重组旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂在脓毒症急性肝损伤治疗中的研究

Study on recombinant trichinella spiralis cystatin protease inhibitor in the treatment of acute liver injury in sepsis

摘要

目的 探讨重组旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂（recombinant trichinella spiralis cystatin protease inhibitor，rTS⁃Cys）在脓毒症急性肝损伤治疗中的潜在作用。 方法 雄性C57BL/6小鼠随机分为7组（n=10）［Sham组、CLP组、CLP+rTS⁃Cys组（包括10、20、30、40 μg 4组）、CLP+DEX组］。CLP和CLP+rTS⁃Cys组采取盲肠结扎穿孔法建立小鼠脓毒症急性肝损伤小鼠模型，Sham组行开腹后不做其他处理，立即缝合关腹。术后1 h，CLP组腹腔注射100 μL PBS，CLP+rTS⁃Cys组腹腔注射含不同剂量rTS⁃Cys的100 μL PBS，CLP+DEX组使用等量的地塞米松药物。24 h后，处死小鼠，通过H&E染色评价肝脏病理变化；ELISA法检测血清中TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃10、TGF⁃β的表达水平；于全自动生化分析仪检测血清中ALT和AST水平；采用Western blot法检测NF⁃κB/MAPK信号通路蛋白的表达情况。 结果 生存分析提示rTS⁃Cys能提高脓毒症小鼠的存活率，20 μg组小鼠术后72 h存活率最高，进入后续实验。H&E染色结果显示CLP组肝组织结构紊乱和炎症细胞浸润，CLP+rTS⁃Cys和CLP+DEX组小鼠肝组织较CLP组病理损伤减轻，炎症细胞浸润明显减少；ELISA结果显示小鼠血清TNF⁃α、IL⁃6水平比较：CLP组较Sham组明显升高，CLP+rTS⁃Cys和CLP+DEX组较CLP组降低；IL⁃10、TGF⁃β水平比较：CLP组较Sham组升高，CLP+rTS⁃Cys和CLP+DEX组较CLP组升高；肝功能分析ALT和AST结果显示CLP组较Sham组明显升高，CLP+rTS⁃Cys和CLP+DEX组较CLP组降低。Western blot结果显示CLP组NF⁃κB/MAPK信号通路蛋白表达量上调，CLP+rTS⁃Cys组的该通路表达较CLP组下调。 结论 rTS⁃Cys可通过下调NF⁃κB/MAPK信号通路抑制促炎细胞因子的表达，并促进调节性细胞因子的表达，进而保护脓毒症诱发的急性肝损伤。

Abstract

Objective To investigate the potential role of recombinant trichinella spiralis cystatin protease inhibitor （rTS⁃Cys） in the treatment of acute liver injury in sepsis. Methods Male C57BL/6 mice were randomly divided into 7 groups（n=10） ［Sham group， CLP group， CLP + rTS⁃Cys group （ including 10，20，30，40 μg ）， CLP + DEX group］. The CLP and CLP+ rTS⁃Cys groups were used to establish a mouse model of sepsis⁃induced acute liver injury by cecal ligation and puncture. The Sham group underwent laparotomy without other treatment， and the abdomen was closed immediately. One hour later， 100 μL PBS was intraperitoneally injected in the CLP group mice， and 100 μL PBS containing different doses rTS⁃Cys was intraperitoneally injected in the CLP+rTS⁃Cys groups mice， and the same amount of dexamethasone was used in the CLP+DEX group. After 24 hours， the mice were sacrificed and the pathological changes of the liver were evaluated by H&E staining. The expression levels of TNF⁃α， IL⁃6， IL⁃10 and TGF⁃β in serum were detected by ELISA. The levels of ALT and AST in serum were detected by automatic biochemical analyzer. The expression of NF⁃κB / MAPK signaling pathway proteins was detected by Western blot. Results Survival analysis suggested that rTS⁃Cys could improve the survival rate of septic mice，The 20 μg group of mice exhibited the highest survival rate at 72 h post-operation and proceeded to the subsequent experiments. H&E staining results showed that the liver tissue structure of the CLP group was disordered and inflammatory cell infiltration was observed. Compared to the CLP group， the pathological damage of the liver tissue in the CLP+rTS⁃Cys group and CLP+DEX group was alleviated， and the inflammatory cell infiltration was significantly reduced. ELISA analysis demonstrated distinct patterns in inflammatory markers. Serum TNF⁃α and IL⁃6 levels were significantly elevated in the CLP group compared to the Sham group， with subsequent reduction observed in the CLP+rTS⁃Cys group and CLP+DEX group. Conversely， anti⁃inflammatory cytokines IL⁃10 and TGF⁃β showed progressive increases across groups， with CLP levels exceeding Sham values， and CLP+rTS⁃Cys group and CLP+DEX group exhibiting the highest levels. Liver function parameters， including ALT and AST， were markedly elevated in the CLP group compared to Sham controls， while treatment with rTS⁃Cys and DEX effectively lowered these enzyme levels below those observed in the CLP group. Western blot results showed that the expression of NF⁃κB / MAPK signaling pathway protein was up⁃regulated in the CLP group， and the expression of this pathway in the CLP+rTS⁃Cys group was lower than that in the CLP group. Conclusion rTS⁃Cys can inhibit the expression of pro⁃inflammatory cytokines and promote the expression of regulatory cytokines by down⁃regulating the NF⁃κB/MAPK signaling pathway， thereby protecting sepsis⁃induced acute liver injury.

