基于TLR4/TRAF6/NF‑κB/iNOS通路介导的巨噬细胞M1型极化探讨人参皂苷Rd抑制炎症治疗非酒精性脂肪性肝炎的机制研究

Mechanism study of ginsenoside Rd in inhibiting inflammation and treating non‑alcoholic steatohepatitis based on TLR4/TRAF6/NF‑κB/iNOS pathway‑mediated M1 macrophage polarization

摘要

目的 本研究旨在阐明人参皂苷Rd对巨噬细胞TLR4/TRAF6/NF‑κB/iNOS通路及M1型极化的影响，从而明确其治疗非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的分子机制； 方法 小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7随机分为空白组、模型组、人参皂苷Rd低剂量、高剂量组和抑制剂组。除空白组外，余下各组采用脂多糖诱导构建模型后给予相应的药物进行干预。分别采用酶联免疫吸附试验检测炎症因子（TNF‑α、IL‑6和IL‑1β的）的含量；采用流式细胞术检测M1型巨噬细胞的百分比；采用蛋白印迹法和生化法检测TLR4/TRAF6/NF‑κB/iNOS通路、自噬、ROS/p38/Nrf2通路中相关分子的表达；采用透射电镜检测巨噬细胞自噬水平的变化； 结果 与模型组相比，人参皂苷Rd组中炎症因子TNF‑α、IL‑6和IL‑1β的含量和M1型巨噬细胞的比例均显著降低，TLR4、TRAF6、iNOS和细胞核p65蛋白的表达显著下调，细胞质p65蛋白的表达显著上调，差异均具有统计学意义（P<0.01）。此外，人参皂苷Rd能显著增加巨噬细胞中SOD的活力和GSH的含量，降低MDA的含量，上调巨噬细胞中Beclin1蛋白的表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，下调细胞质p62、Nrf2蛋白的表达和p‑p38/p38的比值，下调p‑p38/p38的比值和Nrf2蛋白的表达，与模型组比较差异均具有统计学意义（P<0.01）。 结论 人参皂苷Rd通过抑制TLR4/TRAF6/NF‑κB/iNOS通路的激活从而抑制巨噬细胞M1型极化，从而改善NASH相关性炎症。此外，人参皂苷Rd还通过抑制ROS/P38/Nrf2轴促进自噬，从而抑制巨噬细胞M1型极化，增加抗炎效果。

Abstract

Objective To elucidate the effects of ginsenoside Rd on the TLR4/TRAF6/NF‑κB/iNOS pathway and M1 macrophage polarization， thereby clarifying its molecular mechanism in treating non‑alcoholic steatohepatitis （NASH）. Methods Murine monocytic macrophage leukemia cells RAW264.7 were randomly divided into the control group， model group， low‑dose ginsenoside Rd group， high‑dose ginsenoside Rd group， and inhibitor group. Except for the control group， the remaining groups were induced with lipopolysaccharide to establish the model， followed by intervention with the corresponding drugs. Enzyme‑linked immunosorbent assay was employed to determine the concentrations of pro‑inflammatory factors （TNF‑α， IL‑6， and IL‑1β）. The percentage of M1 macrophages was measured by flow cytometry. The expression of related molecules in the TLR4/TRAF6/NF‑κB/iNOS pathway， autophagy， and ROS/p38/Nrf2 pathway was detected by Western blot and biochemical methods. The changes in macrophage autophagy levels were observed by transmission electron microscopy. Results Compared to the model group， the levels of inflammatory factors （TNF‑α， IL‑6， and IL‑1β） and the proportion of M1 macrophages were significantly reduced in the ginsenoside Rd groups. The expression of TLR4， TRAF6， iNOS and nuclear p65 proteins showed notable downregulation， whereas the nuclear p65 protein expression was significantly upregulated， and the differences were statistically significant （P<0.01）. Additionally， ginsenoside Rd significantly increased the activity of SOD and the content of GSH， reduced the content of MDA， upregulated the expression of Beclin1 protein and the ratio of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ， and downregulated the expression of cytoplasmic p62， Nrf2 proteins， and the ratio of p‑p38/p38， with statistically significant differences compared to the model group （P<0.01）. Conclusion Ginsenoside Rd inhibits M1 macrophage polarization by suppressing the activation of the TLR4/TRAF6/NF‑κB/iNOS pathway， thereby alleviating NASH‑related inflammation. Furthermore， ginsenoside Rd promotes autophagy by inhibiting the ROS/p38/Nrf2 axis， which enhances the anti‑inflammatory effects by suppressing M1 macrophage polarization.

