人参⁃丹参⁃黄芪防治阿霉素所致心脏毒性的作用机制研究

Mechanistic study on renshen⁃danshen⁃huangqi combination in preventing doxorubicin⁃induced cardiotoxicity

摘要

目的 基于网络药理学、体外细胞实验与体内动物实验探讨人参⁃丹参⁃黄芪（Renshen⁃Danshen⁃Huangqi，RDH）对阿霉素（doxorubicin，DOX）诱导心脏毒性的保护作用及分子机制。 方法 通过TCMSP和Uniport数据库得到RDH的活性成分及靶标蛋白，运用GeneCards与OMIM数据库获得与阿霉素心脏毒性的相关靶点。运用Venny在线平台获取共同作用靶点，通过String平台构建PPI网络图，导入Cytoscape软件筛选出核心靶点，并借助Metascape在线平台对共同作用靶点进行GO及KEGG通路富集分析。通过DOX处理H9c2心肌细胞24 h构建DOX诱发心肌损伤的细胞模型，MTT法确定RDH的最佳配比及在该配比下对细胞存活率的影响；使用流式细胞仪测定细胞凋亡率。DOX腹腔注射建立SD大鼠心脏毒性模型，利用超声心动图检测大鼠LVDD、LVDS、EF和FS变化；H&E与Masson染色评估心肌组织学病理变化；试剂盒检测Tn⁃I、CK⁃MB、MDA和GSH水平及SOD、GSH⁃PX活性；Western blot法检测BCL2、BAX和Cleaved⁃Caspase3的表达。 结果 网络药理学筛选出BCL2、CASP3等在内的154个RDH治疗DOX所致心脏毒性的作用靶点，涉及包括凋亡信号通路在内的20条关键通路。体外细胞实验证实，人参：丹参：黄芪=1∶2∶1配比时，对DOX造成的心肌细胞损伤恢复效果最佳，且在该配比下可有效缓解DOX引起的心肌细胞凋亡（P<0.05）；体内动物实验结果表明，RDH给药明显缓解了DOX造成的大鼠心功能受损和氧化应激，并有效改善心脏组织的病理损伤（P<0.05）；RDH明显提高心肌组织BCL2蛋白并降低BAX及凋亡蛋白Cleaved⁃Caspase3的表达（P<0.05）。 结论 RDH可明显减轻DOX诱导的心脏毒性，其机制可能与抗凋亡与氧化应激、BCL2和CASP3等基因的调控有关。

Abstract

Objective To investigate the cardioprotective effects and molecular mechanisms of Renshen⁃Danshen⁃Huangqi （RDH） combination against doxorubicin （DOX）⁃induced cardiotoxicity using network pharmacology， in vitro cell experiments， and in vivo animal studies. Methods Active components and target proteins of RDH were retrieved from the TCMSP and Uniport databases， while DOX⁃related cardiotoxicity targets were obtained from GeneCards and OMIM. Common targets were identified using the Venny online platform， and a protein⁃protein interaction （PPI） network was constructed via the STRING database and visualized using Cytoscape to identify core targets. GO and KEGG pathway enrichment analyses were performed using Metascape. For in vitro experiments， H9c2 cardiomyocytes were treated with DOX for 24 h to establish a myocardial injury model. The optimal RDH ratio was determined via MTT assay， and its effect on cell viability and apoptosis （flow cytometry） was evaluated. For in vivo studies， a DOX⁃induced cardiotoxicity model was established in SD rats via intraperitoneal injection. Cardiac function （echocardiography： LVDD， LVDS， LVEF， LVFS）， histopathology （H&E and Masson staining）， serum biomarkers （Tn⁃I， CK⁃MB， MDA， GSH， SOD， GSH⁃PX）， and apoptosis⁃related proteins （BCL2， BAX， Cleaved⁃caspase3； Western blot） were analyzed. Results Network pharmacology analysis identified 154 potential therapeutic targets of RDH （including BCL2 and Caspase3） for DOX⁃induced cardiotoxicity， involving 20 key pathways such as the apoptosis signaling pathway. In vitro experiments demonstrated that the RDH combination at a ratio of 1∶2∶1 （Renshen∶Danshen∶Huangqi） most effectively restored DOX⁃induced cardiomyocyte damage and significantly attenuated DOX⁃triggered apoptosis （P<0.05）. In vivo studies revealed that RDH administration significantly alleviated DOX⁃induced cardiac dysfunction and oxidative stress in rats， while effectively improving pathological damage in heart tissue （P<0.05）. Notably， RDH significantly upregulated myocardial BCL2 protein expression while downregulating pro⁃apoptotic proteins BAX and Cleaved⁃Caspase3 （P<0.05）. Conclusion RDH significantly attenuates DOX⁃induced cardiotoxicity， potentially via anti⁃apoptotic， antioxidant， and modulation of Caspase3/BCL2.