Graphical abstract

关键词

重组旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂 / 脓毒症 / 肝损伤 / 抗炎

Key words

Recombinant trichinella spiralis cystatin protease inhibitor / Sepsis / Liver injury / Anti⁃inflammatory

脓毒症（sepsis）是一种由感染引发的全身炎症反应综合征，严重时可导致多脏器功能障碍和脓毒症休克，伴随着较高发病率和高死亡率^［1］。肝脏作为人体的重要代谢和解毒器官，在脓毒症过程中极易受损，脓毒症诱发的肝损伤被认为是重症监护病房死亡的独立预测因素之一^［2］。脓毒症肝损伤（sepsis⁃induced liver injury，SILI）的发病机制复杂，涉及炎症风暴、氧化应激、免疫失调等多个方面。目前，对于脓毒症的治疗策略，多采用血流动力学管理、皮质类固醇、抗炎和免疫刺激、肾脏替代疗法和细胞因子去除、一般监护治疗法^［3］，现今尚无有效的治疗手段。因此，寻找新的治疗手段是亟待解决的问题。

随着“卫生学假说”的提出，寄生虫感染与自身免疫性疾病之间的关系越来越受到关注^［4，5］。蠕虫通过复杂的逃避机制，影响宿主的免疫反应，使其在宿主体内长久生存。流行病学、实验室及临床的研究表明：蠕虫感染有一定的抗炎、免疫调节作用及改善宿主代谢的作用^［6⁃8］。旋毛虫（trichinella spiralis）是因食用生肉而寄生于人体的寄生虫，虽然没有出现与人之间的传播，但是蠕虫直接感染人体风险较大^［9］。蠕虫蛋白是从蠕虫中提取的生物活性物质，具有多种药理作用，包括抗炎、抗氧化、免疫调节等。近年来，蠕虫蛋白在多种疾病模型中的治疗潜力逐渐受到关注，已有研究表明，蠕虫分泌蛋白及衍生物胱抑素（cystatin）在一些自身免疫性疾病治疗方面显示出希望。例如，Schistosoma japonicum Cystatin已被证明可以抑制脓毒症中的炎症反应^［10］，减轻脓毒症诱导的心肌病^［11］。Cystatin SN对哮喘有治疗作用^［12］。前期鉴定并证实了重组旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂（recombinat trichinella spiralis Cystatin，rTS⁃Cys）是一个虫源性免疫抑制因子，其能明显抑制CLP刺激的脓毒症炎症性因子的释放，但其在SILI治疗中的应用尚未得到充分研究^［13］。本文通过文献回顾和实验研究，探讨蠕虫蛋白rTS⁃Cys在SILI治疗中的潜在价值，为临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性C57BL/6小鼠，6周龄，体质量约20 g，购自合肥市蜀山区玉丰畜牧养殖经营部［许可证号：SCXK（浙）2024⁃0004］。实验前适应环境1周，自由饮水和摄食。已通过蚌埠医科大学实验动物管理和伦理委员会伦理审查，伦理编号：伦动科批号（2024）第573号。

