组、pcDNA3.1组、pcDNA‑CASC2组；细胞功能回补实验分为4组：pcDNA3.1组、pcDNA‑CASC2组、pcDNA‑CASC2+mimics NC组、pcDNA‑CASC2+miR‑K11‑3p mimics（pcDNA‑CASC2+mimics）组。将正常培养的细胞设为对照组。

1.2.3 双荧光素酶实验及分组

将CASC2‑WT、CASC2‑ MUT 3'UTR 扩增并构建 pYr‑mirTarget 重组质粒。脂质体2000将质粒、miR‑K11‑3p mimics及mimics NC共转染293T细胞。转染24 h后，使用双荧光素酶报告基因系统检测CASC2是否通过互补的结合位点与miR‑K11‑3p发生作用。实验分组：mimics+CASC2‑WT组、mimics+CASC2‑MUT组、mimics NC+CASC2‑WT组和 mimics NC+CASC2‑ MUT组。

1.2.4 qPCR检测

Trizol提取组织总RNA。SYBR FAST qPCR试剂盒检测CASC2及miR‑K11‑3p的表达水平。qPCR反应条件为：95 ℃下反应10 min，95 ℃下反应30 s，60 ℃下反应30 s，反应40个周期。CASC2以GAPDH为内参对照，miR‑K11‑3p以U6为内参对照。采用2^-△△CT进行数据分析，引物序列见表1。

1.2.5 CCK‑8实验检测细胞增殖能力

转染HUVECs 48 h后，收获转染细胞。将浓度为3×10³个/mL细胞接种于96孔板中，培养48 h。然后加入10 μL CCK‑8试剂，继续培养4 h，置于酶标仪检测。参比波长为630 nm，检测波长为450 nm，最后记录吸光度（OD）值。

1.2.6 Annexin V/PI实验检测细胞凋亡率

转染HUVECs 48 h后，收获转染细胞。取浓度为1×10⁶个/mL的细胞悬液200 μL，离心5 min。弃上清，加入10 μL Annexin V‑FITC和 10 μL PI标记溶液重悬细胞（阴性对照为不加AnnexinV‑FITC/PI的一管），4 ℃避光孵育30 min。加入500 μL PBS充分混匀，转入流式检测管。采用488 nm氩离子激光器为光源，FITC显示绿色荧光，PI显示红色荧光。

1.2.7 划痕实验检测细胞迁移能力

转染HUVECs 48 h后，收获转染细胞。将浓度为1×10⁶个/mL的细胞接种于6孔板。使用划痕仪对准6孔板下端中央向上轻轻推成划痕，0 h拍照。将6孔板放入培养箱（37 ℃、5% CO₂），48 h后再次拍照。使用Image J软件计算细胞迁移率。

1.2.8 Transwell实验检测细胞侵袭能力

转染HUVECs 48 h后，收获转染细胞。80 µL matrigel胶铺于小室的上室底部。细胞密度调整为1×10⁵个/mL，接种到Transwell小室的上室中。下室加入10% FBS的培养液0.75 mL，置于培养箱24 h。擦去Transwell小室内未侵袭的细胞。4%甲醛溶液1 mL，固定20 min。0.5%结晶紫溶液1 mL，染色30 min。200×显微镜下观察，计数每个视野中的细胞数（6个视野）^［10］。

1.3 统计学处理

采用SPSS27.0统计软件对数据进行分析，计量资料以\overline{x}\pm s表示，组间差异比较采用单因素方差分析（ANOVA），P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA CASC2的表达水平

在HUVECs中转染pcDNA‑CASC2后，qPCR结果显示：pcDNA‑CASC2组CASC2的表达水平明显高于Control组及pcDNA3.1组（P<0.01），见表2。这表明通过转染pcDNA‑CASC2成功构建了lncRNA CASC2过表达模型。

