基于AMPK‑SIRT3‑BNIP3通路探讨益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠作用机制

Effects of Yiqi Yangyin Huoxue Recipe on diabetic kidney disease via regulating AMPK‑SIRT3‑BNIP3 pathway in a rat model

摘要

目的 基于AMPK‑SIRT3‑BNIP3信号通路探讨益气养阴活血方对糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）大鼠肾脏的保护机制。 方法 采用SPF级雄性SD大鼠42只，体质量（200±20） g，经1周环境适应后，将其分为空白组（n=6）和造模组（n=36），2组分别喂养普通饲料和高脂高糖饲料。造模组单次腹腔注射链脲佐菌素（35 mg/kg）建立DKD模型，将造模成功的大鼠分为缬沙坦（代文）组、益气养阴活血方等剂量组、益气养阴活血方高剂量组及模型组。各治疗组大鼠按照相应药物剂量灌胃，空白组与模型组予以等体积的蒸馏水，持续治疗7周。生化检测大鼠24 h尿蛋白定量（24 h‑UTP）及血清生化指标：肾功能指标（SCr、BUN）、肝功能指标（ALB、ALT）、糖脂代谢指标（GLU、TC、TG）；H&E染色观察肾脏病理；Western blot检测肾组织AMPK、SIRT3、BNIP3蛋白表达水平；RT‑PCR检测肾组织AMPK、SIRT3、BNIP3 mRNA表达水平。 结果 与空白组比较，模型组大鼠ALT、Scr、BUN、TC、TG、GLU、24 h‑UTP水平，肾组织BNIP3蛋白及mRNA表达水平明显增加（P<0.05），ALB水平及肾组织SIRT3、AMPK蛋白及mRNA表达水平明显降低（P<0.05），肾脏病理损伤严重。与模型组比较，各治疗组大鼠ALT、Scr、BUN、TC、TG、GLU、24 h‑UTP水平，肾组织BNIP3蛋白及mRNA水平表达明显下降（P<0.05），ALB水平及肾组织AMPK、SIRT3蛋白及mRNA表达水平明显上升（P<0.05），肾脏病理损伤明显减轻。各治疗组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 益气养阴活血方可有效降低DKD大鼠24 h‑UTP、保护肾功能、改善肾脏病理，从而延缓DKD的发生、发展，其机制可能与调控肾组织AMPK‑ SIRT3‑BNIP3通路有关。

Abstract

Objective To explore the protective mechanism of Yiqi Yangyin Huoxue Recipe on diabetic kidney disease （DKD） rats based on AMPK‑SIRT3‑BNIP3 signaling pathway. Methods A total of 42 SPF‑grade male SD rats （with body weight ranging from 200~220 g） were used. After 1 week of environmental adaptation， the rats were divided into a blank group （n=6） and a modeling group （n=36）. The two groups were fed with normal diet and high‑fat/high‑sugar diet respectively. A single intraperitoneal injection of streptozotocin （35 mg/kg） was used to establish the DKD model in the modeling group. The rats that were successfully induced were randomly divided into a valsartan （Diovan） group， a Yiqi Yangyin Huoxue Recipe equal‑dose group， a Yiqi Yangyin Huoxue Recipe high‑dose group， and a model group. The rats in each treatment group were given the corresponding drug doses by gavage， while the blank group and the model group were given the same volume of distilled water. The treatment lasted for 7 weeks. The 24‑hour urinary protein （24 h‑UTP） and serum biochemical indexes of the rats were detected by biochemical tests， including renal function indexes （SCr and BUN）， liver function indexes （ALB and ALT），and glycolipid metabolism indexes （GLU， TC， and TG）； H&E staining was used to observe the renal pathology； Western blot was used to detect the protein expression levels of AMPK， SIRT3， and BNIP3 in renal tissue； RT‑PCR was used to detect the mRNA expression levels of AMPK， SIRT3， and BNIP3 in renal tissue. Results Compared to the blank group， the levels of ALT， Scr， BUN， TC， TG， GLU， 24 h‑UTP， and renal tissue BNIP3 protein and mRNA expression levels in the model group rats were significantly increased （P<0.05）， while the levels of ALB and renal tissue SIRT3 and AMPK proteins and mRNA expression levels were significantly decreased （P<0.05）， and the renal pathological damage was severe. Compared to the model group， the levels of ALT， Scr， BUN， TC， TG， GLU， 24 h‑UTP， and renal tissue BNIP3 protein and mRNA expression levels in the treatment groups significantly decreased （P<0.05）， while ALB level and renal tissue AMPK and SIRT3 protein and mRNA expression levels significantly increased （P<0.05）， and the renal pathological damage was significantly alleviated. There was no statistically significant difference among the treatment groups （P>0.05）. Conclusion The Yiqi Yangyin Huoxue Recipe can effectively reduce 24 h‑UTP in DKD rats， protect renal function， and improve renal pathology， thereby delaying the occurrence and development of DKD. The mechanism may be related to the regulation of the AMPK‑SIRT3‑BNIP3 pathway in renal tissue.