Graphical abstract

关键词

阿霉素 / 心脏毒性 / 人参⁃丹参⁃黄芪（RDH） / 细胞凋亡 / 网络药理学

Key words

Doxorubicin / Cardiotoxicity / Renshen⁃Danshen⁃Huangqi （RDH） / Apoptosis / Network pharmacology

蒽环类药物是一类广泛应用于癌症化疗的药物，阿霉素（doxorubicin，DOX）作为最具代表性的药物之一，已被广泛用于治疗造血系统肿瘤和实体肿瘤，从而提高癌症患者的治愈率和生活质量^［1］。DOX通过靶向癌细胞中高度表达的拓扑异构酶Ⅱα（TopⅡα），阻断细胞分裂和DNA复制，从而抑制肿瘤细胞增殖^［2］。然而，DOX的临床应用受到剂量依赖性心脏毒性的严重制约，其特征性表现为治疗后一年内出现的左心室射血分数降低^［3］。当DOX的累积剂量达到550 mg/m²，约26 %的患者会出现慢性心脏毒性，导致左心室功能障碍和充血性心力衰竭^［4］。目前，右雷佐生（dexrazoxane，DZR）是美国食品药品监督管理局批准的唯一可用于DOX诱导的心肌病的保护剂，但由于DZR会增加乳腺癌患者的骨髓抑制率，并伴有发热性中性粒细胞减少，故在临床治疗上仍存在局限性^［5，6］。因此，探索能够有效降低DOX所致心脏毒性的药物和治疗方法具有重要的价值与意义。

中医药在防治DOX心脏毒性方面展现出独特优势，既能有效保护心脏功能，又能与化疗药物产生协同抗肿瘤效应^［7⁃10］。其中，人参、丹参和黄芪作为益气活血的代表性药物，其单用及配伍（如人参⁃丹参药对）已证实可通过多种途径来减轻DOX所致的心脏毒性^{［11⁃15］}。现代药理学研究进一步揭示，这些药物具有抗心肌缺血、促进血管新生及减少心肌梗死面积等心肌保护作用^{［16⁃18］}。本研究采用网络药理学预测人参⁃丹参⁃黄芪（Renshen⁃Danshen⁃Huangqi，RDH）3药配伍下抗DOX所致心脏毒性的靶点和通路；随后通过DOX诱导的H9c2心肌细胞损伤模型和SD大鼠心脏毒性模型，系统验证RDH对DOX所致心脏毒性的保护作用及分子机制，为临床防治DOX心脏毒性提供新的治疗策略和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物

阿霉素（北京Solarbio公司，批号：1015P023）、右雷佐生（江苏奥赛康药业有限公司，批号：E2206012）、人参（批号：3010220311）、丹参（批号：2012501001）、黄芪（批号：23060501）购自惠仁堂药业兰新店。

1.2 实验动物、细胞

SPF级别雄性SD大鼠（体质量200±20 g），购自北京斯贝福生物有限公司［SCXK（京）2019⁃0010］，大鼠饲养于甘肃中医药大学SPF级动物实验室，饲喂温度设置为（22±2） ℃，湿度40%~60%，光/暗循环时间为12 h。自由摄取食物、饮水。所有实验符合动物伦理规定要求，并且经过甘肃中医药大学实验动物伦理委员会批准（方案编号：2023⁃583）。H9c2大鼠心肌细胞于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库购买所得。

1.3 实验试剂

DMEM（沃卡威生物技术有限公司）；0.25%胰蛋白酶消化液（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：GA2304018）；胎牛血清（四季青，批号：11011⁃8611）；二甲基亚砜（北京Solarbio公司，批号：1121E0331）；Bcl⁃2（Absin，批号abs131707）；BAX（abcam，批号：ab32503）；Cleaved Caspase⁃3（abmart，批号：T40044）；GAPDH（Absin，批号：abs830030ss）；蛋白Marker（美国Genstar公司，批号：5AH02）；蛋白裂解液（武汉赛维尔生物公司，批号：G2002）；0.22 μm PVDF膜（碧云天生物技术研究所，批号：FFP28）；脱脂奶粉（北京Solarbio公司，批号：322R0501）；5×蛋白上样缓冲液（北京Solarbio公司，批号：P1016）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京Solarbio公司，批号：20211207）；30%丙烯酰胺（29∶1）（北京Solarbio公司，批号：2312022）；TRIS（北京Solarbio公司，批号：304A075）；PMSF（北京Solarbio公司，批号：20230707）；磷酸酶抑制剂2（艾普拜生物科技，批号：K1015⁃B）；磷酸酶抑制剂1（艾普拜生物科技，批号：K1015⁃A）；MDA、GSH、SOD、GSH⁃PX试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20230801、20230807、20230805、20230807）；CK⁃MB、Tn⁃I科研试剂盒（江苏酶免实业有限公司，批号：2307R60、2307R48）

1.4 实验仪器

CO₂细胞培养箱（太仓艺斯高医疗器械科技有限公司，型号：CLM⁃170B⁃8⁃CN）；生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司，型号：BSC⁃1304IIA2）；高速离心机（Cence湘仪，型号：H1650R）；恒温水浴锅（天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司，型号：SY⁃20）；高压灭菌锅（致微（厦门）仪器有限公司，型号：GR60DR）；倒置显微镜（Olympμs公司，型号：IX81）；酶标仪（BioTek，型号：Epoch）；流式细胞仪（BD，型号：FACS Celesta TM）；化学发光成像系统（AzureBiosystems，型号：C300）；包埋机（浙江省金华市科迪仪器，型号：KD⁃BM）；超高分辨率小动物超声成像系统（上海富士胶片贸易有限公司，型号：Vevo^® 3100LT）；恒温培养箱（上海精宏设备公司，型号：DNP⁃9022）；恒温振荡器（上海一恒科学仪器有限公司，型号：HZQ⁃F160A）；显微镜（宁波舜宇仪器有限公司，型号：RX50）等。

