外周血miR‑155水平对脓毒症及肠道功能障碍患者28 d死亡风险的预测价值

Predictive value of peripheral blood miR‑155 levels on the risk of death at 28 d in patients with sepsis and intestinal dysfunction

摘要

目的 分析外周血中microRNA‑155（miR‑155）浓度对脓毒症及其并发肠道功能障碍患者28 d内死亡风险的预测价值。 方法 本研究聚焦于新疆医科大学第一附属医院重症医学中心收治的129例脓毒症病例，Lgistic回归模型探究外周血中miR‑155表达量与肠道功能障碍发生之间的关联性。根据患者28 d内的生死状态，将样本分为存活组（n=93）与死亡组（n=36）。采用Cox比例风险模型识别影响脓毒症患者预后结果的风险因素，并构建受试者工作特征曲线（ROC），以评价外周血miR‑155表达水平在预测脓毒症患者预后方面的效能。此外，利用Kaplan‑Meier生存分析法，依据不同的miR‑155表达水平绘制生存曲线，深入分析生存状况。 结果 脓毒症患者的外周血miR‑155表达量升高是诱发肠道功能障碍的风险因素（OR=3.156， 95% CI=1.875~5.311， P<0.001）。与存活组相比，死亡组患者外周血中miR‑155的表达水平明显升高（P<0.001）。Cox比例风险回归分析进一步确认，miR‑155是独立影响脓毒症患者预后结果的一个关键因素。通过受试者ROC曲线分析发现，miR‑155表达水平在预测脓毒症患者28 d死亡风险时，AUC=0.962，显示高预测准确性。当设定miR‑155的截断值为3.95时，预测的敏感度为93.9%，特异度为90.2%。Kaplan‑Meier生存曲线分析进一步揭示，对于miR‑155表达水平超过3.95的患者，其预后情况明显较差（P<0.001）。 结论 作为一种简便、高效且安全的生物标志物，外周血中miR‑155具有临床潜力，可用于预测及早期预后评估脓毒症及其所致的肠道损伤。

Abstract

Objective To analyze the predictive value of peripheral blood microRNA‑155 （miR‑155） concentration on the risk of death within 28 days in patients with sepsis and intestinal dysfunction. Methods This study focused on 129 cases of sepsis admitted to the Critical Medicine Center of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University. Logistic regression model was used to explore the correlation between the expression of miR‑155 in peripheral blood and the occurrence of intestinal dysfunction. According to the life and death status of patients within 28 days， the samples were divided into the survival group （n=93） and the death group （n=36）. Cox proportional risk model was used to identify the risk factors affecting the prognosis of sepsis patients， and the receiver operating characteristic curve （ROC） of the subjects was constructed based on this model to evaluate the efficacy of peripheral blood miR‑155 expression level in predicting the prognosis of sepsis patients. In addition， Kaplan‑Meier survival analysis was used to draw survival curves according to different miR‑155 expression levels for in‑depth survival analysis. Results The increased expression of miR‑155 in peripheral blood of patients with sepsis was a risk factor for induced intestinal dysfunction （OR=3.156， 95% CI=1.875‒5.311， P<0.001）. Compared to the survival group， the expression level of miR‑155 in peripheral blood of patients in the death group was significantly increased （P<0.001）. Cox proportional hazard regression analysis further confirmed that miR‑155 was a key factor independently affecting the prognosis of sepsis patients. According to the ROC curve analysis， the AUC of miR‑155 expression level was 0.962 when predicting the 28‑day death risk of sepsis patients， indicating a high prediction accuracy. When the cut‑off value of miR‑155 was set to 3.95， the predicted sensitivity reached 93.9% and the specificity was 90.2%. Kaplan‑Meier survival curve analysis further revealed that patients with miR‑155 expression levels above 3.95 had a significantly worse prognosis （P<0.001）. Conclusions As a simple， efficient， and safe biomarker， miR‑155 in peripheral blood has clinical potential in the prediction and early prognosis assessment of sepsis and intestinal injuries caused by sepsis.