Graphical abstract

关键词

益气养阴活血方 / 糖尿病肾病 / AMPK‑SIRT3‑BNIP3 / 机制研究

Key words

Yiqi Yangyin Huoxue Recipe / Diabetic kidney disease / AMPK‑SIRT3‑BNIP3 / Mechanism

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）作为糖尿病病程中危害性突出的微循环障碍并发症，其病理机制尚未完全阐明，导致临床干预措施存在局限性^［1］。分子生物学研究揭示，AMPK‑SIRT3‑ BNIP3信号轴通过复杂的级联反应参与疾病进展^［2］：AMPK通过磷酸化修饰增强SIRT3的生物活性，继而调控BNIP3的转录表达，激活后的SIRT3通过调控线粒体蛋白去乙酰化水平，能改变BNIP3的亚细胞定位及功能状态，从而干预细胞程序性死亡与自噬平衡^［3］。这种分子网络的动态失衡与肾小球足细胞结构损伤、尿液蛋白排泄异常及肾小球滤过功能减退存在明显相关性，提示该信号通路可能成为DKD防治的关键靶点。DKD中医辨证多属脾肾亏虚为本，瘀毒互结为标的虚实夹杂证候，中医辨证施治已取得重要进展^［4‑6］，基于“益气养阴、活血通络”治则，本课题组研制复方制剂益气养阴活血方，前期临床研究显示其可明显改善患者肾功能指标^［7‑9］。本研究拟通过构建DKD动物模型，从AMPK‑SIRT3‑BNIP3信号转导层面阐释该方剂的分子药理机制，为中医药临床防治DKD提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取42只6周龄雄性SPF级SD大鼠，体质量（200±20） g，购自河南省郑州市华兴实验动物养殖场，实验动物许可证编号：SYXK（豫）2022‑0004，实验维持SPF级屏障环境［温度（25±1） ℃，湿度50%±10%，12 h/12 h昼夜节律）］。本实验由河南中医药大学第一附属医院伦理审查委员会批准，动物实验伦理审查批准号：YFYDW2024003，实验过程严格遵循3R原则

1.2 药物与试剂

缬沙坦（代文）胶囊（北京诺华制药公司，国药准字：H20040217，规格：80 mg/粒）；益气养阴活血方颗粒购于河南中医药大学第一附属医院中药房，组成：生黄芪30 g，菟丝子30 g，积雪草30 g，生地黄10 g，制大黄4 g，水蛭3 g （江阴天江药业有限公司，批号：21041961、22030302、21101731、21077284、21096874、21096864）；柠檬酸钠缓冲液（批号：2312005）；异丙醇、无水乙醇、氯仿替代物（国药集团，批号：G80109218、10009218、3014）；链脲佐菌素（STZ）（美国Sigma公司，货号：S0130，批号：102651899）；SIRT3抗体、SOD2抗体、GPX4抗体、山羊抗兔HRP二抗、RNA提取液及溶解液、RIPA裂解液（赛维尔生物，武汉，商品号：GB11354、GB111875、GB113745、ab126630、GB23303、G3013、G3029、G2002）。

1.3 仪器

AU5800型全自动生化分析仪（美国Beckman公司）；DESK/MIDI/250/1000型全景式切片扫描仪（匈牙利3DHISTECH公司）；D3024R型冷冻离心机（DRAGONLAB，最大转速15 000 r/min，步长：10 r/min）；CFX型荧光定量PCR仪（美国Bio‑Rad公司）。