1.5 实验方法

1.5.1　RDH防治阿霉素心脏毒性靶点的筛选通过中药系统药理分析平台TCMSP（https：//tcmspw.com/），分别以“人参”“丹参”“黄芪”为关键词搜索全部化学成分。根据药动学（ADME）：口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18进行筛选，得到活性化合物及其对应的作用靶点。通过Uniport数据库（https：//www.uniprot.org/）查询靶标蛋白对应的基因名，构建活性化合物所对应的靶点库。通过GeneCards与OMIM数据库，以Doxorubicin⁃induced cardiotoxicity为关键词，检索相关疾病靶点并汇总。将人参、丹参与黄芪的活性化合物所对应的作用靶点与阿霉素所对应的疾病靶点通过在线软件Venny平台取交集，即可得到RDH防治阿霉素心脏毒性靶点的预测交集数据库，共154个预测靶点。

将交集靶点导入String（https：//cn.string-db.org）平台建立PPI网络，物种设置为“homo sapiens”以获取相互作用关系信息表，同时下载此相互作用网络的TSV格式文件，导入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化分析。

1.5.2 交集靶点的GO功能分析与KEGG通路分析

将RDH治疗DOX诱导心肌损伤的潜在靶点导入Metascape在线平台中进行富集分析，得到GO生物学过程和KEGG信号通路富集分析。以P值作为筛选条件，并依据富集通路涉及基因数的数量，从大到小进行排名，筛选出GO富集分析中排名前面的通路以及KEGG富集分析中排名前10的通路。并将分析结果中的前20条结果进行可视化。

1.5.3 RDH药液的配置

人参、丹参和黄芪药材分别加入12倍蒸馏水并浸泡60 min，随后将药材和水倒入煎药锅中武火加热至沸腾，微沸后文火继续煎煮60 min后过滤煎液，再加入6倍蒸馏水。同前操作，滤出煎液后合并2次滤液，每味药分别浓缩至生药量为1 g/mL，将3种药液根据具体所设比例进行混合，置于-20 ℃保存。

1.5.4 心肌细胞DOX损伤模型的建立与RDH给药分组

在DMEM培养基（含体积分数10 %的胎牛血清及体积分数1 %青链霉素溶液）中培养H9c2大鼠心肌细胞，使用2 μmol/L DOX作用于H9c2心肌细胞24 h以建立心肌细胞损伤模型。实验共分为5组：空白对照组（正常培养24 h）、DOX模型组（DOX 2 μmol/L）、RDH治疗组（DOX 2 μmol/L + RDH 0.5 mg/mL、DOX 2 μmol/L+RDH 1 mg/mL、DOX 2 μmol/L+RDH 2 mg/mL）

1.5.5 MTT法检测RDH对DOX诱导H9c2心肌细胞的活力影响

H9c2细胞均匀接种于96孔板，培养12 h至细胞贴壁后，按照1.5.4节进行分组给药干预。分组给药24 h后，每孔加入100 µL的MTT溶液，置于培养箱中孵育4 h。小心吸出含有MTT的培养液后（注意枪头不要碰到孔板底），每孔中加入150 µL DMSO，放置于摇床15 min，使用酶标仪在570 nm波长下测定各组的吸光值，计算细胞存活率。

1.5.6 AV⁃FITC/PI双染法检测RDH对DOX诱导H9c2心肌细胞凋亡的影响

H9c2细胞均匀接种于6孔板，培养12 h至细胞贴壁后，按照1.5.4所述进行分组给药干预。给药24 h后，去除原培养液并用PBS洗涤细胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化液离心收集细胞，加入AV⁃FITC和PI，避光条件下孵育20 min，吸出染色液并用无血清的培养基洗涤重悬细胞3次，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5.7 动物分组与模型制备

SD大鼠随机分为5组（n=9）：空白对照组（Control组）、模型组（DOX组）、右丙亚胺组（DZR组）、RDH低剂量组（Low RDH组）、RDH高剂量组（High RDH组）。计算RDH生药量，根据临床用药量的2倍、4倍设置RDH低剂量与高剂量。在DOX给药前1周和给药后2周进行RDH灌胃，RDH低剂量组每天给予3.6 g/kg RDH药液，RDH高剂量组每天给予7.2 g/kg RDH药液，连续灌胃21 d（3周）。模型及各模型给药组在后2周内分3次（第8、第13、第18天）进行腹腔注射DOX，每次5 mg/kg，共计15 mg/kg。右丙亚胺组在腹腔注射DOX前30 min注射DZR（150 mg/kg，根据说明书与DOX的剂量比例为10∶1^［19］），空白对照组腹腔注射等体积生理盐水。

1.5.8 心脏超声检测

大鼠给药与造模结束后，采用吸入异氟醚对大鼠进行麻醉处理。具体方法为：使用1 %氧气加5 %异氟烷进行诱导麻醉，随后以1 %氧气加2 %异氟烷维持麻醉状态。待大鼠进入深度麻醉后，使用Vevo^® 3100LT超高分辨率小动物超声成像系统进行心电图检测。待心电图信号稳定后，测量以下心功能参数：左心室收缩末期内径（LVDS）、左心室舒张末期内径（LVDD）、左心室射血分数（EF）以及左心室短轴缩短率（FS）。