Graphical abstract

关键词

人参皂苷Rd / 非酒精性脂肪性肝炎 / 巨噬细胞极化 / 炎症反应

Key words

Ginsenoside Rd / Non‑alcoholic steatohepatitis / Macrophage polarization / Inflammatory response

非酒精性脂肪性肝炎（non‑alcoholic steatohepatitis，NASH）属于非酒精性脂肪性肝病（non‑alcoholic fatty liver disease，NAFLD）进展进程中的关键阶段，其主要的病理特点表现为肝细胞脂肪变性、炎症反应以及纤维化，可进一步发展为肝硬化和肝细胞癌^［1］。一项2023年的系统评价结果显示，全球NAFLD的患病率约为30%（其中NASH的患病率约为5.27%），且随着肥胖与代谢综合征的流行，其呈现逐年递增的趋势^［2］。因此，NASH已成为我国日益严峻的公共卫生问题，针对NASH的早期干预对于阻断疾病进展、改善患者预后具有重要意义。

巨噬细胞是一类广泛分布于全身组织的先天性免疫细胞，起源于骨髓中的单核细胞，在维持组织稳态、清除细胞碎片、抗原呈递以及调控炎症反应中发挥核心作用^［3］。巨噬细胞的活化表型具备高度的可塑性，可归为M1型（经典激活型）与M2型（替代激活型）两大类型^［4］。其中，巨噬细胞的M1型极化主要由干扰素‑γ（interferon‑gamma，IFN‑γ）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）通过Toll样受体4（Toll‑like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor kappa‑B，NF‑κB）等通路触发，其特征为高表达诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）并释放趋化因子和促炎因子，从而驱动炎症反应及组织损伤^［5］。

巨噬细胞极化已被证实参与NAFLD的发生、发展，且M1型巨噬细胞的水平与患者肝细胞损伤、血脂及促炎因子的水平呈显著正相关性^［6］。芪参汤能够通过调控巨噬细胞极化改善NASH的炎症反应和组织病理损伤^［7‑9］。人参皂苷Rd作为芪参汤的主要活性成分，已被证实可以抑制NALFD相关炎症反应^［10］。此外，人参皂苷Rd还可以抑制巨噬细胞M1型极化，从而改善缺血再灌注诱导的肾损伤^［11］。因此，本研究通过观察人参皂苷Rd对TLR4/肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor‑associated factor 6，TRAF6）/NF‑κB/iNOS通路介导的巨噬细胞M1型极化的影响，阐明其抑制肝脏炎症反应治疗NASH的分子机制，为芪参汤在NAFLD防治中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7采购自中国典型培养物保藏中心（细胞编号为GDC0143）。取RAW264.7置于37 ℃水浴锅中充分融化，随后接种于含10%胎牛血清和1%青霉素‑链霉素溶液的DMEM培养基中，轻轻摇匀，置于37 ℃、含5%CO₂的培养箱中予以培养。当细胞生长到融合度至80%~90%，即可传代，以用于后续的实验。本研究经黑龙江省中医药科学院实验动物伦理委员会批准（SY3R‑2022035）。

1.2 药物

人参皂苷Rd（纯度≥98%，分子量：946.12 g/mol，CAS号：52705‑93‑8）购于美国Sigma‑Aldrich公司（货号为SML4126）。使用前，称取9.46 mg人参皂苷Rd，加入1 mL二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）中，配制成10 mmol/L储备液。采用梯度稀释法配制工作液：（1） 取10 µL储备液加入990 µL培养基，混匀后得到100 µmol/L中间液；再取10 µL中间液加入990 µL培养基，得到1 µmol/L工作液。（2）分别取5 µL和20 µL储备液加入10 mL培养基，混匀后补充DMSO使终浓度为1‰得到5和20 μmol/L工作液。TLR4抑制剂TAK‑242（纯度≥98%，分子量：361.82 g/mol，CAS号：243984‑11‑4）购于美国Sigma‑Aldrich公司（货号为614316‑5MG）。使用前称取3.618 mg TAK‑242，加入1 mL DMSO中，充分溶解后配制成10 mmol/L储备液，随后取1 µL储备液，加入1 mL培养基中，得到10 μmol/L的TAK‑242工作液^［12］。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）采购自北京Solarbio科技有限公司（货号为L8880）。