Graphical abstract

关键词

脓毒症 / 肠道功能障碍 / miR‑155 / 28 d死亡风险

Key words

Sepsis / Intestinal dysfunction / miR‑155 / 28‑day mortality risk

脓毒症是一种源于宿主对感染反应失调导致器官功能障碍的综合征^［1］，具有高病死率的特点^［2，3］。据统计，全球每年新增脓毒症患者超过1 900万，其中约600万患者死亡，病死率超过25%^［4］。而且随着人口老龄化、免疫抑制人群增加及多重耐药感染的出现，脓毒症的发病率仍在逐年上升。这不仅给患者的生命健康带来巨大威胁，也对全球医疗卫生系统造成了沉重的负担。肠道作为人体中最大的免疫防护屏障，对抵御肠道微生物及其产生的毒素至关重要^［5，6］。对脓毒症的深入研究发现肠道功能异常是脓毒症常见的并发症之一^［7］。脓毒症往往导致胃肠道微环境失衡，破坏宿主与肠道微生物之间的平衡状态，从而引发肠道屏障的破坏、黏膜层通透性增加、灌注异常及细菌易位等问题，进一步削弱肠道屏障功能和肠道免疫力^［8，9］。研究表明，出现肠道功能障碍的脓毒症患者，其重症监护室（ICU）住院时间明显延长，死亡率明显升高^［10］。因此，探索简便且灵敏的指标评估脓毒症患者肠道受损状况，对于控制脓毒症病情进展、减少患者死亡风险，具有较高的价值。

MicroRNA（miRNA）是一种源自细胞内部、不具备编码功能的单链RNA分子，其长度约为22~25个核苷酸，主要通过转录后机制抑制目标基因的表达，从而参与细胞的各种生理功能^［11］。近期研究显示，miRNA在调控肠道黏膜上皮细胞增殖、分化、免疫反应及屏障功能方面发挥重要作用^［12］。miRNA的异常表达可能会促进脓毒症引发的肠道损伤进程，导致炎症介质释放增加、肠道屏障受损及免疫功能失调等后果。鉴于此，一些研究者认为，凭借miRNA的独特优势，其有望成为炎症性疾病新的生物标志物^{［13‑15］}。相较于蛋白质生物标志物，miRNA在体液环境中展现出更高的稳定性^{［16‑19］}，同时miRNA可以在转录后水平发挥对蛋白质表达的关键调控作用。因此，有研究提出，特定的外周血miRNA具有作为理想生物标志物的潜力，对评估脓毒症患者的预后具有重要意义^{［20‑22］}。鉴于脓毒症患者常伴有肠道功能障碍，本研究致力于探索外周血miR‑155对于预测脓毒症及其所致的肠道功能障碍患者28 d死亡风险的价值。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

本研究采用前瞻性病例对照方法，纳入新疆医科大学第一附属医院重症医学中心的脓毒症患者为研究对象（129例）。患者纳入标准：（1）年龄>18岁；（2）符合sepsis 3.0诊断标准^［23］；（3）需在出现症状后的24 h内被收治入ICU。患者排除标准：（1）正在接受免疫抑制治疗或正处于肿瘤相关放化疗期间；（2）人类免疫缺陷病毒相关感染者；（3）处于妊娠期或哺乳期的妇女。

1.2 一般资料的收集及分组

所有参与本研究的对象在入住ICU后24 h内，采集5 mL外周静脉血样本，并详细记录每位患者的基本信息及入院后所进行的相关实验室检查数据。患者入院后24 h内完善相关评分系统［APACHEⅡ评分、SOFA评分、急性胃肠损伤（AGI）评分］，并根据28 d的随访情况，将研究对象分为存活组（n=93）和死亡组（n=36）。本研究的所有参与者在获得其家属的知情同意后纳入，并且获得新疆医科大学第一附属医院伦理审查委员会批准（220525‑01）。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 血清指标的检测

采集患者外周血液样本置于不含抗凝剂的采血管内，室温放置2 h后置于高速低温离心机（6 000 r/min）内离心15 min，收集上层血清分装于EP管内保存于-80 ℃冰箱用于后续检测。采用酶联免疫吸附法检测外周血清二胺氧化酶（DAO）、肠型脂肪酸结合蛋白（iFABP）水平。

1.3.2 RNA的提取及qRT‑PCR

采用TRIzol试剂（Thermo）进行外周血总RNA的提取，依据逆转录试剂盒说明书（K1622，Thermo）将RNA逆转录为cDNA。采用QuantiNova™ SYBR Green PCR试剂盒进行qRT‑PCR。以U6为内参，2^-ΔΔCT为相对表达量，引物序列名称见表1。

1.4 统计学处理

使用SPSS 27.0和Prism 9.0软件对收集的数据进行统计分析处理。符合正态分布的计量资料采用\overline{x}\pm s表示，并通过单因素方差分析比较多组之间的差异，而2组之间的比较则采用t检验。不符合正态分布的计量资料采用中位数（四分位数）［M（P₂₅，P₇₅）］表示，通过Kruskal‑Wallis秩和检验进行分析。计数资料采用%表示，并通过卡方检验分析组间差异。此外，建立Logistics回归分析模型评估miR‑155与肠道功能障碍之间的关联性。同时，采用Cox比例风险回归分析模型探究影响脓毒症患者预后的各种危险因素。为了评估miR‑155在预测脓毒症及其引发的肠道功能障碍患者28 d死亡风险方面的价值，绘制受试者工作特征曲线（ROC），并进行Kaplan‑Meier生存分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 脓毒症患者生存组和死亡组临床特征的比较