1.5.9 大鼠脏器与血清采集

实验结束时，采用戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉。在无菌条件下，使用真空采血管通过腹主动脉采集血液样本。将采集的血液使用4 ℃离心机以3 500 r/min离心15 min吸取上清获得血清。将血清分装后置于-80 ℃冰箱中保存。采血完成后，迅速解剖心脏，将心脏组织分别保存于-80 ℃冰箱（用于相关生化指标检测）和4 %多聚甲醛溶液（用于组织形态学分析）中。

1.5.10 心脏组织病理学检测

大鼠心脏组织置于4 %多聚甲醛中固定24 h以上。固定完成后对心脏组织进行修整，依次进行脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋处理。将制备好的石蜡块切片置于常温下保存备用。分别进行苏木精⁃伊红（H&E）染色和马松（Masson）染色，使用ImageJ软件对染色切片进行分析，定量评估心肌组织形态学变化和纤维化程度。

1.5.11 大鼠心脏中CK⁃MB、Tn⁃I、SOD、MDA、GSH、GSH⁃PX水平测定

称取心脏组织0.1 g，加入生理盐水（9∶1）使用组织研磨仪制成心脏匀浆，与大鼠血清共为待测样品。根据相应试剂盒说明书依次检测SOD、MDA、GSH、GSH⁃PX、CK⁃MB、Tn⁃I的表达水平。

1.5.12 Western blot法检测心脏组织中相关蛋白表达

将心脏组织在低温条件下充分研磨，加入RIPA裂解液提取心肌组织蛋白，使用蛋白质定量试剂盒（bicinchoninic acid assay，BCA）测定蛋白质浓度。用十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶（SDS⁃PAGE）对目标蛋白进行电泳，恒流将蛋白样品转至PVDF膜，10 %脱脂奶粉封闭2 h并用TBST洗膜3次后，用稀释的一抗Casepase⁃3（1∶1 000）、Cleaved⁃Caspase3（1∶1 000）、BCL2（1∶1 000）、BAX（1∶1 000）与GAPDH（1∶10 000）于4 ℃摇床孵育过夜。洗膜10 min×3次，二抗（1∶10 000）室温下孵育60 min；滴加化学发光液并使用凝胶成像仪曝光成像，使用ImageJ软件对条带的灰度值进行分析。

1.6 统计学处理

使用Prism软件对本研究中的实验数据进行分析，计量资料均以\overline{x}\pm s表示。组间比较采用单因素方差分析，评估数据间的显著性差异，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RDH治疗DOX所致心脏毒性的网络药理学分析

2.1.1 RDH治疗DOX诱导心肌损伤核心靶点的筛选

RDH共筛选出174种化学成分，261个基因靶点；与疾病基因合并去重后获得2 745个基因，二者交集靶点为154个。将交集靶点导入String数据库中建立PPI网络，将其导入Cytoscape软件获得一个包含154个节点的PPI网络图。经MCC插件计算，筛选出网络排名前10的Hub基因：B细胞淋巴瘤2（BCL2）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、白细胞介素6（IL⁃6）、缺氧诱导因子⁃1的α亚单位（HIF1A）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、信号转导及转录激活因子3（STAT3）、p53肿瘤蛋白（TP53）、肿瘤坏死因子（TNF）、蛋白激酶B1（AKT1）、上皮生长因子受体（EGFR），结果见图1A、B。

2.1.2 潜在靶点的KEGG和GO富集分析

运用Metascape在线平台对RDH治疗DOX诱导心肌损伤的154个潜在治疗靶点进行KEGG富集，结果显示共富集得到163条通路，主要包括凋亡信号通路、AGE⁃RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、TNF信号通路等，根据P值大小选取前20进行可视化处理（图1C）。

GO富集结果显示涉及了1 860个生物过程（biological Process，BP），包括对激素的反应、细胞对脂质的反应、凋亡信号通路、细胞迁移的正调控等；83个细胞组分（celular component，CC），包括膜筏、膜微区、转录调节复合体、受体复合体等；167个分子功能（molecular function，MF），包括转录因子结合、蛋白激酶结合、核受体活性、细胞因子受体结合等（图1D）。

2.2 RDH的最佳配比筛选

2.2.1 不同配比RDH对H9c2存活率的影响

基于前期研究，发现人参⁃丹参（RD）药对1∶2配比（半数有效浓度（EC50）最低，细胞活力最佳）对DOX所致的心脏毒性具有明显保护作用，本研究进一步引入黄芪进行配伍优化。分别设置1∶2∶1、1∶2∶2、1∶2∶3 3种RDH配比，结果显示药液浓度处于0.5~4 mg/mL时，与空白组相比，大鼠心肌细胞存活率未受到抑制。直至药液浓度达到8 mg/mL细胞活力明显下降（P<0.05）（图2）。因此，后续研究采用最高浓度不超过4 mg/mL的RDH不同配比进行干预研究。

2.2.2 不同配比和剂量RDH对DOX诱导H9c2细胞存活率的影响

为评估RDH对DOX诱导心肌损伤的保护作用，本研究使用H9c2心肌细胞构建DOX心肌损伤模型，并采用不同配比和剂量的RDH进行体外干预，实验结果见图3。MTT结果分析显示：与空白对照组相比，DOX组细胞存活率明显降低（P<0.01）；而各配比RDH干预组能明显改善DOX所致细胞损伤（P<0.05）。通过计算EC50发现1∶2∶1配比组EC50值为1.07，明显优于1∶2∶2（EC50∶1.24）和1∶2∶3（EC50∶6.24）配比组。基于上述结果，确定1∶2∶1为RDH最佳配伍比例，并用于后续实验研究。

