芪蒡糖肾方调控Nrf2/Gpx4通路改善糖尿病肾病肾纤维化的机制研究

Mechanism of Qibang Tangshen Formula improving renal fibrosis in diabetic nephropathy via regulating the Nrf2/Gpx4 pathway

摘要

目的 研究芪蒡糖肾方对糖尿病肾病小鼠及高糖诱导的人肾皮质近曲小管上皮细胞HK2纤维化的保护作用。 方法 （1）体内实验：选取C57BL/6J雄性小鼠，采用高糖高脂饲料喂养+链脲霉素注射方法建立糖尿病肾病动物模型。造模成功后，将其分为正常组、模型组、达格列净组、芪蒡糖肾方低剂量组、芪蒡糖肾方中剂量组、芪蒡糖肾方高剂量组。连续给药12周，测定各组24 h尿蛋白（24 hpro）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）及肾组织内亚铁离子（Fe²⁺）水平。采用Masson染色观察肾组织病理损伤程度。采用Western blot检测Nrf2/Gpx4信号途径及下游纤维化相关蛋白的表达水平。（2）体外实验：采用CCK‑8检测细胞活力，筛选芪蒡糖肾方最佳干预浓度。采用Western blot检测Col3a1表达水平，确定造模条件。将HK2细胞分为正常组、高糖组、芪蒡糖肾方组、达格列净组。检测细胞内丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、Fe²⁺、活性氧（reactive oxygen species，ROS）的浓度与Nrf2/Gpx4信号途径及下游纤维化相关蛋白的表达水平。透射电子显微镜观察HK2细胞超微结构变化。 结果 （1）体内实验：与模型组相比，芪蒡糖肾方干预后，24 hpro、FBG、Scr以及肾组织内Fe²⁺水平下降（P<0.01）。除此之外，芪蒡糖肾方还能促进肾组织内Nrf2、Gpx4、E‑Cadherin、Slc7a11等蛋白的表达并降低α‑SMA、Col3a1及Vimentin的表达（P<0.05）。（2）体外实验：与高糖组相比，芪蒡糖肾方能明显降低细胞内的MDA、Fe²⁺和ROS浓度，改善线粒体损伤，同时增加细胞内GSH的含量（P<0.01）。除此之外，芪蒡糖肾方还能促进细胞内Nrf2、Gpx4、Slc7a11和E‑Cadherin蛋白的表达，而抑制α‑SMA、Col3a1和Vimentin蛋白的表达（P<0.01）。 结论 芪蒡糖肾方有助于改善糖尿病肾病肾纤维化，这可能与Nrf2/Gpx4信号传导途径的活化有关。

Abstract

Objective To investigate the protective effect of Qibang Tangshen Formula （QBTSF） on diabetic nephropathy mice and high glucose‑induced fibrosis of human renal cortical proximal tubular epithelial cells HK2. Methods （1） In vivo experiments： C57BL/6 J male mice were selected to establish an animal model of diabetic nephropathy by using high‑sugar and high‑fat feed+streptozocin injection， and after successful modeling， the mice were divided into a normal group， a model group， a dapagliflozin group， a QBTSF low‑dose group， a QBTSF middle‑dose group， and a QBTSF high‑dose group. The drug was administered continuously for 12 weeks， and the levels of 24 h urinary protein （24 hpro）， serum creatinine （Scr）， fasting blood glucose （FBG）， and ferrous ion （Fe²⁺） in renal tissues were measured in each group. Masson staining was used to observe the degree of renal histopathological damage. Western blot was used to detect the expression levels of Nrf2/Gpx4 signaling pathway and downstream fibrosis‑related proteins. （2） In vitro experiments： CCK‑8 was used to detect cell viability and screen the optimal intervention concentration of QBTSF. Western blot was used to detect the expression level of Col3a1 and determine the modeling conditions. The HK2 cells were divided into a normal group， a high glucose group， a QBTSF group， and a dapagliflozin group. The intracellular concentrations of malondialdehyde （MDA）， glutathione （GSH）， Fe²⁺， and reactive oxygen species （ROS） were measured， and the expression levels of Nrf2/Gpx4 signaling pathway and fibrosis‑related proteins were analyzed. Transmission electron microscopy was used to observe the ultrastructural changes of HK2 cells. Results （1） In vivo experiment： Compared to the model group， after the intervention of QBTSF， 24 hpro， FBG， Scr， and Fe²⁺ levels in renal tissues were decreased （P<0.01）. In addition， QBTSF could promote the expression of Nrf2， Gpx4， E‑Cadherin， and Slc7a11 proteins， as well as reduce the expression of α‑SMA、Col3a1， and Vimentin proteins in renal tissues （P<0.05）. （2） In vitro experiments： Compared to the high glucose group， QBTSF could significantly reduce intracellular MDA， Fe²⁺， and ROS concentrations and improve mitochondrial damage while increasing intracellular GSH content （P<0.01）. In addition，QBTSF promoted the expression of intracellular Nrf2， Gpx4， Slc7a11， and E‑Cadherin proteins， while inhibiting the expression of α‑SMA， Col3a1， and Vimentin proteins （P<0.01）. Conclusion QBTSF helps to improve renal fibrosis in diabetic nephropathy， which may be associated with the activation of Nrf2/Gpx4 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