本研究共计纳入129名脓毒症患者作为研究样本，并对每例患者进行了为期28 d的跟踪随访（表2）。根据随访的最终结果，分为存活组（n=93， 72%）和死亡组（n=36，28%）。2组间年龄差异的比较结果显示，与存活组的患者相比，死亡组患者平均年龄更大（t=2.562，P=0.012）。

2.2 探究miR‑155表达量与肠道功能受损之间的关联性

本研究根据欧洲危重病学会所制定的AGI分级诊断标准，对研究对象的肠道功能受损情况进行了分级和量化评估。依据此标准将研究对象划分为2组：AGI 0级被归入非AGI组，AGI Ⅰ~Ⅳ级的患者则被归入AGI组。随后，采用Logistic回归分析方法探究miR‑155与肠道功能障碍之间的关联性。分析结果表明，miR‑155是脓毒症患者并发肠道功能障碍的一个明显危险因素（OR=3.156，95% CI=1.875~5.311，P<0.001），见表3。

2.3 外周血miR‑155在脓毒症患者生存组和死亡组表达水平的比较

采用RT‑qPCR方法检测2组患者外周血miR‑155表达水平。研究结果表明，死亡组患者外周血miR‑155水平较存活组明显升高（t=12.273， P<0.001），见图1。

2.4 影响脓毒症患者预后的多因素分析

在初步完成影响脓毒症患者预后情况的单因素分析后，构建Cox比例风险回归模型进一步深入探讨表现出差异的指标。分析结果显示，外周血中miR‑155、DAO、iFABP的表达量是明显预测脓毒症患者28 d预后状况的关键因素（P<0.001），见表4。

2.5 ROC曲线分析

为了更深入地了解上述独立危险因素在预测脓毒症患者28 d死亡风险方面的作用，为每一个独立危险因素分别绘制ROC曲线，并计算了相应的曲线下面积（AUC）。分析结果显示，miR‑155的表达水平在预测脓毒症患者28 d内的死亡风险过程中表现出了较高的准确性（AUC=0.962）。具体而言，当以3.95作为截断值时，miR‑155的预测敏感度为93.90%，特异度为90.20%，约登指数为0.841，进一步证实了其在预测脓毒症患者预后方面的良好价值，见表5、图2。

2.6 不同miR‑155表达水平生存曲线分析

以miR‑155表达水平3.95为界，将患者分为miR‑155>3.95和miR‑155≤3.95组，并绘制Kaplan‑Meier生存曲线，发现2组生存曲线具有明显差异，且经Log‑rank检验，差异具有统计学意义（P<0.001），提示miR‑155水平较高组的患者预后较差，见图3。

3 讨论

脓毒症作为一种在全球范围内普遍存在的疾病，是导致ICU内患者死亡的重要原因之一^［24］。研究显示，肠道功能损害与多器官功能障碍综合征的发病机制存在密切联系，特别是在脓毒症等重症疾病背景下，肠道功能损伤被广泛视作驱动多器官功能障碍进程的“始动因素”^［25］。尽管诸如血液iFABP、DAO及D‑乳酸等生物标志物被视为肠道屏障功能障碍的可能标志物^［26］，但在AGI诊断和分类中的临床应用实用性尚未完全明确。因此，对于脓毒症引发的肠道损伤，早期诊断、及时干预、迅速治疗或体外辅助至关重要。鉴于此，寻找并确定有效的生物标志物及开发针对性的治疗药物，成为改善脓毒症肠道损伤状况的当务之急。然而，由于目前对脓毒症肠道损伤的分子发病机制了解不足，且临床主要依赖于症状的评估，导致脓毒症肠道损伤的诊断和治疗仍面临众多挑战。因此寻找具有高特异性和敏感性的生物标志物，早期诊断和评估脓毒症肠道屏障功能障碍的病情变化，具有重要的临床价值。众多研究揭示miRNA表达的变化与脓毒症多脏器功能障碍的病理过程紧密相连，涉及炎症反应、免疫应答及肠道损伤等多个方面。此外，miRNA在各类体液中（如血液和尿液）广泛存在，且循环中的高度稳定性使其具备成为临床生物标志物的潜力。因此，miRNA作为治疗靶点的研究日益受到学者们的广泛重视^{［27‑29］}。miRNA通过抑制特定途径来调节靶基因mRNA的转录，从而导致基因表达异常^［30］。最新研究表明，miRNA调控约60%的蛋白质编码基因^［31］。深入探索发现，miRNA对基因的调控机制极为复杂，一个miRNA可以潜在靶向多个mRNA，而一个mRNA也可以被多个miRNA靶向结合^［32］。近年来，学术界对不同疾病中miRNA表达谱的研究不断深入，发现miRNA在不同疾病中的表达谱变化具有明显特异性。这一发现不仅揭示了miRNA作为疾病诊断潜在分子标志物的可能性，也为疾病治疗提供了新的靶点。