2.2.3 RDH给药可有效缓解DOX诱导的心肌细胞凋亡

Q1⁃LL象限的细胞为正常细胞，它们未显示出PI的阳性信号，表明细胞膜完整且细胞核也未受损。Q1⁃LR象限的细胞是凋亡早期细胞。Q1⁃UR象限的细胞为凋亡晚期及坏死细胞。与Control组相比，DOX模型组细胞凋亡率（Q1⁃LR+Q1⁃UR）明显升高（P<0.01）；与DOX组相比，3种剂量的RDH可明显减少H9c2细胞凋亡（P<0.01），见图4。表明DOX促使心肌细胞的凋亡增加，RDH治疗后能明显改善心肌细胞凋亡。

2.3 RDH明显改善DOX诱导的大鼠心脏功能障碍

DOX组大鼠表现出明显的体重下降，同时心脏重量减少（P<0.01），各给药组使大鼠体重与心脏重量减少得到一定程度恢复（P<0.01）。心脏超声检测显示：与Control组相比，DOX组大鼠的EF、FS明显降低（P<0.01），LVDD与LVDS明显升高（P<0.05），表明DOX诱导了大鼠心脏功能障碍，见图5。经RDH和DZR阳性药干预后，上述心功能参数得到明显改善（P<0.05），表明RDH通过增强心肌收缩力，有效改善了DOX诱导的大鼠心脏功能障碍，展现出明显的心脏保护作用。

2.4 RDH对大鼠心肌组织病理损伤的影响

H&E染色结果显示，Control组大鼠心肌纤维排列整齐，横纹结构清晰，染色均匀。而DOX组心肌纤维排列紊乱，出现大量溶解性损伤，表明心肌组织受到严重破坏。DZR组和各剂量RDH治疗组改善了DOX诱导的心肌纤维化损伤，表现为心肌纤维排列趋于整齐，染色均匀性提高，见图6A。在Masson染色中，胶原纤维通常呈现蓝色，可用于评估组织中的胶原纤维含量和分布状态。Control组大鼠心肌纤维排列整齐紧密，且几乎未见蓝色胶原纤维沉积，见图6B。而DOX组大鼠心肌细胞排列紊乱，细胞间存在大量空隙，并可见明显的蓝色胶原沉积，表明心肌纤维化程度明显增加（P<0.05）。相比之下，DZR和各剂量RDH治疗有效恢复了心肌细胞的整齐排列，同时明显减少心脏胶原纤维沉积（P<0.05）。

2.5 RDH对大鼠心脏损伤标志物与氧化应激水平的影响

心肌损伤标志物检测结果表明，DOX组大鼠血清中的CK⁃MB和TN⁃I水平较正常组明显升高，同时伴有MDA含量明显增加（P<0.05）。而SOD、GSH及GSH⁃PX水平明显降低（P<0.01），这些变化证实DOX可导致严重的心肌氧化应激损伤，见图7。经不同剂量RDH治疗后，血清中CK⁃MB、TN⁃I与MDA水平降低（P<0.01），SOD、GSH⁃PX酶活性与GSH水平增加（P<0.05）。表明RDH治疗能够有效抑制氧化应激反应，对DOX诱导的心脏损伤具有明显的保护作用。

2.6 RDH对大鼠心脏组织中凋亡相关蛋白表达水平的影响

实验结果显示，与Control组相比，DOX组心肌细胞呈现明显的凋亡特征：Cleaved⁃Caspase3和BAX等促凋亡蛋白表达上调（P<0.05），而抗凋亡蛋白BCL2表达下调（P<0.05）。经各剂量RDH及阳性药DZR干预后，上述凋亡相关蛋白表达得到明显改善（P<0.05），见图8。这些发现与网络药理学预测的核心靶点（CASP3、BCL2）及凋亡信号通路相一致，提示RDH可能通过调控BCL2/CASP3途径来减轻DOX诱导的心肌损伤。

3 讨论

目前，DOX所致心脏毒性的防治已成为临床关注的重点，DOX心脏毒性患者临床表现多为心痛、乏力、胸闷等症状，中医将其归属于“心悸”“胸痹”病的范畴^［18］。中医理论认为，其核心病机在于“气虚血瘀”：气能行血摄血，气虚则无力行血，最终导致血脉不畅，气虚血瘀^［11］。故“益气活血法”被认为是气虚血瘀的基本治则^［20］。通过补气药与活血药的协同作用，既可补益心气治本，又能活血化瘀治标，为防治DOX心脏毒性提供了新的中医药治疗思路。

人参与黄芪作为经典补气药对，配伍应用历史悠久。其1∶1配比最早可追溯至东汉时期张仲景《桂林古本伤寒杂病论》（卷十）：“人参三两、白术三两、干姜三两、甘草三两（炙）、黄芪三两。右五味，以水八升，煮取三升，去滓，温服一升，日三副”^［21］，临床广泛用于补气益元，如调元散治疗小儿元气不足^［22］。吴昱杰等^［23］发现二者配伍可有效改善心衰大鼠心功能和心室结构变化，机制涉及调节心肌能量代谢、抑制细胞凋亡等。其中，人参皂苷Rg1通过激活Akt/Erk通路、增加BCL2/BAX水平来减少心肌细胞凋亡^［24］，而黄芪可调节神经内分泌激素（如CGRP、ANP）并维持脂肪酸代谢稳态，从而改善心功能^{［25，26］}。