芪蒡糖肾方 / 纤维化 / 铁死亡 / HK2

Key words

Qibang Tangshen Formula / Fibrosis / Ferroptosis / HK2

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病较为严重的并发症之一，也是终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）发生的关键因素之一^［1］。目前，DKD已经超越原发性肾小球疾病，成为中国血液透析新增患者的首位原因^［2］。其中，肾小管间质纤维化是DKD进展到ESRD的关键步骤^［3］，研究发现，肾小管间质纤维化与肾衰竭风险呈正相关^［4］。铁死亡被视为一种新兴的细胞程序性死亡机制，研究证实，铁死亡与DKD的氧化应激、炎症反应和肾小管纤维化有关^［5］。因此，通过调节铁死亡来改善肾小管纤维化可能是治疗DKD的一个潜在目标。

中医药在DKD的治疗过程中展现出了优势，具有副作用较小的特点^［6］。全国名老中医专家传承工作室指导老师、上海市名中医陈以平教授基于多年临床经验，提出DKD是虚实夹杂之证，并根据DKD在不同发展阶段的病机特点，将其分类为气阴两虚型、脾肾气虚型和脾肾阳虚型^［7］。其中陈以平教授专门针对DKD晚期经常出现的脾肾虚损证型，开发了芪蒡糖肾方，该方具有补脾益肾和行气活血的多重功效。早期的研究结果显示，芪蒡糖肾方可以有效地降低DKD患者的蛋白尿水平，并减缓肾功能的衰退，进而推迟ESRD的发展，但其作用机制尚不明确^［8，9］。因此，本项研究将从体内与体外实验探索芪蒡糖肾方对DKD小鼠与人肾皮质近曲小管上皮细胞HK2中Nrf2/Gpx4信号通路传导的影响，来深入了解芪蒡糖肾方在改善DKD方面的作用机制，从而为芪蒡糖肾方在临床上的推广应用提供科学的理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞

SPF级C57BL/6J小鼠60只，8周龄，雄性，购于上海中医药大学动物实验中心（上海必凯科翼生物科技有限公司）。动物生产许可证号：SCXK（沪）2023‑0009，实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2020‑0009。在室温22~25 ℃，相对湿度（55±10）%，12 h光暗交替环境中饲养。动物实验方案经上海中医药大学实验动物伦理委员会批准，符合规定伦理要求，批件编号：PZSHUTCM2402190002。实验细胞：HK2细胞，购于塞维尔生物（货号：STCC10303P）。

1.2 主要试剂及仪器

MEM培养基（货号：G4556）、胎牛血清（货号：G8002）、青链霉素混合液（货号：G4003）购于Servicebio公司；亚铁离子（Fe²⁺）含量测定试剂盒（货号：BC4355）购于Solarbio公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒（货号：S0033S）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（货号：S0131S）、CCK‑8试剂盒（货号：C0039）购于Beyotime公司；谷胱甘肽（glutathione，GSH）测定试剂盒（货号：A006‑2‑1）购于南京建成公司；GPX4抗体（货号：ab125066）购于abcam公司；Col3a1抗体（货号：A0817）购于ABclonal公司；Slc7a11（货号：26864‑1‑AP）、Nrf2（货号：16396‑1‑AP）、α‑SMA（货号：14395‑1‑AP）、Vimentin（货号：10366‑1‑AP）、E‑Cadherin（货号：20874‑1‑AP）、达格列净（批号：HY‑10450）购于MCE公司。