1.4 建立DKD大鼠模型

将42只雄性SPF级SD大鼠适应性喂养1周，采用随机数表法将其分为2组：空白组（n=6）和造模（n=36）。基于课题组预实验数据及既有研究方案^［7，8］，造模组采用高糖高脂饲料（基础饲料70%+猪油10%+蔗糖 20%）诱导代谢紊乱，对照组维持标准饮食。干预第7周实施关键造模操作：造模组大鼠按35 mg/kg剂量经腹腔单次注射STZ，注射后72 h连续3次空腹血糖检测≥16.7 mmol/L，且建模1周后收集24 h尿液，定量分析显示尿蛋白排泄量（24 hour urinary protein，24 h‑UTP）≥20 mg/24 h大鼠纳入后续实验^［7，8］。模型制备过程中4只大鼠因建模失败或死亡予以剔除。

1.5 实验分组及给药

模型验证成功的32只大鼠随机分为4组：模型组（n=8）、代文组（n=8）、益气养阴活血方组等剂量组（n=8）、益气养阴活血方组高剂量组（n=8）。干预措施为：代文组灌胃缬沙坦混悬液（8.33 mg·kg^‑1·d^‑1），2个益气养阴活血方组分别给予不同浓度益气养阴活血方水煎剂（等剂量组11.0 g·kg^‑1·d^‑1、高剂量组22.0 g·kg^‑1·d^‑1），模型组与空白组接受等体积生理盐水灌胃。所有给药体积按10 mL·kg^‑1·d^‑1标准执行，每日定时单次灌胃，持续干预6周。

1.6 取材

实验周期结束后进行系统化样本采集：（1）代谢笼收集24 h尿液标本，离心（4 ℃，3 000×g，15 min）获取上清，分装后-80 ℃冻存；（2）尿液收集后，大鼠深度麻醉（腹腔注射10%水合氯醛，3 mL/kg）后经腹主动脉采血，全血样本经梯度离心获取血清，分装管标记后液氮速冻转入-80 ℃生物样本库；（3）肾脏组织处理采取双保存方案：沿肾门冠状面截取1 mm³组织块置入4%多聚甲醛固定液中进行组织形态学分析，剩余肾皮质组织经液氮速冻后转移至-80 ℃超低温冰箱，用于后续蛋白印迹（Western blot）实验。

1.7 指标检测及方法

1.7.1 各组24 h‑UTP、肝肾功能检测

全自动生化分析仪检测各组大鼠24 h‑UTP、血清白蛋白（albumin，ALB）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、血清肌酐（serum creatinine，SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血糖（blood glucose，GLU）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride， TG）水平。

1.7.2 苏木素‑伊红（hematoxylineosin， H&E）染色法评估肾脏病理

取 4% 多聚甲醛固定的肾组织，按标准作业程序制片流程处理，依次经梯度乙醇脱水、浸蜡包埋、连续切片。苏木素及伊红染色后采用树胶进行封片。光镜下（400×）观察肾组织病理改变。

1.7.3 Western blot检测肾组织AMPK、SIRT3、BNIP3蛋白表达水平

取肾皮质组织经RIPA裂解，离心收集上层清液。BCA法蛋白定量后，50 μg样本与5×SDS上样缓冲液混合，95 ℃变性10 min。12%分离胶和5%浓缩胶电泳，80 V（浓缩胶）转 120 V（分离胶）。湿转至 PVDF膜，封闭1 h后，4 ℃孵育AMPK、SIRT3、BNIP3一抗过夜。TBST洗3次，HRP二抗（1∶5 000）室温孵育1 h。ECL显影后软件分析条带，计算蛋白相对表达量，实验数据重复3次验证。

1.7.4 实时荧光定量聚合酶链式反应（real‑time PCR， RT‑PCR）检测肾脏SIRT3、AMPK、SIRT3 mRNA表达水平

分别取新鲜肾皮质组织，提取总RNA，逆转录合成cDNA。按PCR反应体系进行RT‑PCR检测，扩增条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火/延伸30 s （40个循环），65 ℃→95 ℃，每升温0.5 ℃，采集1次荧光信号。