1.2 主要试剂

炎症因子ELISA试剂盒：肿瘤坏死因子⁃α（TNF⁃α）、白细胞介素⁃6（IL⁃6）、白细胞介素⁃10（IL⁃10）、转化生长因子β（TGF⁃β）购自达科为生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购于碧云天生物技术公司；快速转膜液及PAGE凝胶快速制备盒购于雅梅生物公司，RIPA及电泳液购自Biosharp生物科技公司；兔抗小鼠NF⁃κB p65及p⁃NF⁃κB p65抗体、MAPK及p⁃MAPK抗体、anti rabbit IgG抗体购于CellSignaling Technology公司。

1.3 实验方法

1.3.1 rTS⁃Cys表达与纯化

首先基于GenBank中TS⁃Cys的序列，使用PAS技术合成目的基因。将合成的基因片段通过NdeⅠ和XbaⅠ限制性内切酶双酶切后，克隆至pCzn1表达载体中。重组质粒转化至TOP10菌株中进行克隆扩增，筛选阳性克隆并测序验证。将正确的重组质粒pCzn1⁃TS⁃Cys转入表达菌株ArcticExpress （DE3）中，通过IPTG诱导表达目的蛋白，并用7.5% SDS⁃PAGE电泳验证纯度。最后采用BCA法测定蛋白浓度，将纯化的蛋白分装后储存于-80 ℃，以备后续实验使用。

1.3.2 动物分组与模型建立

（1）小鼠随机分为7组（每组n=10）：假手术（Sham）组、模型（CLP）组、蠕虫蛋白治疗（CLP+rTS⁃Cys，包括10、20、30、40 μg 4组）组、地塞米松对照（CLP+DEX）组。假手术组仅剖腹后立即缝合关闭腹腔；模型组、治疗组小鼠采用盲肠结扎穿孔（CLP）建立脓毒症肝损伤模型。假手术组腹腔注射100 μL生理盐水。治疗组于模型建立后0.5 h，分别给予10、20、30、40 μg rTS⁃Cys蛋白溶于100 μL生理盐水腹腔注射。地塞米松对照组给予等量地塞米松药物，然后正常饲养24 h，期间观察并记录各组小鼠的一般情况。24 h后每组随机选取3只做样本采集，其余小鼠继续正常饲养观察2~3 d。CLP+rTS⁃Cys组小鼠选取最高存活率组做后续实验。

（2） SILI模型建立：雄性C57BL/6小鼠在动物房适应性饲养1周后，术前禁食12 h，允许正常饮水。麻醉采用腹腔注射4%的水合氯醛，剂量为0.2 mL/20 g。术后，去除腹部毛发，并将小鼠固定在手术板上，随后进行常规消毒。接着，在腹正中位置切开约1 cm，分离回盲部的远端三分之一，避免损伤血管，使用4号线进行结扎。然后，用无菌的18 G针头对已经结扎的肠管进行1次对扎，挤出适量的肠内容物。完成后，将盲肠复位，并按解剖层次闭合腹腔，再次进行常规消毒。手术结束后，注射500 μL生理盐水以防止休克。

（3） 评估生存率：术后72 h内，每隔12 h记录小鼠术后死亡及存活数。制作生存曲线。

1.3.3 样本采集与处理

（1） 肝功能丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）检测：治疗后24 h。通过小鼠眼球取血，静置2 h后离心收集血清，使用全自动生化分析仪检测小鼠血清中AST、ALT水平。使用ELISA试剂盒检测TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃10、TGF⁃β。

（2） H&E染色：取各组小鼠的肝脏组织，一部分固定于4%多聚甲醛中，对切片进行H&E染色。最后，用显微镜记录肺组织的形态学变化；另一部分冻存于-80 ℃，用于肝脏组织NF⁃κB、p⁃NF⁃κB、MAPK、p⁃MAPK表达水平检测。

（3） Western blot检测蛋白表达：取适量肝组织，低温研磨，充分裂解后，12 000 r/min离心10 min，留取上清，BCA法测定各组蛋白浓度后加上样缓冲液，99 ℃煮沸15 min。蛋白上样，10% SDS⁃PAGE 电泳（80 V电泳10 min后，转为150 V电泳50 min）；转膜（400 mA，30 min）至PVDF膜；快速封闭液封闭30 min；一抗4 ℃孵育过夜；二抗室温孵育1.5 h；ECL发光试剂盒，发光成像系统获取图像。使用ImageJ软件处理图像获取数据。