CO₂培养箱（型号：3111）、化学发光成像仪（型号：2102013）购于上海勤翔科学仪器有限公司；荧光倒置显微镜（型号：Eclipse Ti‑E）、酶标仪（型号：Synergy H1 MF）购于BioTek公司。

1.3 动物分组、造模、给药

先将C57BL/6J小鼠适应性喂养1周，之后除正常组（CON组）以外，喂养高糖高脂饲料并注射链脲霉素（50 mg·kg^‑1·d^‑1，溶解于柠檬酸钠缓冲液，0.1 mol/L，pH=4.5）。注射结束1周后，尾静脉采血测定小鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），若FBG>16.7 mmol/L即为造模成功，随后将其分为模型组（MOD组）、达格列净组（DAPA组）、芪蒡糖肾方低剂量组（QBTSF‑L组）、芪蒡糖肾方中剂量组（QBTSF‑M组）、芪蒡糖肾方高剂量组（QBTSF‑H组）。根据人与小鼠体表面积换算法进行计算，小鼠是人的9.1倍，故芪蒡糖肾方低、中、高剂量分别为：0.65、1.3、2.6 g·kg^‑1·d^‑1（中剂量为等效剂量），达格列净按照1.5 mg·kg^‑1·d^‑1给药，连续灌胃12周后处死。

1.4 标本的采集与检测

取材前1 d使用代谢笼收集小鼠尿液并检测血糖。取材前，每只小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠，眼球取血并取出小鼠肾脏样本，全血4 ℃下3 000 r/min离心20 min，取出上清储存于-80 ℃冰箱。

1.5 小鼠血肌酐（serum creatinine， Scr）、24 h尿蛋白（24 hpro）、FBG检测

肾组织Fe²⁺取材后，按照对应的说明书进行检测。

1.6 肾组织病理形态观察

右侧肾脏三分之一组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，用于Masson染色，剩余部分进行Western blot分析及试剂盒检测。

1.7 Western blot检测Nrf2/Gpx4相关通路蛋白及下游纤维化相关蛋白

取50 mg肾组织放于2 mL EP管，加入500 μL RIPA裂解液与2个钢珠一起研磨，取出上清。在使用BCA法测定蛋白浓度后，制作蛋白样本，并在变性后进行了电泳和湿转，然后在5%的BSA室温下封闭1 h；封闭完成后，使用Nrf2（1∶1 000）、Gpx4（1∶5 000）、Slc7a11（1∶1 000）、α‑SMA（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、E‑Cadherin（1∶1 000）、Col3α1（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶1 000）4 ℃过夜，洗膜后孵育二抗1 h，吸弃二抗，继续洗膜，ECL超敏发光液被浸泡孵育，并在显影仪中进行曝光显影，整个实验过程重复3次。

1.8 HK2细胞培养与分组

在37 ℃和5% CO₂的恒温培养箱中，使用含有10%胎牛血清和1%青链双抗糖浓度为5.6 mmol/L的完全培养基来培养HK2细胞。当细胞密度达到70%~80%时，进行消化细胞的后续实验操作。高糖诱导HK2细胞的造模基于课题组的预先实验数据和参考文献中的葡萄糖浓度（30 mmol/L glucose）进行^［10］。选择生长状况良好的指数生长阶段的细胞，进行常规的胰酶处理，并将其种植在6、24、96孔板上。当细胞的融合程度达到60%~70%时，将其分为4组进行干预，分别为正常组（NG组，5.6 mmol/L glucose）、高糖组（HG组，30 mmol /L glucose）、芪蒡糖肾方组（QBTSF组，30 mmol /L glucose+QBTSF）、达格列净组（DAPA组，20 μmol/L）。