本研究对129例脓毒症患者进行了为期28 d的跟踪随访，并根据患者的预后情况，将其分为存活组和死亡组。为了深入理解脓毒症患者的临床表现及影响他们预后的因素，全面记录并比较了这些患者在入院时的基线信息和实验室检查结果。本研究最终发现，与存活组相比，死亡组患者的外周血中miR‑155表达水平明显上升。通过Logistic回归分析发现miR‑155是促进脓毒症并发肠道功能障碍的一个重要风险因素，揭示了miR‑155在脓毒症及其肠道功能障碍病理进程中的潜在作用。此外，Cox比例风险回归模型分析指出，除入院首日的血清DAO及iFABP水平外，外周血miR‑155表达水平也构成脓毒症患者预后的一个独立预测因子。为评估这些独立因子的预测效能，本研究构建了ROC进行验证与深入分析，并辅以Kaplan‑Meier生存曲线分析，进一步证实外周血miR‑155高表达患者预后不佳。综上所述，外周血中miR‑155表达水平的上升可能与脓毒症引起的肠道损伤具有紧密联系，同时也可能预示脓毒症患者的不良结局。这一发现对于改进脓毒症患者的治疗方案及提高预后评估的精确度提供了科学依据和临床实用性。

miRNA作为无创、便捷的预后标志物，在临床实践中具有广阔的应用前景。与传统的预后评估指标如APACHEⅡ评分、SOFA评分相比，miRNA检测具有独特的优势。传统评分系统主要基于患者的生理参数和临床症状进行评估，主观性较强，且在疾病早期可能无法准确反映病情的发展趋势。而miRNA检测是基于生物分子水平的检测方法，具有更高的敏感性和特异性，能在疾病早期检测到微小的变化，为临床医生提供更及时、准确的预后信息。

但本研究仍存在一些局限性。首先，参与研究的患者数量有限，较小的样本量可能降低研究结果的可靠性和普遍性，使得结论难以推广至更大范围的患者群体。其次，在研究miR‑155与脓毒症患者预后的关系中，本研究只对患者短期生存情况进行了随访，缺乏长期随访及数据分析。最后，本次研究对象的选择可能存在患者选择偏倚，从而影响研究结果的准确性。例如，本研究排除了孕妇、婴幼儿等特殊患者群体，导致研究结果在这些群体中的适用性受限。因此，未来的研究将进一步验证基于miRNA的预后预测模型在不同临床环境下的准确性和可靠性，通过多中心、大样本的临床研究，完善模型的参数和性能。开发便捷、高效的miRNA检测技术，如基于微流控芯片的检测方法，实现miRNA的快速、准确检测，提高其在临床实践中的可操作性。将miRNA检测与传统的临床指标相结合，建立综合的脓毒症诊断和预后评估体系，为临床医生提供更全面、准确的决策依据。

综上所述，本研究发现脓毒症患者外周血miR‑155的表达量明显上升，且与脓毒症诱发的肠道损伤及患者的预后情况密切相关。此发现不仅有助于精确判断脓毒症患者的疾病严重程度，还为早期预测脓毒症及其肠道损伤患者的预后提供了新的生物标记物，对临床实践及预后判断具有指导意义。但是miRNA作为脓毒症预后标志物的研究仍处于不断发展阶段，未来需要进一步优化检测技术，提高检测的准确性和可靠性。还需要开展大规模的临床研究，验证miRNA在不同人群、不同临床环境下的预后预测价值，完善基于miRNA的预后预测模型，使其更好地服务于临床实践，为脓毒症患者的治疗和管理提供有力支持。

作者贡献度说明：

李志华：研究设计、收集数据、统计学分析、论文撰写；银乐乐：收集数据；杨春波：研究设计、统计学分析；于湘友：研究设计，指导支持；高晓明：研究设计，论文修改；王毅：研究设计，论文修改，指导支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(82160360)

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2022D01C477)

“十四五”国家重点研发计划(2021YFC25000801)