1.4 统计学处理

统计图采用Graphpad Prism 10.1.2绘制并进行统计分析。各组数据间的比较采用单因素方差分析，然后使用Turkey检验进行多重比较检验，生存曲线比较用Log⁃rank法，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 rTS⁃Cys蛋白的SDS⁃PAGE鉴定结果

SDS⁃PAGE显示，纯化后的rTS⁃Cys蛋白相对分子质量（Mr）约为49 kDa（图1）。

2.2 72 h生存率结果

不同剂量rTS⁃Cys治疗组中20 μg组小鼠72 h存活率最高（图2A），进入后续实验。Sham组小鼠饮食、精神状态及活动情况正常，72 h后100%存活；CLP组小鼠术后不主动进食、精神萎靡、抱团、很少活动，72 h后无存活（P<0.01）；CLP+rTS⁃Cys和CLP+DEX组小鼠术后有少量进食、精神状态较差，活动较少，较CLP组改善，72 h生存率为28%（P<0.05）和57%（P<0.01）（图2B）。

2.3 病理观察结果

H&E染色显示，Sham组小鼠肝细胞周围无炎症细胞浸润，肝小叶结构无明显损伤，CLP组肝脏组织出现明显炎症细胞浸润、肝细胞坏死和结构紊乱。蠕虫蛋白治疗后，CLP+rTS⁃Cys组和CLP+DEX组小鼠肝脏组织病理损伤减轻，炎症细胞浸润明显减少甚至消失，肝细胞结构得到一定程度的恢复（图3）。

2.4 炎症因子水平

ELISA结果显示，CLP组小鼠血清TNF⁃α、TGF⁃β、IL⁃6、IL⁃10水平较Sham组升高，尤其促炎因子TNF⁃α、IL⁃6升高明显（P<0.001）。与CLP组相比，CLP+rTS⁃Cys和CLP+DEX组血清促炎症因子TNF⁃α、IL⁃6水平下降（P<0.05），CLP+rTS⁃Cys和CLP+DEX组间差异无统计学意义，抑炎因子TGF⁃β、IL⁃10水平上升（P<0.05），但CLP+rTS⁃Cys的TGF⁃β较CLP+DEX组上升（P<0.05）（图4）。

2.5 肝功能指标

与Sham组相比，CLP组小鼠血清ALT、AST水平明显升高（P<0.001），表明脓毒症模型成功诱导了肝损伤。治疗后，与CLP组相比，CLP+rTS⁃Cys组小鼠的血清ALT、AST水平降低（P <0.01）。与CLP+rTS⁃Cys组相比，CLP+DEX组小鼠的血清ALT水平差异无统计学意义，AST水平明显升高（P<0.05）（图5）。

2.6 小鼠肝脏组织中NF⁃κB、p⁃NF⁃κB、MAPK、p⁃MAPK表达水平

Western blot结果显示，CLP组小鼠肝脏组织中NF⁃κB、p⁃NF⁃κB、MAPK表达量较Sham组上升（P<0.05）。蠕虫蛋白治疗后，CLP+rTS⁃Cys组目的蛋白表达量降低，与CLP组相比有明显差异（P<0.05）（图6）。

3 讨论

免疫失调的炎症反应在SILI的病理生理学中起着关键作用，本实验为治疗SILI提供一个研究方向。与其他类型的试剂相比，蠕虫蛋白作为天然产物因其副作用较小而受到越来越多的关注。广泛的免疫调节特性已经开始在自身免疫性疾病的临床试验中得到利用，包括炎症性肠病^［14］、类风湿性关节炎^［15］和1型糖尿病^［16］等。本研究探究rTS⁃Cys对CLP诱导的SILI小鼠的保护作用，并为其潜在治疗作用提供了新的证据。