1.9 芪蒡糖肾方药物制备

芪蒡糖肾方饮片从上海中医药大学附属龙华医院中药房购得，其药物成分包括：黄芪60 g、金蝉花10 g、三七粉3 g、黄精20 g以及葛根、山茱萸、僵蚕、川芎、牛蒡子、灵芝各15 g。将芪蒡糖肾方饮片浸泡在1 L的超纯水中，然后用不锈钢容器进行煎煮。首先用大火煮沸，接着转为中小火继续煎煮30 min。煎煮2次后，将滤液合并，并将滤液浓缩至100 mL，最后使用冷冻干燥机进行冻干处理。采用完整的培养基来配制中药的储备溶液，其浓度为10 mg/mL，在完全溶解后，进行过滤与分装，在-80 ℃下储存以备后用。

1.10 CCK‑8用于筛选芪蒡糖肾方的最佳干预浓度

在96孔板中，以1.0×10⁴个/孔的比例将生长状况良好的指数生长期细胞接种，然后在37 ℃、5% CO₂的培养箱中孵育36 h。之后，以0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL的浓度加入芪蒡糖肾方，并继续培养24 h。接下来，在每个孔中加入含有10% CCK‑8反应液的100 μL培养基，并在37 ℃的环境下避光孵育1 h。使用酶标仪在450 nm的波长上测量吸光度，计算细胞的存活率，并筛选出芪蒡糖肾方的最佳干预浓度。

1.11 ROS、GSH、Fe²⁺、MDA测定

将细胞培养在24孔板中，36 h后，各组加入对应的干预药物。干预完成后，移除培养基，并使用无血清培养基对细胞进行3次洗涤，接着按照所购买的ROS、GSH、Fe²⁺、MDA及对应抗体说明书进行检测。

1.12 Western blot检测铁死亡相关通路蛋白及纤维化相关蛋白

将细胞培养在6孔板中，36 h后，各组加入对应的干预药物。干预完成后，将培养基吸弃，然后用PBS清洗细胞2次。裂解离心提取蛋白，后续操作同“1.7”项。

1.13 透射电子显微镜观察各组HK2细胞超微结构

经过干预，HK2细胞被5%的戊二醛固定2 h，1%的锇酸也固定2 h。在4 ℃的温度条件下，分别使用50%、70%、90%的乙醇进行梯度脱水20 min；4 ℃、100%乙醇与100%环氧丙烷的等量混合液脱水20 min；4 ℃、100%环氧丙烷脱水20 min；在室温条件下，100%环氧丙烷脱水20 min。100%环氧丙烷与包埋液（2∶1）混合处理4 h，100%乙醇与100%环氧丙烷的等量混合液在室温下处理37 ℃，包埋液处理3 h。细胞在40 ℃ 2 h、 60 ℃ 4 h、80 ℃ 10 h的温度下进行固化处理。进行超薄的切片处理，然后用醋酸铀和枸橼酸铅进行染色，最后在透射电子显微镜下进行观察。

1.14 统计学处理

使用SPSS 26.0软件进行数据分析，GraphPad Prism 8.0软件制图。符合正态分布的计量资料以\overline{x}\pm s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD检验；不符合正态分布的数据采用非参数检验进行分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠生化指标及肾组织内Fe²⁺水平

与CON组比较，MOD组小鼠24 hpro、Scr、FBG与肾脏内Fe²⁺水平明显升高（P<0.01）；与MOD组比较，QBTSF‑M组FBG明显下降（P<0.01），QBTSF‑H组与DAPA组小鼠24 hpro、Scr、FBG及肾脏内Fe²⁺明显下降（P<0.01），见表1。

2.2 各组小鼠肾脏组织病理的变化

Masson染色结果显示，CON组肾组织结构完整，肾小球和肾小管结构清晰可见，未有纤维化的改变；MOD组肾组织可见较为明显的胶原纤维沉积，系膜区纤维化增生及肾小管胶原纤维沉积；药物治疗后，肾小球系膜区增生与胶原纤维沉积较模型组有不同程度减轻；其中QBTSF‑M、QBTSF‑H组与DAPA组肾纤维化面积相较于MOD组明显减少（P<0.01），见图1。

2.3 各组小鼠Nrf2/Gpx4信号通路及下游纤维化蛋白的表达

与CON组相比，MOD组肾组织中Nrf2、Gpx4、Slc7a11、E‑Cadherin表达水平明显下降（P<0.01），而α‑SMA、Vimentin、Col3a1表达水平明显升高（P<0.01）；与MOD组相比，QBTSF‑L组肾组织中Col3a1表达水平明显下降（P<0.05）；QBTSF‑M组肾组织中Nrf2、E‑Cadherin表达水平上升而Col3a1表达水平下降（P<0.05）；QBTSF‑H组与DAPA组肾组织中的Nrf2、Gpx4、Slc7a11、E‑Cadherin表达水平明显上升（P<0.01），而α‑SMA、Vimentin、Col3a1表达水平明显下降（P<0.01），见表2、图2。