1.3 试剂与仪器

高效RIPA裂解液、DMSO、DMEM培养基与BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自北京Solarbio科技有限公司（货号为11995、D8371、PC0020和R0010）。小鼠白细胞介素‑6（Interleukin‑6，IL‑6）、肿瘤坏死因子‑α（Tumor necrosis factor‑α，TNF‑α）与IL‑1β均购自上海JONLNBIO公司（货号分别为JL10484‑48T、JL2026848T和JL18442‑48T）。APC偶联的F4/80、PE偶联的iNOS、TRAF6和iNOS单克隆抗体购自美国CST公司（货号分别为#86007、#14792、#8028和#13120）。TLR4、NF‑κB p65、Beclin1、LC3、p62、GAPDH和Histone H3一抗均购自武汉Proteins公司（货号分别为19811‑1‑AP、10745‑1‑AP、11306‑1‑AP、14600‑1‑AP、18420 ‑1‑AP、60004‑1‑Ig和17168‑1‑AP）。细胞核和细胞质提取试剂盒购于美国ThermoFisher公司（货号为78833）。p38 MARK、phospho‑p38和Nrf2一抗购于上海碧云天生物科技有限公司（货号分别为AF1111、AF5887和AF7623）。羊抗兔辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）二抗购自于英国Abcam公司（货号为ab6721）。谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）以及超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）试剂盒均购于南京建成生物工程研究所（货号分别为A006‑2‑1、A003‑1‑2和A001‑3‑2）。流式细胞仪购于德国Beckman Coulter公司（型号为CytoFLEX）。酶标仪购于美国ThermoFisher公司（型号为Multiskan GO）。凝胶成像系统购于上海天能生命科学有限公司（型号为MINI Space 3000）。透射电子显微镜购于日本日立公司（型号为HT7800）。细胞培养箱购于深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司（型号为D165HT）。电泳槽及电泳仪均购自于美国Bio‑Rad公司（型号分别为EPT‑VPG02和Mini‑Sub‑GT）。

1.4 细胞分组与药物干预

取对数生长期的RAW264.7细胞，胰酶消化后离心（1 000 r/min，3 min），弃上清后加入完全培养基。细胞以完全培养基重悬后调整细胞密度，并以2×10⁵个/孔将细胞接种于6孔板中培养至贴壁，随后分为5组：空白组、模型组、人参皂苷Rd低、高剂量及抑制剂组，每组设6个复孔。除外空白组，其余各组均按照文献［13］中的方法以LPS（1 µg/mL）构建细胞模型。随后各组分别给予相应的药物进行干预，具体如下：（1） 空白组：1‰DMSO的无血清培养基；（2） 模型组：1 µg/mL LPS；（3）人参皂苷Rd低剂量：1 µg/mL LPS +5 μmol/L人参皂苷Rd溶液；（4） 人参皂苷Rd高剂量：1 µg/mL LPS +20 μmol/L人参皂苷Rd溶液；（5） 抑制剂组：1 µg/mL LPS +10 μmol/L TAK‑242。将6孔板置于培养箱（37 ℃和5% CO₂）中24 h，收集细胞。

1.5 指标检测

1.5.1 酶联免疫吸附试验

取“1.4”部分中RAW264.7细胞，离心（1 000×g，20 min）取上清。参照试剂盒说明书，采用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度值（OD值）。根据标准品的OD值绘制标准曲线，计算待测样本中TNF‑α、IL‑6和IL‑1β的浓度。