1.8 统计学处理

使用SPSS 26.0软件进行统计学分析，计量资料以\overline{x}\pm s表示，符合正态分布方差齐的数据采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；不符合正态分布的数据采用非参数秩和检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠24 h‑UTP、BUN、SCr水平的比较

比较各组大鼠SCr、BUN及24 h‑UTP水平后结果显示，与空白组相比，模型组各观测指标水平明显升高（P<0.05）；各治疗组经药物干预后，相较于模型组，SCr、BUN及24 h‑UTP水平降低（P<0.05），但3个治疗组间的干预效应比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2 各组大鼠肝功能、血脂、血糖指标水平的比较

模型组与空白组相比，其肝功能ALT、TC、TG、GLU水平升高（P<0.05），而ALB作为肾功能关键评估指标则呈现降低趋势（P<0.05）；各治疗组干预后上述指标发生明显改善，代文组及益气养阴活血方等剂量、高剂量组在肝功能、脂质代谢及血糖调控指标上相较于模型组降低（P<0.05），同时血清ALB水平升高，恢复至生理范围（P<0.05），但3个治疗组间的上述指标治疗效应比较差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.3 各组大鼠肾脏病理的变化

光镜观察发现，空白组肾小球、肾小管结构正常。模型组可见肾小管上皮细胞呈气球样变性，胞质出现空泡化改变，肾小球毛细血管袢扩张充血，肾间质可见散在炎细胞浸润；肾小球毛细血管瘀血扩张；肾小囊扩张，间隙增大。与模型组比较，各治疗组大鼠肾脏器组织病理改变较轻，少数肾小管上皮水肿，肾小球细胞数量及基质正常，间质未见增生，无明显炎性细胞浸润，见图1。

2.4 各组大鼠AMPK、SIRT3、BNIP3蛋白相对表达量的比较

比较各组大鼠AMPK、SIRT3、BNIP3蛋白相对表达量后结果显示，与空白组相比，模型组AMPK、SIRT3蛋白相对表达量明显下调（P<0.05），BNIP3蛋白相对表达量明显上调（P<0.05）；各治疗组经药物干预后，相较于模型组，AMPK、SIRT3蛋白相对表达量明显升高（P<0.05），BNIP3表达明显下降（P<0.05）；但3个治疗组间的比较差异无统计学意义（P>0.05），见表3、图2。

2.5 各组大鼠SIRT3、AMPK、BNIP3 mRNA的比较

比较各组大鼠AMPK、SIRT3、BNIP3 mRNA水平后结果显示模型组SIRT3、AMPK mRNA表达水平较空白组明显下调，BNIP3 mRNA表达水平较空白组明显上调（P<0.05）；各治疗组经药物干预后，相较于模型组，AMPK、SIRT3 mRNA表达水平明显升高，BNIP3 mRNA表达水平明显下降（P<0.05），但3个治疗组间的比较差异无统计学意义（P>0.05），见表4。

3 讨论

当前研究揭示DKD的发病涉及多维度病理网络，包括经典的高糖介导氧化应激^［8］、铁死亡程序激活^［9］、慢性炎症微环境^［10］及遗传易感性^［11］等。AMPK‑SIRT3‑BNIP3通路作为DKD的新型调控网络，在疾病进程中发挥枢纽作用。AMPK作为细胞能量代谢的中央调控器，通过感应血糖波动、胰岛素抵抗及氧化应激强度等信号，动态调节脂肪酸β氧化与糖异生代谢平衡^［12］。其磷酸化激活不仅能改善糖尿病代谢紊乱，更可通过表观遗传调控增强SIRT3转录活性。SIRT3作为线粒体去乙酰化酶家族核心成员，在维持线粒体稳态中起关键作用。高糖环境通过诱导活性氧爆发及表观修饰异常，明显抑制SIRT3的去乙酰化功能，导致线粒体膜电位紊乱及抗氧化防御系统崩溃，最终引发肾小球滤过屏障结构破坏^［12］。实验证据表明，SIRT3激动剂可有效逆转高糖诱导的肾小管上皮细胞铁死亡，其保护机制涉及线粒体自噬流修复及凋亡小体形成抑制^［13］。BNIP3作为AMPK‑SIRT3下游效应分子，在足细胞命运调控中呈现双刃剑特性，该蛋白通过介导线粒体自噬与凋亡信号交叉对话，参与足细胞骨架重构过程。病理状态下，BNIP3的异常激活可破坏自噬‑凋亡动态平衡，导致足细胞特异性裂孔膜蛋白丢失，形成持续性蛋白尿^［14］。AMPK‑SIRT3轴可通过调节BNIP3的亚细胞定位及二聚化状态，精确调控其促存活或促凋亡功能转换^［15］。基于上述分子机制，AMPK‑SIRT3‑BNIP3信号网络通过三重调控模式影响DKD进展：（1）维持线粒体氧化磷酸化效能；（2）动态平衡程序性死亡通路；（3）修复受损的自噬清除系统^［16］。该通路的层级调控特性为DKD开发多靶点干预策略提供了理论依据，特别是中药复方通过“系统‑系统”作用模式调控该网络的潜在价值值得深入探索。