2.4 不同浓度芪蒡糖肾方对HK2细胞活力的影响

当芪蒡糖肾方浓度逐渐升高后，达到4 mg/mL时细胞活力开始明显下降，且与2 mg/mL时相比细胞活力明显下降（P<0.01），故选择细胞活力未明显下降时芪蒡糖肾方的最高浓度2 mg/mL作为药物干预浓度，见图3。

2.5 HK2细胞葡萄糖造模条件的摸索

与NG组比较，用含30 mmol/L甘露醇的完基干预24 h的细胞Col3a1蛋白表达水平、用含30 mmol/L葡萄糖的完基干预24 h的细胞Col3a1蛋白表达水平及用含30 mmol/L甘露醇的完基干预48 h的细胞Col3a1蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；用含30 mmol/L葡萄糖的完基干预48 h的细胞Col3a1蛋白表达水平明显升高（P<0.01），故选择用含30 mmol/L葡萄糖的完基干预48 h作为造模条件，见图4。

2.6 芪蒡糖肾方对HK2细胞ROS的含量的影响

与NG组比较，HG组细胞内ROS的含量明显升高（P<0.01）；与HG组比较，QBTSF组和DAPA组细胞内ROS的水平明显下降（P<0.01），见图5。

2.7 芪蒡糖肾方对HK2细胞GSH、MDA及Fe²⁺含量的影响

与NG组比较，HG组细胞内MDA与Fe²⁺含量明显升高，GSH含量明显降低（P<0.01）；与HG组比较，QBTSF组与DAPA组细胞内MDA与Fe²⁺的水平明显降低，且GSH水平明显升高（P<0.01），见图6。

2.8 芪蒡糖肾方对HK2细胞Nrf2/Gpx4通路蛋白表达的影响

与NG组比较，HG组细胞内Nrf2、Slc7a11、Gpx4蛋白表达水平明显下降（P<0.01）；与HG组比较，QBTSF组与DAPA组细胞内Nrf2、Slc7a11、Gpx4蛋白表达水平明显上升（P<0.01），见表3、图7。

2.9 芪蒡糖肾方对HK2细胞的纤维化蛋白表达的影响

与NG组比较，HG组细胞内α‑SMA、Col3a1、Vimentin蛋白表达水平明显升高（P<0.01），E‑Cadherin蛋白表达水平明显降低（P<0.01）；与HG组比较，QBTSF组与DAPA组细胞内α‑SMA、Col3a1、Vimentin蛋白表达水平明显降低（P<0.01），E‑Cadherin蛋白表达水平明显升高（P<0.01），见表4、图8。

2.10 透射电子显微镜下各组HK2细胞超微结构的变化

NG组线粒体数量丰富，大多未见肿胀，基质大多均匀；与NG组相比，HG组线粒体体积明显缩小，外膜破裂，线粒体嵴模糊甚至消失，表现出铁死亡的典型特征，而经过芪蒡糖肾方与达格列净治疗后，以上损伤明显改善，见图9。

3 讨论

DKD，也被称为消渴病肾病，在中医理论中被归为“消渴”、“肾消”、“水肿”等疾病类别，其病机主要特点是本虚标实。本虚是指消渴日久，迁延不愈，伤阴耗气，阴损及阳，最终阴阳俱虚，标实是指内热、痰湿、气滞、血瘀相互搏结^［10］。因此陈以平教授研发了具有补脾益肾、行气活血功效的芪蒡糖肾方，方中黄芪、黄精、山茱萸、灵芝益气养阴，川芎、葛根、三七粉行气活血，牛蒡子、金蝉花、僵蚕通络护肾，诸药合用，共奏补脾益肾、行气活血之效。前期研究已经证实了芪蒡糖肾方在降低DKD患者蛋白尿水平和减缓肾功能衰退方面具有明显的治疗效果^［8，9］，此次研究通过体内实验与体外实验，证实了芪蒡糖肾方可有效改善DKD纤维化，这可能与Nrf2/Gpx4信号传导途径的激活有关联。