1.5.2 流式细胞术

取“1.4”部分中RAW264.7细胞，离心（300×g，5 min）后弃上清。以预冷的PBS重悬并调整细胞密度为1×10⁶个细胞/mL。取100 μL细胞悬液分别加入F4/80‑APC及iNOS‑PE抗体，避光室温孵育30 min。以含1%BSA的PBS洗涤×2，并重悬于300 μL流式上样缓冲液。上流式细胞仪检测。采用FlowJo软件进行分析，以F4/80⁺iNOS⁺细胞标记为M1型巨噬细胞。

1.5.3 蛋白印迹法

收集“1.4”中RAW264.7细胞，弃培养基后用预冷的PBS洗涤×2次。加入RIPA裂解液以冰浴条件下裂解30 min。裂解产物以4 ℃离心（12 000×g，15 min），收集上清。采用BCA法在酶标仪562 nm波长处测定蛋白浓度。调整至同一上样量后进行SDS‑PAGE。随后将凝胶中的蛋白转至PVDF膜。将膜浸至5%脱脂牛奶中室温振荡封闭1 h，随后加入适当比例稀释的TLR4、TRAF6、NF‑κB p65、iNOS、Beclin1、LC3、p62、p‑p38 MAPK、p38、Nrf2和GAPDH一抗，4 ℃孵育过夜。次日以TBST洗涤×3次，加入HRP标记的二抗后与室温孵育1 h。将ECL化学发光试剂均匀覆盖在膜上，避光反应1 min，凝胶成像系统成像，采用ImageJ软件分析各条带灰度值。此外，采用细胞质和细胞核蛋白分离试剂盒分离细胞质和细胞核蛋白，采用GAPDH和Histone H3作为细胞质和细胞核内参，检测NF‑κB p65蛋白在细胞质和细胞核的分布水平。

1.5.4 透射电镜检测

收集“1.4”中RAW264.7细胞，采用2.5%戊二醛固定2 h、1%锇酸固定1 h，梯度乙醇脱水后采用环氧树脂渗透与包埋。超薄切片机切取50 nm切片并收集于铜网上，利用醋酸铀及柠檬酸铅染色。染色时间分别为15 min和5 min。双蒸馏水漂洗并晾干。采用透射电镜观察RAW264.7细胞自噬体结构。

1.5.5 生化检测

收集“1.4”中RAW264.7细胞，PBS洗涤×2次，加入适量胰酶进行细胞消化3 min，离心（800×g，5 min）并收集细胞沉淀。向沉淀中加入RIPA裂解换成液，于冰上裂解30 min。裂解后，在4 ℃环境下离心（12 000×g，15 min）后取上清。按照试剂盒的说明书操作流程检测各组细胞中GSH与MDA的含量及SOD的活力。

1.6 统计学处理

本研究数据以均数±标准差（\overline{x}\pm s）形式呈现，分析通过SPSS 29.0完成。两组数据间的差异采用Student′s t检验，多组数据间的比较则使用单因素方差分析。统计显著性水平设定为P<0.05。

2 结果

2.1 人参皂苷Rd对巨噬细胞炎症的影响

模型组巨噬细胞上清中TNF‑α、IL‑6及IL‑1β含量较空白组显著升高，差异均具备统计学意义（P<0.01）。相较于模型组，人参皂苷Rd低、高剂量与抑制剂组中TNF‑α、IL‑6及IL‑1β含量均显著下降，差异均具备统计学意义（P<0.01）。见表1。

2.2 人参皂苷Rd对巨噬细胞M1极化的影响

相比于空白组，模型组M1型巨噬细胞的百分比显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。经人参皂苷Rd低、高剂量和抑制剂干预后，各组M1型巨噬细胞的百分比均显著下降，差异均有统计学意义（P<0.01）。见表2和图1。

2.3 人参皂苷Rd对巨噬细胞TLR4/TRAF6/NF‑κB/iNOS通路的影响

与空白组相比，模型组巨噬细胞中TLR4、TRAF6、iNOS和细胞核p65蛋白的表达显著上调，细胞质p65蛋白的表达显著下调，差异均具有统计学意义（P<0.01）。与模型组相比，人参皂苷Rd低、高剂量和抑制剂干预均可显著抑制巨噬细胞TLR4、TRAF6、iNOS与细胞核中p65蛋白的表达水平，增加巨噬细胞细胞质中p65蛋白的表达水平，差异均具备统计学意义（P<0.01）。见图2和表3、4。