脓毒症病理过程的干预方法在治疗中具有重要价值。自从“卫生学假说”提出以来，相关研究逐渐揭示了免疫失调性和炎症性疾病与蠕虫感染之间的密切联系。蠕虫直接感染发现风险较大，蠕虫分泌蛋白已成为更加安全的治疗替代品^［17］。蠕虫相关蛋白作为一种天然生物活性物质，已在多种疾病模型中显示出抗炎、抗氧化和免疫调节作用。已有研究证实，旋毛虫分泌产物rTS⁃Cys对多种小鼠免疫失调性疾病模型有治疗作用^{［18，19］}。本研究旨在通过构建肝损伤型脓毒症小鼠模型，探索rTS⁃Cys在治疗SILI中的可能作用。研究采用CLP法成功建立小鼠脓毒症模型，以模拟SILI患者的病理过程。在CLP术后24 h，小鼠表现出活动减少、精神萎靡的状态，同时血清中ALT和AST水平明显升高；肝组织病理切片染色显示肝小叶结构遭到破坏，并伴随炎症细胞浸润。此外，血清检测结果表明促炎因子TNF⁃α和IL⁃6的水平明显上升。这一系列结果与临床中SILI过程相符。

半胱氨酸蛋白酶被认为是调节炎症、细胞凋亡、癌症进展的关键分子^{［20，21］}。Cystatin是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，在调节免疫反应中起到重要作用。Cystatin作为蠕虫排泄⁃分泌ES抗原中的主要成分，在调节寄生宿主的免疫应答及逃避宿主免疫攻击中发挥重要作^［22］。寄生虫的Cystatin似乎通过至少两种协同作用的不同机制发挥作用，即蛋白酶的抑制和细胞因子的诱导，干扰宿主T细胞的增殖。Onchocerca volvulus cystatin对组织蛋白酶B的低抑制性以及对组织蛋白酶L和S的强烈抑制性，来抑制免疫细胞对抗原的加工和呈递作用。同时诱导IL⁃10表达，抑制抗原呈递并有利于 Th2 样反应的发展。Caenorhabditis elegans cystatin对组织蛋白酶 B的强烈抑制将促进抗原呈递作用，诱导IL⁃12和干扰素γ（IFN⁃γ）的表达，增强Th1样反应，增加了人外周血单核细胞PBMC的产生^［23］。蜱的唾液中含有丰富的蛋白酶抑制剂，蜱Cystatin可通过与组织蛋白酶结合来干扰抗原呈递和免疫细胞活化，如I.persulcatus 衍生的 sialostatin L1（Ip⁃sL1）和sL2（Ip⁃sL2）通过抑制组织蛋白酶 L和S对宿主免疫反应产生抑制作用，这种抑制作用阻止了宿主免疫细胞抗原递呈^［24］。旋毛虫可以调节宿主的免疫反应，为其长期生存保留合适的环境。有研究发现一种新的旋毛虫Cystatin（TsCstN），TsCstN 可能通过抑制组织蛋白酶 L 来干扰巨噬细胞的抗原呈递过程，从而影响 MHC⁃Ⅱ的表达，抑制炎性因子的产生，影响免疫应答^［25］。TsCstN通过负调节 STAT4/IL⁃12，以特异性抑制 IFN‑γ 的产生和阻断T细胞中Th1型免疫应答，从而引发抗炎和免疫抑制特性^［26］。研究结果表明，缺乏Cystatin C会导致脓毒症模型小鼠细胞自噬过程受损和信号通路失调，从而导致过度炎症^［27］。因此，Cystatin在免疫相关性疾病的治疗过程中具有一定潜力。