当肾小管上皮细胞长期暴露于高糖状态的刺激下会产生大量ROS，从而导致肾小管的损伤并促进一些促纤维化基因的转录，使得肾小管上皮细胞的E‑Cadherin表达有所下降，而α‑SMA、Vimentin及Col3a1等蛋白表达则有所增加。这一系列的变化标志着肾小管上皮细胞经历了上皮‑间充质转化的过程，这一转变最终可能导致肾小管间质发生纤维化^［11］。本研究结果显示，经芪蒡糖肾方治疗后，DKD小鼠与HK2细胞内α‑SMA与Col3a1的蛋白含量有所减少，这说明芪蒡糖肾方能缓解DKD肾纤维化。

铁死亡属于细胞程序性死亡的其中一种，主要包含3个特征：Fe²⁺的大量积累、脂质过氧化及抗氧化系统的崩溃^［12］。Fe²⁺的大量积累是指高糖状态下，铁转运蛋白受体蛋白‑1（transferrin receptor 1，TFR1）表达增多，Fe³⁺经其进入细胞内，随后与核受体辅激活蛋白4相互作用便生成了Fe²⁺，最终Fe²⁺通过芬顿反应为脂质过氧化提供大量自由基，导致铁死亡。这提示调控TFR1是治疗铁死亡的潜在靶点^［13］。脂质过氧化主要描述的是在多种酶的催化作用下，多数不饱和脂肪酸转化为大量如MDA的脂质过氧化生成物，最终推动铁死亡的进程^［14］。抗氧化系统的崩溃主要与谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的生成路径有关，而GPX4被看作是铁死亡过程中的核心调控元素^［15］。当细胞内Nrf2被激活后，它会刺激SLC7A11的生成，进而加速GSH的形成，并最终提高GPX4的活性。近期研究表明，当使用铁死亡抑制剂ferrostatin‑1后，DKD小鼠与HK2细胞内的α‑SMA及Vimentin等纤维化相关蛋白表达下降，这表明抑制铁死亡可以延缓延缓DKD肾纤维化进程^［16］。本研究发现，MOD组小鼠与HK2细胞内的Nrf2、GPX4与SLC7A11表达量有所减少，而Fe²⁺的含量有所增加，这提示铁死亡参与了DKD的进展。与MOD组相比，芪蒡糖肾方各组可以促进Nrf2/Gpx4信号通路的激活并改善肾纤维化，这表明芪蒡糖肾方可能通过调控Nrf2/Gpx4通路来抑制铁死亡进程，减轻氧化损伤，并最终有效缓解DKD肾纤维化。

综上所述，本研究证实了芪蒡糖肾方可以缓解DKD的肾纤维化水平，这可能与其促进Nrf2/Gpx4信号通路的活化，抑制铁死亡有关。此外，芪蒡糖肾方如何作用于Nrf2/Gpx4信号通路及其作用是否依赖其它通路的激活或抑制，未来还需要通过基因干扰等技术在体内、外进行进一步探索。

作者贡献度说明：

徐睿：设计实验方案，操作实验与分析数据，并撰写论文；雍军、郭小平、王琳：提供研究思路，指导论文撰写与修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

参考文献

[1] 杨敏， 李瑾. 中医药治疗糖尿病肾病研究进展［J］. 中国中医药现代远程教育， 2023， 21（23）： 86‑89.

[2] Yang M， Li J. Research progress of traditional Chinese medicine in the treatment of diabetic nephropathy［J］. Chin Med Modern Dist Edu Chin， 2023， 21（23）： 86‑89.

[3] Liu Z， Nan P， Gong Y， et al. Endoplasmic reticulum stress‑triggered ferroptosis via the XBP1‑Hrd1‑Nrf2 pathway induces EMT progression in diabetic nephropathy［J］. Biomed Pharmacother， 2023， 164： 114897.

[4] Sanz AB， Sanchez‑Niño MD， Ramos AM， et al. Regulated cell death pathways in kidney disease［J］. Nat Rev Nephrol， 2023， 19（5）： 281‑299.