丹参作为活血药物，其活性成分丹参酮Ⅰ能减轻DOX诱导的急性心脏毒性，其机制包括通过上调Akt⁃Nrf2通路，抑制氧化应激等^［27］。目前，已有多项研究表明丹参与补气药物人参、黄芪互为配伍，以“益气活血法”治疗气虚血瘀之心肌病。高荣等^［28］证实人参总皂苷和丹参总酚酸合用对大鼠心肌梗死有明显治疗作用；黄芪⁃丹参配伍在临床中也显示出对心绞痛、慢性心力衰竭等心血管疾病的明显疗效^{［29，30］}。因此，人参⁃丹参⁃黄芪三药联用的协同作用机制研究，不仅为“益气活血法”这一治则提供了现代药理学依据，同时也为开发基于该配伍方案的心脏保护策略奠定了理论基础。

细胞凋亡是一种高度调控的程序性细胞死亡过程，在维持组织稳态中发挥关键作用。这一过程主要受BCL2蛋白家族调控，其中促凋亡蛋白BAX和抗凋亡蛋白BCL2是调节线粒体外膜透化导致细胞色素C释放的关键^［31］。当凋亡发生时，BAX被激活并从细胞质中释放，与线粒体外膜结合并改变其通透性，使得细胞色素C释放从而触发下游Caspase凋亡级联^［32］。与此相对，BCL2可通过与BAX形成二聚体，通过抑制Caspase3来对抗其诱导凋亡的作用^［33］。网络药理学分析显示，RDH的活性成分明显富集于凋亡相关通路，核心靶点包括BCL2和CASP3等关键调控因子。动物实验证实，RDH干预不仅能明显改善DOX导致的心功能损伤（包括射血功能下降和心肌纤维化），还可通过下调促凋亡蛋白Cleaved⁃Caspase3和BAX的表达，同时上调抗凋亡蛋白BCL2的表达，有效抑制心肌细胞凋亡。这些发现与网络药理学分析结果高度一致，表明RDH通过抗凋亡途径发挥对阿霉素诱导心脏毒性的保护作用，其机制可能与调控凋亡核心基因BCL2、CASP3的表达有关。

在DOX诱导的心脏毒性中，氧化应激同细胞凋亡一样起着关键作用^［34］。DOX通过靶向心肌细胞线粒体，诱导线粒体功能障碍并导致活性氧过量产生，继而引发氧化应激级联反应，最终促进心肌细胞凋亡^［35］。实验结果显示，RDH能明显提升DOX处理大鼠心肌组织中抗氧化系统GSH、GSH⁃PX和SOD水平，同时降低脂质过氧化产物MDA的含量。这些发现表明RDH不仅能够直接缓解氧化应激损伤，还可通过抵抗氧化应激造成的细胞凋亡来发挥对心脏的保护作用。

综上所述，本研究遵循“益气活血法”治则，采用人参⁃丹参⁃黄芪三药配伍组成新药对。首先通过网络药理学方法预测和筛选了RDH治疗DOX所致心脏毒性的潜在作用机制与关键靶点，随后通过体内外实验共同证实了RDH对DOX诱导心脏毒性的保护作用，其作用机制涉及抑制细胞凋亡与抵抗氧化应激损伤，为临床防治DOX所致心脏毒性提供了新的治疗策略和理论依据。

作者贡献度说明：

刘东玲：负责研究选题、论文修改和定稿；李梓慕：负责实验操作及撰写文章；王斯琦：负责数据统计分析与校稿；杨丽丽、王娟：负责实验操作；张琳、杨文：负责中药提取物制备。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

参考文献

[1] Zhang Z， Yu X， Wang Z， et al. Anthracyclines potentiate anti⁃tumor immunity： A new opportunity for chemoimmunotherapy［J］. Cancer Lett， 2015， 369（2）： 331⁃335.

[2] Minotti G， Menna P， Salvatorelli E， et al. Anthracyclines： Molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity［J］. Pharmacological Rev， 2004， 56（2）： 185⁃229.

[3] Mordente A， Meucci E， Silvestrini A， et al. Anthracyclines and mitochondria［J］. Adv Exp Med Biol， 2012， 942： 385⁃419.

[4] Senkus E， Jassem J. Cardiovascular effects of systemic cancer treatment［J］. Cancer Treatment Rev， 2011， 37（4）： 300⁃311.

[5] Marty M， Espié M， Llombart A， et al. Multicenter randomized phase Ⅲ study of the cardioprotective effect of dexrazoxane （cardioxane） in advanced/metastatic breast cancer patients treated with anthracycline⁃based chemotherapy［J］. Annal Oncol， 2006， 17（4）： 614⁃622.

[6] Tahover E， Segal A， Isacson R， et al. Dexrazoxane added to doxorubicin⁃based adjuvant chemotherapy of breast cancer： A retrospective cohort study with a comparative analysis of toxicity and survival［J］. Anti⁃Cancer Drugs， 2017， 28（7）： 787⁃794.

[7] Chen Y， Xu M， Liu XM， et al. Mechanistic study of Huangqi Guizhi Wuwu decoction amelioration of doxorubicin⁃induced cardiotoxicity by reducing oxidative stress and inhibiting cellular pyroptosis［J］. Biomed Pharmacother Biomed Pharmacother， 2024， 175： 116653.