NF⁃κB p65/MAPK通路的激活被认为是炎症反应的主要参与者之一^［28］。在激活前，NF⁃κB p65与细胞质中的抑制因子IκBα结合。当细胞收到外界刺激，导致病原体相关分子模式（PAMPs）释放进入机体，与相关细胞模式识别受体（PRRs）结合后，招募下游信号分子，促使IκBα被其激酶IKK磷酸化，并通过泛素⁃蛋白酶体途径降解，使NF⁃κGB p65活化。活化的NF⁃κB p65转位入核，进而作为炎症基因的转录因子发挥作用。MAPKs是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，广泛参与细胞生长、分化、凋亡以及应激反应等过程的调控。该家族由多个亚型组成，各自承担着不同的生物学功能。其中最主要的是参与细胞外信号调控的蛋白激酶（ERK）、c⁃Jun N端激酶（JNK）、p38MAPK。其激活途径与NF⁃κB相似，磷酸化后，激活后的MAPK进入细胞核发挥作用^［29］。在脓毒症中，p38 MAPK激活后可以促进炎症因子的产生和释放，如TNF⁃α和IL⁃6，加剧炎症反应。越来越多的证据表明MAPKs也参与调控NF‑κBp65的转录活性^［30］。抑制TLR4/NF⁃κB信号通路能够改善氧化应激、线粒体功能障碍和炎症反应，从而缓解脓毒症相关急性肾损伤^［31］，使用双歧杆菌菌株抑制NF⁃κB/MAPK信号通路能够改善LPS诱导的炎症性肠病，抑制炎症因子，改善肠道功能^［32］。蜱cystatin可通过抑制TLR⁃NF‑κB、JAK⁃STAT和p38 MAPK的关键信号通路，减少免疫细胞浸润和细胞因子（NO、IL⁃1β、IL⁃6和TNF⁃α等）产生^［33］，发挥其抗炎和免疫抑制特性，确保蜱虫长期附着宿主。IL⁃10和TGF⁃β是维持免疫稳态的负调节因子，抑制过度的免疫反应，MAPK/NF⁃κB 信号传导参与调节IL⁃10和TGF⁃β的表达^{［34，35］}。旋毛虫T.britovi来源的Cystatin可减少小鼠脾细胞经LPS诱导的细胞因子TNF⁃α和IL⁃6的分泌，促进IL⁃10的分泌，发挥抗炎特性^［36］。rTS⁃Cys可以调节骨髓巨噬细胞分化，调控炎症因子释放^［37］。本研究发现rTS⁃Cys抑制脓毒症小鼠血清中促炎因子（TNF⁃α、IL⁃6）的释放，增加抑炎因子（TGF⁃β、IL⁃10）的产生。通过Western blot检测分析发现，CLP模型组小鼠肝脏组织中NF⁃κB p65和MAPK的磷酸化水平较Sham组明显升高，与上述NF⁃κB/MAPK信号通路调节炎症反应相符，经rTS⁃Cys治疗的脓毒症小鼠肝脏中 NF⁃κB p65和MAPK的磷酸化水平较CLP组降低，血清中促炎因子TNF⁃α、IL⁃6水平较CLP组明显降低，说明rTS⁃Cys可能通过抑制NF⁃κB、MAPK通路减轻炎症反应，改善小鼠脓毒症反应。

研究结果发现，rTS⁃Cys能够改善脓毒症小鼠的肝功能，降低血清ALT、AST水平，减轻肝脏组织病理损伤。这些结果表明其对脓毒症肝损伤具有一定的治疗作用。此外，rTS⁃Cys能够抑制促炎因子（TNF⁃α、IL⁃6）的释放，增加抑炎因子（TGF⁃β、IL⁃10）的产生，提示其具有良好的抗炎能力。rTS⁃Cys治疗的脓毒症小鼠肝脏中NF⁃κB p65和MAPK的磷酸化水平较CLP组降低，说明其改善小鼠脓毒症急性肝损伤的能力可能是通过抑制NF⁃κB/MAPK通路实现的。进一步证实了rTS⁃Cys的改善炎症和免疫调节作用。

综上所述，rTS⁃Cys作为寄生虫源性免疫调节剂，在缓解SILI的病理损伤、保护肝功能方面具有一定的作用，rTS⁃Cys是预防和治疗脓毒症急性肝损伤和其他炎症性疾病的潜在药物。然而，尽管如此，本研究仍然存在一些局限性，例如样本量较小以及观察时间较短等问题。因此，未来需要进一步深入研究rTS⁃Cys的作用机制、优化治疗方案，并评估其在临床中的应用效果，以期为脓毒症患者提供更安全有效的治疗选择。

作者贡献度说明：

杨立春：关键实验的进行以及实验数据的处理和文章撰写；周情毅：负责部分实验及稿件审校；蒲传航、严华悦、王胜威、汪雨姝、成浩源、胡小冬：参与实验动物饲养、相关指标检测、相关文献查阅与资料整合；褚亮：指导实验关键问题、文章审核、修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

厅级重点实验室开放课题(AHIAI2022K02)

蚌埠医学院2023年度研究生科研创新计划项目(Byycx23126)