2.2 lncRNA CASC2对miR‑K11‑3p的靶向负调控作用

通过DIANA和lncRNASNP数据库联合分析，筛选出13个与miR‑K11‑3p相关的候选lncRNA。结合lncRNA2Target v2.0和lncTarD数据库的功能预测，最终选定与肿瘤生长侵袭密切相关的lncRNA CASC2作为研究对象。lncRNA CASC2与miR‑K11‑3p预测的结合位点（标红）见图1A。荧光素酶报告系统显示：在293T细胞中，mimics+CASC2‑WT组相对荧光素酶活性明显低于mimics+CASC2‑MUT组、mimics NC+CASC2‑WT组和mimics NC+CASC2‑MUT组（P<0.01），见图1B。qPCR检测进一步证实：pcDNA‑CASC2组中miR‑K11‑3p的表达水平较Control组和pcDNA3.1组明显降低（P<0.01），见图1C。上述结果表明，lncRNA CASC2可通过直接结合作用负向调控miR‑K11‑3p的表达。

2.3 lncRNA CASC2抑制HUVECs增殖，促进细胞凋亡，降低细胞迁移及侵袭能力

转染48 h后，CCK‑8结果显示（图2A）：pcDNA‑CASC2组HUVECs的细胞增殖水平明显低于Control组和pcDNA3.1组（P<0.01）。AnnexinV/PI双染结果显示：pcDNA‑CASC2组早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率明显高于Control组和pcDNA3.1组（P<0.01），图2B、C。划痕实验结果（图3A、C）及Transwell小室实验结果（图3B、D）显示：pcDNA‑ CASC2组迁移率及侵袭细胞数明显低于Control组和pcDNA3.1组（P<0.01）。因此，lncRNA CASC2抑制HUVECs增殖，促进细胞凋亡，降低细胞迁移及侵袭能力。

2.4 CASC2通过miR‑K11‑3p调控HUVECs的增殖、凋亡、迁移及侵袭（回补实验）

通过双荧光素酶及qPCR实验证明CASC2靶向miR‑K11‑3p并负性调控其表达。为进一步研究CASC2是否通过抑制miR‑K11‑3p表达参与HUVECs细胞功能的调控，将pcDNA3.1、pcDNA‑CASC2、pcDNA‑CASC2+mimics NC、pcDNA‑CASC2+mimics组转染到HUVECs中。CCK‑8实验（图4A）、AnnexinV/PI双染实验（图4B、C）、划痕实验（图5A、C）、Transwell小室实验（图5B、D）检测结果显示：与pcDNA3.1组比较，pcDNA‑CASC2组细胞增殖水平降低、凋亡率增加、迁移率减小、侵袭细胞数减少（P<0.01）；与pcDNA‑CASC2+mimics NC组比较，pcDNA‑CASC2+mimics组细胞增殖水平升高、凋亡率降低、迁移率增加、侵袭细胞数增多（P<0.01）。说明CASC2过表达抑制了HUVECs的生长、迁移和侵袭，而外源回补miR‑K11‑3p逆转了CASC2对细胞生长、迁移和侵袭的抑制作用。因此，CASC2能通过抑制miR‑K11‑3p的表达来调控HUVECs的增殖、凋亡、迁移及侵袭，从而抑制卡波西肉瘤的发展（图6）。

3 讨论

卡波西肉瘤是内皮细胞起源的血管肉瘤，而KSHV是其重要的致病因子^［1］。目前，卡波西肉瘤仍然是一个全球范围内难以解决的健康问题，尚无标准且规范的治疗方案。本项目研究lncRNA、miRNA等在KSHV相关肿瘤发生机制中的作用。其结果可用于识别药物基因或定义相关的卡波西肉瘤治疗靶点。

目前的研究表明，人类基因组的转录产物绝大多数不具备编码蛋白的能力，但可以参与细胞增殖、凋亡、组织分化等多种生物学过程。lncRNA属于一种非编码RNA，在胚胎发育、物种进化、物质代谢、基因表达及肿瘤发生等过程中发挥重要作用^{［11，12］}。miRNA作为内源性非编码小RNA，通过降解靶mRNA或抑制其翻译过程参与肿瘤的发生与发展^{［13，14］}；而KSHV也可以通过编码特定的miRNA，实现对宿主细胞功能的调控。这些miRNA存在于卡波西肉瘤组织或KSHV感染的细胞中，参与细胞增殖、免疫逃逸、细胞转化和细胞周期等过程。如课题组前期发现，kshv‑mir‑k12‑1‑5p（miR‑K1‑5p）可以调控G1/S期相关基因的表达，影响卡波西肉瘤的细胞周期^{［15，16］}。通常肿瘤组织中lncRNA可以通过竞争性结合miRNA靶向的3'‑UTR非编码区^{［17，18］}，影响miRNA对其下游靶mRNA的调控，最终在肿瘤的进展中发挥重要作用^{［19，20］}。