2.4 人参皂苷Rd对巨噬细胞自噬的影响

透射电镜结果显示，空白组巨噬细胞呈现正常的自噬活动特征，存在一定数量的自噬体和自噬溶酶体。与空白组相比，模型组细胞内自噬体和自噬溶酶体的数量明显减少，可见极少量双层膜结构的自噬体以及融合后的自噬溶酶体。相较于模型组，人参皂苷Rd低、高剂量及抑制剂组中巨噬细胞内自噬体和自噬溶酶体的数量显著增多，自噬体清晰可见其典型的双层膜包裹着待降解的胞质成分，自噬溶酶体则呈现出内部物质被降解的特征性超微结构。见图3。

Western blot结果显示，相较于空白组，模型组巨噬细胞Beclin1蛋白的表达与LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值均明显降低，而p62蛋白的表达则显著增加，差异均具备统计学意义（P<0.01）。相较于模型组，人参皂苷Rd低、高剂量及抑制剂干预均能显著上调巨噬细胞中Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，下调细胞质中p62蛋白的表达水平，差异均具备统计学意义（P<0.01）。见表5和图3B。

2.5 人参皂苷Rd对巨噬细胞ROS/p38/Nrf2通路的影响

生化检测结果所示，相比于空白组，模型组中巨噬细胞SOD的活力与GSH的含量均显著下降，且MDA的含量显著增加，差异均具备统计学意义（P<0.01）。相较于模型组，人参皂苷Rd低、高剂量与抑制剂干预均可不同程度增加巨噬细胞SOD的活力与GSH的含量，并降低MDA的含量，差异均具备统计学意义（P<0.05）。除此之外，模型组中巨噬细胞p‑p38/p38的比值与Nrf2蛋白的表达均较空白组显著上调，差异均具备统计学意义（P<0.01）。相较于模型组，人参皂苷Rd低剂量、高剂量和抑制剂均能明显降低p‑p38/p38的比值与细胞中Nrf2蛋白的表达水平，差异均具备统计学意义（P<0.05）。然而，p38蛋白的表达在各组间均未见明显的变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见表6、7和图4。

3 讨论

炎症反应是NASH的核心病理特征之一，靶向炎症的治疗是改善纤维化进程的关键^［14］。过量的游离脂肪酸通过毒性脂质诱导细胞应激，并通过线粒体途径和内质网应激触发肝细胞凋亡。在趋化因子的作用下，多种类型的免疫细胞被招募到损伤部位，进一步加剧炎症反应，促进NASH的进展。此外，持续的炎症通过激活肝星状细胞，促使细胞外基质过度沉积，导致肝纤维化的形成^［15］。TNF‑α是一种三聚体蛋白，主要由活化的巨噬细胞、单核细胞、T细胞、B细胞、成纤维细胞以及脂肪细胞等分泌。研究证实，巨噬细胞中TNF‑α通过导致泛素化导致肝细胞Miz1表达减少，并通过抑制肝细胞线粒体自噬和加剧线粒体损伤，促进NASH的发生^［16］。IL‑6是一种多效性的细胞因子，参与组织稳态、再生和代谢^［17］。研究证实，NASH患者外周血中IL‑6的表达显著增加，且与循环白细胞和单核细胞数量呈正相关^［18］。IL‑1β是炎症反应的核心介质，参与免疫调节、细胞增殖、凋亡和组织修复等多种生物学过程。已有研究证实，巨噬细胞通过分泌促炎因子IL‑1β与IL‑6，进而诱导肝细胞损伤及肝纤维化的形成^［19］。作为M1型巨噬细胞的标记分子，iNOS已被证实通过调节巨噬细胞自噬，促进NAFLD的进展^［20］。本研究结果表明，人参皂苷Rd能够显著抑制巨噬细胞中TNF‑α、IL‑6和IL‑1β的分泌。进一步研究表明，LPS显著增加M1型巨噬细胞的水平，而人参皂苷Rd能够显著抑制M1型巨噬细胞的分化，从而抑制肝脏炎症反应。