DKD相当于中医“水肿”、“尿浊”、“消渴”等，气阴两虚是发病基础，络脉瘀阻、津凝痰聚是DKD的主要病理环节，故“气阴两虚、络脉瘀阻”为其基本病机已渐成共识^{［17，18］}。基于此，本课题组针对该病机拟定“益气养阴活血方”，该方由生黄芪、制大黄、菟丝子、生地、积雪草、水蛭共6味中药组成，方剂中黄芪成分黄芪甲苷可以抗氧化、阻止细胞凋亡，菟丝子在抑制炎症反应、改善基线生化指标有一定疗效，二者中生黄芪益气健脾利水，菟丝子补益肝肾之阴，共为君药；积雪草成分积雪草苷可以抗炎症、调节自噬；生地成分梓醇可在一定程度上延缓病程，二者中生地黄甘寒滋阴降火、积雪草清热利湿解毒、活血消肿共为臣药；制大黄、水蛭可在一定程度上延缓肾纤维化，二者中制大黄既通便泄浊兼活血；水蛭破血逐瘀，活血通络，共为佐使，同时助生地黄、积雪草活血化瘀；诸药合用，具有益气养阴、清热化瘀、利水消肿的功效，同时可通过抗炎、抗氧化、调节细胞凋亡等多种机制保护肾脏。本课题组不仅临床观察该方可有效治疗DKD^［19］，而且对其作用机制进行了相关研究^{［20‑22］}。通过实验，本研究发现，在药效学评价与机制解析上：实验数据显示，各治疗组在肝功能（ALT）、肾功能（BUN、SCr）、脂糖代谢（GLU、TC、TG）及24 h‑UTP等关键指标呈现明显改善趋势（P<0.05），同时伴随血清BNIP3蛋白表达水平下调及ALB水平恢复（P<0.05）。分子生物学检测显示，益气养阴活血方干预明显上调肾皮质AMPK、SIRT3基因转录水平（P<0.05），并抑制BNIP3 mRNA过度表达（P<0.05）。肾脏显微病理评估显示，益气养阴活血方高剂量组与代文组能有效维持肾小球基底膜结构完整性，明显减少足细胞脱落及系膜基质增生，仅个别样本出现轻度肾小管上皮细胞空泡变性。机制研究表明，上述生化指标与病理改善效应与AMPK‑SIRT3‑BNIP3信号轴的动态平衡密切相关。其肾脏保护机制可能与调控该信号轴介导的线粒体质量控制网络息息相关，具体表现为：（1）激活AMPK‑SIRT3级联反应，增强线粒体生物合成及抗氧化应激能力；（2）抑制BNIP3介导的过度自噬流，维持足细胞线粒体稳态；（3）通过表观遗传调控重塑肾脏能量代谢网络。不同剂量益气养阴活血方组间疗效差异无统计学意义（P>0.05），且与代文组改善程度相当，提示该复方可能存在明确的量效平台期。本研究从分子‑细胞‑组织多维度揭示了益气养阴活血方干预DKD的作用靶标，突显了中药复方多靶点、多通路整合调节的治疗优势，为中医药治疗DKD提供了新的实验依据。

作者贡献度说明：

李慧聪：设计实验、进行实验、分析数据、撰写论文；邢静静：设计实验、论文修改；宋珂：提供研究思路、指导论文撰写及修改；陈晨晨、姜浩然、宋纯东：论文修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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