lncRNA CASC2是位于染色体10q26上的lncRNA，是一种重要的抑癌因子。在部分肿瘤中表达水平异常降低，包括胶质瘤、胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肝癌等^{［21，22］}。在转录或转录后水平调控基因的表达，参与个体发育、细胞分化、增殖和迁移等过程^{［23，24］}，但在卡波西肉瘤中的作用尚不清楚。KSHV编码的miR‑K11‑3p是人类肿瘤基因miR‑155的同源基因，是重要的转录后调节因子。既往的研究表明，在卡波西肉瘤中miR‑K11‑3p表达明显高于癌旁组织^［5］。本文通过生信分析预测CASC2与miR‑K11‑3p的结合位点，进一步通过双荧光素酶实验和qPCR实验证实了CASC2通过与miR‑K11‑3p结合抑制其表达，过表达CASC2后，出现了miR‑K11‑3p表达水平明显下降。进一步的细胞功能实验（CCK‑8实验、AnnexinV/PI实验、划痕实验、Transwell小室实验）及回补实验证实，lncRNA CASC2可通过下调miR‑K11‑3p表达抑制HUVECs的生长、迁移和侵袭。lncRNA CASC2在多种肿瘤中都具有抑制肿瘤生长和转移的作用。在甲状腺癌中，CASC2通过调控miR‑24‑3p抑制肿瘤进展^［25］；在结直肠癌中，CASC2通过调控miR‑514b‑5p抑制肿瘤增殖和转移^［26］。本研究发现CASC2通过中和KSHV编码的miR‑K11‑3p实现其抑癌效应。miR‑K11‑3p已被证实在KSHV潜伏感染和免疫逃逸中发挥重要作用^［27］。本研究证明了lncRNA CASC2与miR‑K11‑3p的靶向负调控关系，进一步揭示了miR‑K11‑3p在卡波西肉瘤中的促癌作用。因此，针对lncRNA CASC2的激活剂或miR‑K11‑3p的抑制剂可能成为未来卡波西肉瘤治疗的新方向，例如：设计CASC2过表达载体联合抗病毒药物（如更昔洛韦）的协同治疗方案，开发靶向CASC2/miR‑K11‑3p结合位点的小分子药物。

卡波西肉瘤作为一种由病毒感染引起的肿瘤，其发病机制与其他非病毒性肿瘤存在明显差异。病毒性肿瘤的机制更依赖于病毒基因产物的直接干预和免疫逃逸，而非病毒性肿瘤则更多由累积的基因突变和表观遗传改变驱动。本研究初步揭示了lncRNA CASC2与卡波西肉瘤病毒编码的miR‑K11‑3p在卡波西肉瘤中的作用机制，但仍存在一些局限性。首先，本研究仅限于体外实验，未来需要通过动物模型进一步验证lncRNA CASC2/miR‑K11‑3p在体内的作用；其次，lncRNA CASC2可能通过相关信号通路调控肿瘤细胞的生物学行为，未来应进一步探索其与相关信号通路的相互作用。综上所述，本研究揭示了lncRNA CASC2通过靶向miR‑K11‑3p调控卡波西肉瘤增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的分子机制，为卡波西肉瘤的治疗提供了新的潜在靶点。未来研究应进一步探索lncRNA CASC2/miR‑K11‑3p在卡波西肉瘤中的作用机制及临床应用前景。

作者贡献度说明：

张静：设计课题研究方案、撰写文章；彭靖淇：实验操作、统计分析；刘娜：实验设计；房新志：修改文章。所有作者都同意本文的最终版本。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2022D01C562)