[5] Wang H， Liu D， Zheng B， et al. Emerging role of ferroptosis in diabetic kidney disease： Molecular mechanisms and therapeutic opportunities［J］. Int J Biol Sci， 2023， 19（9）： 2678‑2694.

[6] Tang J， Liu F， Cooper ME， et al. Renal fibrosis as a hallmark of diabetic kidney disease： Potential role of targeting transforming growth factor‑beta （TGF‑β） and related molecules［J］. Expert Opin Ther Targets， 2022， 26（8）： 721‑738.

[7] Wu Y， Chen Y. Research progress on ferroptosis in diabetic kidney disease［J］. Front Endocrinol （Lausanne）， 2022， 13： 945976.

[8] 杨岚婷， 徐涛， 杨福情， 等. 转铁蛋白受体对铁过载所致大鼠心肌细胞铁死亡的作用及其机制［J］. 解放军医学杂志， 2022， 47（8）： 781‑788.

[9] Yang LT， Xu T， Yang FQ， et al. Effect and mechanism of TFRC on ferroptosis induced by iron overload in cardiac myocytes of rats［J］. Med J Chin People's Liber Army， 2022， 47（8）： 781‑788.

[10] 莫梓沂， 刘畅， 薛世圆， 等. 糖尿病肾病发病机制及治疗的研究进展［J］. 局解手术学杂志， 2021， 30（12）： 1093‑1098.

[11] Mo ZY， Liu C， Xue SY， et al. Research advances in the pathogenesis and treatment of diabetic nephropathy［J］. J Region Anat Operat Surg， 2021， 30（12）： 1093‑1098.

[12] 余江毅， 倪青， 刘苏， 等. 糖尿病肾病病证结合诊疗指南［J］.中医杂志， 2022， 63（2）： 190‑197.

[13] Yu JY， Ni Q， Liu S， et al. Guidelines for diagnosis and treatment of diabetic nephropathy with combinations of diseases and syndromes［J］. J Tradit Chin Med， 2022， 63（2）： 190‑197.

[14] Hung PH， Hsu YC， Chen TH， et al. Recent advances in diabetic kidney diseases： From kidney injury to kidney fibrosis［J］. Int J Mol Sci， 2021， 22（21）： 11857.

[15] Wang Y， Bi R， Quan F， et al. Ferroptosis involves in renal tubular cell death in diabetic nephropathy［J］. Eur J Pharmacol， 2020， 888： 173574.

[16] 杜晓妹， 王琳. 中医药治疗糖尿病肾病的研究进展［J］. 现代中西医结合杂志， 2020， 29（23）： 2615‑2619.

[17] Du XM， Wang L. Study progression in the treatment of diabetic nephropathy with traditional Chinese medicine［J］. Modern J Integr Tradit Chin West Med， 2020， 29（23）： 2615‑2619.

[18] Akhtar M， Taha NM， Nauman A， et al. Diabetic kidney disease： Past and present［J］. Adv Anat Pathol， 2020， 27（2）： 87‑97.

[19] 张先闻， 陈以平， 盛凌黎， 等. “真实世界”陈氏糖肾方治疗Ⅳ~Ⅴ期糖尿病肾脏疾病的疗效评价［J］. 中国中医药科技， 2017， 24（1）： 1‑3， 15.

[20] Zhang XW， Chen YP， Sheng LL， et al. Real‑world analysis of curative effect of Chen's Tangshen Fang in stage Ⅳ~Ⅴ diabetic kidney disease［J］. Chin J Tradit Med Sci Technol， 2017， 24（1）：1‑3， 15.

[21] Shimizu M， Furuichi K， Toyama T， et al. Long‑term outcomes of Japanese type 2 diabetic patients with biopsy‑proven diabetic nephropathy［J］. Diabetes care， 2013， 36（11）： 3655‑3662.

[22] 连松铭， 王琳， 张先闻， 等. 陈氏糖肾方结合西医常规疗法治疗Ⅳ期糖尿病肾病临床研究［J］. 上海中医药杂志， 2010， 44（5）： 9‑11.

[23] Lan SM， Wang L， Zhang XW， et al. A prospective cohort study on "Chen's Tangshen Decoction" in the treatment of stage‑Ⅳ diabetic nephropathy［J］. Shanghai J Tradit Chin Med， 2010， 44（5）： 9‑11.