[8] Liu C， Ma X， Zhuang J， et al. Cardiotoxicity of doxorubicin⁃based cancer treatment： What is the protective cognition that phytochemicals provide us［J］. Pharmacol Res， 2020， 160： 105062.

[9] Wu R， Yao PA， Wang HL， et al. Effect of fermented cordyceps sinensis on doxorubicin⁃induced cardiotoxicity in rats［J］. Mol Med Rep， 2018， 18（3）： 3229⁃3241.

[10] Hao W， Shi YY， Qin YN， et al. Cardioprotective effect of Chinese herbal medicine for anthracycline⁃induced cardiotoxicity in cancer patients： A meta⁃analysis of prospective studies［J］. Medicine， 2022， 101（30）： e29691.

[11] 曹午阳， 李君， 叶孟婷， 等. 基于《内经》血瘀理论探讨益气活血法治疗阿霉素心肌损害［J］. 云南中医中药杂志， 2021， 42（8）： 16⁃18.

[12] Cao WY， Li J， Ye MT， et al. Qi⁃invigorating and blood⁃activating therapy for doxorubicin⁃induced myocardial injury： A perspective from inner Canon's blood stasis theory［J］. Yunnan J Tradit Chin Med Materia Med， 2021， 42（8）： 16⁃18.

[13] 张杰， 赖润民， 鞠建庆， 等. 芪参益气滴丸治疗射血分数保留心力衰竭的网络药理学研究［J］. 中国医药导报， 2020， 17（1）： 21⁃24，198.

[14] Zhang J， Lai RM， Ju JQ， et al. Network pharmacological research of Qishen Yiqi dropping pills in the treatment of heart failure with preserved ejection fraction［J］. Chin Med Herald， 2020， 17（1）： 21⁃24，198.

[15] 范颖， 于彩娜， 徐丹， 等. 人参、黄芪、附子、干姜对阿霉素心脏毒性损伤大鼠线粒体途径细胞凋亡的影响［J］. 辽宁中医杂志， 2011， 38（6）： 1030⁃1032.

[16] Fan Y， Yu CN， Xu D， et al. Effects of Ginseng， astragalus， aconite， and dried ginger on mitochondrial pathway apoptosis in rats with doxorubicin⁃induced cardiotoxicity［J］. Liaoning J Tradit Chin Med， 2011， 38（6）： 1030⁃1032.

[17] 郭金栋， 姜毅， 刘颖， 等. 益气活血方抗阿霉素心肌毒性的实验研究［J］. 中华中医药学刊， 2016， 34（3）： 705⁃707.

[18] Guo JD， Jiang Y， Liu Y， et al. Experimental study on Yiqi Huoxue prescription anti⁃myocardial toxicity due to adriamycin［J］. Chin Arch Tradit Chin Med， 2016， 34（3）： 705⁃707.

[19] Hou J， Yun Y， Cui C， et al. Ginsenoside Rh2 mitigates doxorubicin⁃induced cardiotoxicity by inhibiting apoptotic and inflammatory damage and weakening pathological remodelling in breast cancer⁃bearing mice［J］. Cell Proliferation， 2022， 55（6）： e13246.

[20] 吕琴， 赵文晓， 王世军， 等. 黄芪活血功效及现代药理学研究进展［J］. 中国实验方剂学杂志， 2020， 26（9）： 215⁃224.

[21] Lv Q， Zhao WX， Wang SJ， et al. Effect of astragali radix membranaceus in promoting blood circulation and its modern pharmacology research［J］. Chin J Exp Tradit Med Formul， 2020， 26（9）： 215⁃224.

[22] 石思， 汪倩， 杨梅， 等. 重构本草丹参的临床应用与现代药理学研究［J］. 贵州医药， 2024， 48（2）： 198⁃200.

[23] Shi S， Wang Q， Yang M， et al. Reconstructing the clinical applications and modern pharmacological research of salvia miltiorrhiza［J］. Guizhou Med J， 2024， 48（2）： 198⁃200.

[24] 朱俊峰， 伊晓娇， 钟里科， 等. 中药抗阿霉素心脏毒性的中医理论及其药理作用研究进展［J］. 中华中医药杂志， 2022， 37（8）： 4592⁃4598.

[25] Zhu JF， Yi XJ， Zhong LK， et al. TCM theory and research progress on pharmacological effects of traditional Chinese medicine against doxorubicin⁃induced cardiotoxicity［J］. Chin J Tradit Chin Med Pharm， 2022， 37（8）： 4592⁃4598.

[26] Zhou Q， Meng P， Zhang Y， et al. The compatibility effects of sini decoction against doxorubicin⁃induced heart failure in rats revealed by mass spectrometry⁃based serum metabolite profiling and computational analysis［J］. J Ethnopharmacol， 2020， 252： 112618.

[27] 曾建雄. 气虚血瘀的理论研究［D］. 福州：福建中医学院， 2010.

[28] Zeng JX. Theoretical study on Qi deficiency and blood stasis［D］.Fuzhou： Fujian University of Traditional Chinese Medicine， 2010.

[29] 钱沛涵， 钱超尘， 杨东方. 桂林古本《伤寒杂病论》伪本新证［J］. 中医文献杂志， 2021， 39（3）： 1⁃5，14.