TLR4属于Toll样受体家族，通过识别病原体相关分子模式，从而启动炎症反应。在髓样分化因子2（Myeloid differentiation factor 2，MD‑2）的作用下，TLR4识别并结合LPS形成TLR4‑MD‑2‑LPS复合物，进而诱导TLR4二聚化并激活下游信号通路^［21］。TRAF6作为E3泛素连接酶，通过K63泛素化修饰自身，形成多聚泛素链^［22］。TRAF6的K63泛素链作为支架，招募并激活转化生长因子β激活激酶1促进IKK复合物中的IKKβ亚基的磷酸化，从而促进p65的细胞核易位^［23］。细胞核中p65通过结合iNOS启动子并募集转录共激活因子促进iNOS的转录^［24］。本研究结果表明，LPS能够通过激活TLR4/TRAF6/NF‑κB通路促进巨噬细胞iNOS的表达。而人参皂苷Rd通过抑制TLR4/TRAF6/NF‑κB/iNOS通路的激活从而抑制巨噬细胞M1型巨噬细胞的分化。

细胞自噬是一种高度保守的细胞内降解过程，在维持细胞稳态、应对应激和调节免疫反应中起重要作用^［25］。细胞自噬已被证实可通过抑制NF‑κB的活性，减少iNOS的转录，参与巨噬细胞极化调控^［26］。在本研究中，LPS显著抑制巨噬细胞的自噬水平，包括细胞内自噬体和自噬溶酶体的数量明显减少，Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值显著下调，p62蛋白的表达显著上调。而人参皂苷Rd能够显著促进巨噬细胞的自噬水平，从而抑制巨噬细胞的M1型极化。为进一步明确人参皂苷Rd促进细胞自噬的分子机制，本研究通过检测巨噬细胞中ROS/P38/Nrf2的表达，从而进一步明确人参皂苷Rd在NASH中的作用机制。

在LPS的作用下，TLR4激活并导致线粒体功能障碍和NADPH氧化酶的活化，导致ROS的过量生成^［27］。SOD、MDA和GSH作为氧化应激的关键标志物，当前研究证实人参皂苷Rd低剂量、高剂量与抑制剂均可不同程度地增加巨噬细胞SOD的活力及GSH的含量，并降低MDA的含量，从而改善细胞氧化应激损伤。ROS的过量生成通过氧化MKK3/MKK6的半胱氨酸残基促进p38 MAPK的磷酸化^［28］。Nrf2是抗氧化反应的主要转录因子，其活性受Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）的调控。p38 MAPK的磷酸化促进Nrf2从Keap1解离，从而转位至细胞核^［29］。Nrf2进入细胞核后，通过结合ARE序列调控p62的表达^［30］。p62作为自噬接头蛋白，LC3相互作用区域与LC3结合，促进自噬体的形成。本研究结果证实LPS可显著促进巨噬细胞p38 MAPK蛋白的磷酸化并上调Nrf2蛋白的表达水平。而人参皂苷Rd通过下调p‑p38/p38的比值和Nrf2蛋白的表达，从而抑制p62的表达，进而促进细胞自噬。

综上所述，当前的研究证实人参皂苷Rd通过抑制TLR4/TRAF6/NF‑κB/iNOS信号通路，显著减少巨噬细胞中TNF‑α、IL‑6和IL‑1β的分泌，从而抑制M1型巨噬细胞的分化和肝脏炎症反应。同时，人参皂苷Rd通过下调ROS/p38 MAPK/Nrf2信号轴，减少p62的表达，促进巨噬细胞自噬，缓解氧化应激和细胞损伤。该研究揭示了人参皂苷Rd通过调控炎症和自噬双重机制，为芪参汤在NASH治疗中的应用提供了重要的科学依据和理论支持。

作者贡献度说明：

路瑶和李婧：完成实验；王炳予：指标检测，袁星星：设计实验，实验数据进行统计，并撰写论文。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

黑龙江省自然科学基金优秀青年项目(YQ2022H015)