[30] Qian PH， Qian CC， Yang DF. A new textual research on ancient pseudo version of Shanghan Zabinglun in Guilin［J］. J Tradit Chin Med Literature， 2021， 39（3）： 1⁃5，14.

[31] 曹国世， 李波， 李佳， 等. 人参⁃黄芪药对不同配比化学成分分析及抗氧化活性研究［J］. 中国新药杂志， 2024， 33（11）： 1164⁃1173.

[32] Cao GS， Li B， Li J， et al. Analysis of chemical constituents and antioxidant activity of different ratios of ginseng and Astragalus［J］. Chin J New Drugs， 2024， 33（11）： 1164⁃1173.

[33] 吴昱杰. 复方人参补气颗粒对心梗后心衰大鼠的影响及抗内质网应激作用研究［D］.北京： 北京中医药大学， 2021.

[34] Wu YJ. Effects of compound renshen Buqi granules on post⁃myocardial infarction heart failure in rats and its Anti⁃endoplasmic reticulum stress mechanism［D］.Beijing ： Beijing University of Chinese Medicine， 2021.

[35] Zhu C， Wang Y， Liu H， et al. Oral administration of ginsenoside Rg1 prevents cardiac toxicity induced by doxorubicin in mice through anti⁃apoptosis［J］. Oncotarget， 2017， 8（48）： 83792⁃83801.

[36] 王晶， 高海旺， 李月萍. 中药黄芪水煎剂对慢性心衰患者内分泌激素及心功能影响研究［J］. 中国生化药物杂志， 2015， 35（5）： 101⁃104.

[37] Wang J， Gao HW， Li YP. Effect of endocrine hormone and cardiac function on patients with chronic heart failure by Huangqi decoction［J］. Chin J Biochemical Pharmaceutical， 2015， 35（5）： 101⁃104.

[38] Han Z， Guo L， Yu X， et al. Network⁃driven targeted analysis reveals that astragali radix alleviates doxorubicin⁃induced cardiotoxicity by maintaining fatty acid homeostasis［J］. J Ethnopharmacol， 2022， 287： 114967.

[39] 姜茜茜， 张敬美， 薛思明， 等. 丹参酮Ⅰ基于Akt⁃Nrf2抗氧化通路减轻多柔比星诱导的心脏毒性［J］. 药学学报， 2022， 57（10）： 3077⁃3085.

[40] Jiang QQ， Zhang JM， Xue SM， et al. Tanshinone Ⅰ attenuates doxorubicin⁃induced cardiotoxicity based on the Akt⁃Nrf2 antioxidant pathway［J］. Acta Pharmaceutica Sinica， 2022， 57（10）： 3077⁃3085.

[41] 高荣， 刘清飞， 李贻奎， 等. 中药双龙片对实验性大鼠心肌梗塞的治疗作用［J］. 中成药， 2010， 32（5）： 746⁃749.

[42] Gao R， Liu QF， Li YK， et al， Therapeutic effects of Chinese Herbal medicine Shuanglong tablet on experimental myocardial infarction in rats［J］. Chin Tradit Patent Med， 2010， 32（5）： 746⁃749.

[43] 刘梦媛， 王东海， 宋婷婷. 基于益气活血利水法运用网络药理学和分子对接探讨黄芪⁃丹参⁃茯苓配伍治疗慢性心力衰竭的作用机制［J/OL］. 中医临床研究， 1⁃27 ［2025⁃04⁃27］.

[44] Liu MY， Wang DH， Song TT. Investigation of the mechanism of action of Huangqi⁃Danshen⁃Fuling in the treatment of chronic heart failure based on the method of benefiting Qi， promoting blood and inducing water using network pharmacology and molecular docking［J/OL］. Clin J Chin Med， 1⁃27 ［2025⁃04⁃27］.

[45] 于小刚， 辛二旦， 卢玉俊， 等. 黄芪⁃丹参药对防治心血管疾病的研究进展［J］. 华西药学杂志， 2025， 40（1）： 105⁃109.

[46] Yu XG， Xin ED， Lu YJ， et al. Research progress on the drug pair of Astragalus membranaceus⁃salvia miltiorrhiza in preventing and treating cardiovascular diseases［J］. West Chin J Pharmaceutical Sci， 2025， 40（1）： 105⁃109.

[47] Cory S， Adams JM. The Bcl2 family： Regulators of the cellular life⁃or⁃death switch［J］. Nature Rev Cancer， 2002， 2（9）： 647⁃656.

[48] McArthur K， Kile BT. Apoptotic caspases： Multiple or mistaken identities［J］. Trends Cell Biol， 2018， 28（6）： 475⁃493.

[49] Oltvai ZN， Milliman CL， Korsmeyer SJ. Bcl⁃2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog， Bax， that accelerates programmed cell death［J］. Cell， 1993， 74（4）： 609⁃619.

[50] Meng YY， Yuan YP， Zhang X， et al. Protection against doxorubicin⁃induced cytotoxicity by geniposide involves AMPKα signaling pathway［J］. Oxidative Med Cell Longevity， 2019， 2019： 7901735.

[51] Clutton S. The importance of oxidative stress in apoptosis［J］. British Med Bulletin， 1997， 53（3）： 662⁃668.

基金资助

2023年度“西部青年学者”(23JR6KA028)

2023年国家自然科学基金项目(82360790)

2023年度杰出青年基金项目(23JRRA1203)