同型半胱氨酸干扰滋养细胞线粒体并影响细胞融合功能

Homocysteine interferes with trophoblast mitochondria and affects cell fusion function

摘要

目的 探讨同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）对滋养细胞融合过程的影响及潜在机制。 方法 在体外用Bewo细胞模拟体内滋养细胞进行培养，利用毛喉素（forskolin，FSK）成功构建细胞融合模型，并使用50 µmol/L Hcy处理细胞48 h。运用共聚焦显微镜观察融合情况并计算融合指数；通过ELISA检测人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）含量；通过qPCR技术检测融合基因ERVW‑1、ERVFRD‑1、GCM1、CGB的mRNA表达水平，及与线粒体功能和氧化应激相关基因的mRNA表达情况；通过Western blot测定ERVW‑1、ERVFRD‑1、GCM1的蛋白表达水平；通过免疫荧光检测细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平和膜电位变化；使用化学发光测定ATP水平；采用WST检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性。 结果 滋养细胞在FSK诱导下成功融合，加入Hcy后，细胞出现明显变化：细胞融合指数明显降低（P<0.001），hCG分泌浓度大幅减少（P<0.001），细胞融合相关的基因和蛋白表达水平明显降低（P<0.05）；线粒体膜电位下降（P<0.001），ATP水平明显减少（P<0.01），线粒体融合相关基因表达量明显降低（P<0.001），而线粒体分裂基因的表达量明显升高（P<0.05）；细胞内ROS生成量明显增加（P<0.01），T‑SOD活性明显降低（P<0.001），氧化应激关键调控基因NRF2 mRNA表达水平明显降低（P<0.001）。 结论 Hcy可能通过干扰线粒体正常功能，促使ROS大量生成，引发氧化应激反应，阻碍滋养细胞的正常融合与hCG分泌，对胎盘发育和妊娠健康产生负面影响。

Abstract

Objective To investigate the effect of homocysteine （Hcy） on the fusion process of trophoblast cells and its potential mechanism. Methods Bewo cells were cultured in vitro to mimic in vivo trophoblasts， successfully constructing a cell fusion model with forskolin （FSK）， and treating cells with 50 µmol/L Hcy for 48 hours. A confocal microscopy was used to observe the fusion status and calculate the fusion index， and the human chorionic gonadotropin （hCG） levels were detected by ELISA. The mRNA expression levels of fusion genes ERVW‑1， ERVFRD‑1， GCM1，and CGB， as well as the mRNA expression of genes relate to mitochondrial function and oxidative stress were detected by qPCR. The protein expression levels of ERVW‑1， ERVFRD‑1， and GCM1 were measured by Western blot. Intracellular reactive oxygen species （ROS） levels and membrane potential were detected by immunofluorescence. ATP levels were measured using chemiluminescence method. The activity of superoxide dismutase （SOD） was determining by WST method. Results Trophoblast cells were successfully fused under FSK induction， and the cells showed significant changes upon the addition of Hcy； the cell fusion index was significantly reduced （P<0.001）； the hCG secretion was greatly reduced （P<0.001）， and both gene and protein expression levels relate to cell fusion were significantly down‑regulated （P<0.05）. Mitochondrial membrane potential declined （P<0.001）， the ATP levels significantly decreased （P<0.01）， and the expression of mitochondrial fusion‑related genes substantially reduced （P<0.001）， while the expression of mitochondrial fission genes widely increased （P<0.05）. The amount of intracellular ROS production was significantly increased （P<0.01）. The activity of T‑SOD was visibly declined （P<0.001）， and the mRNA expression level of NRF2， a key gene of oxidative stress was significantly decreased （P<0.001）. Conclusion Hcy may have a negative impact on placental development and pregnancy health by interfering with the normal function of mitochondria， promoting the production of ROS， triggering oxidative stress， and hindering the normal fusion of trophoblasts and hCG secretion.

Graphical abstract

关键词

滋养细胞 / 同型半胱氨酸 / 合胞化 / 线粒体 / 氧化应激

Key words

Trophoblast / Homocysteine / Syncytization / Mitochondria / Oxidative stress

同型半胱氨酸（Hcy）是甲硫氨酸在体内代谢过程中产生的一种非组成型氨基酸。当摄入蛋白质过多或Hcy代谢异常时，其在体内含量升高，严重时会引发高同型半胱氨酸血症（HHcy）^［1］。高水平Hcy可增加心脑血管疾病风险，自由基增多，影响免疫系统，及增加妊娠并发症风险，影响胎儿健康^［2，3］。人们生活条件的普遍改善易导致体内Hcy升高，尤其是孕妇群体更注重孕期营养与蛋白摄入，使得妊娠期Hcy水平不断攀升。统计显示，全球HHcy发病率为5%~7%，而我国HHcy发病率达27.5%，远高于部分发达国家^［4］。有研究表明，Hcy水平升高会增加先兆子痫（PE）、胎儿生长受限（FGR）、复发性流产等常见妊娠并发症的发生风险^［5，6］。Hcy还可通过破坏胎盘发育，引发各种妊娠疾病^［7］。

滋养细胞在胎盘形成和保持正常功能中发挥着重要作用。单核滋养细胞分化融合形成合体滋养细胞（STB）是保证胎盘正常发育的关键步骤，STB极大的表面积有助于母体与胎儿之间的物质和气体交换及激素释放，例如人绒毛膜促性腺激素（hCG），以维持妊娠状态^［8］。若滋养细胞合胞化缺失或受到抑制，会导致胎盘屏障形成受损、营养物质和气体交换不畅，还会影响胎盘激素的分泌，最终导致不良妊娠结局^［9］。调查显示，70%的不良妊娠结局与滋养细胞的分化融合异常有关^［10］。以往关于Hcy对胎盘影响的研究主要集中在血管内皮细胞损伤方面，而妊娠期间Hcy异常高水平与滋养细胞融合之间的关联研究较少。

线粒体是细胞能量代谢的核心场所，其功能直接影响细胞能量供应和氧化应激水平。有研究表明，线粒体功能障碍可在心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞中引起活性氧（ROS）增加，诱导氧化应激，最终干扰细胞的正常程序^［11］。Hcy可通过自氧化或增加ROS引发线粒体功能障碍，而线粒体功能异常又进一步增加ROS的产生，造成细胞氧化损伤，进而影响细胞正常功能^［12］，损害胎盘滋养细胞，干扰滋养细胞融合，最终导致胎盘发育不良。

本研究利用毛喉素（FSK）与人绒毛膜癌（Bewo）细胞构建滋养细胞的融合模型，观察在50 µmol/L Hcy作用下细胞融合与分泌功能及线粒体相关指标的变化，旨在确认Hcy对胎盘滋养细胞融合及功能的影响，并从线粒体功能和相关基因方面探究其内在机制，为预防Hcy带来的潜在不良妊娠结局提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞株及药品

人绒毛膜癌细胞Bewo（武汉普诺赛公司）；Hcy（规格：10 mg，美国Sigma‑Aldrich公司）。

1.2 主要的试剂与仪器

胰蛋白酶和胎牛血清（FBS）、Ham's F‑12基础培养基、1%PBS缓冲液购于武汉普诺赛公司；细胞计数试剂盒‑8（CCK‑8）、蛋白Marker、Trizol试剂、反转录试剂盒及SYBR^® Green试剂购于北京聚合美公司；FSK购于上海源叶公司；ROS检测试剂盒购于上海碧云天公司；hCG 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、线粒体膜电位检测（JC‑1）试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、ECL显色试剂盒购于武汉伊莱瑞特公司；总超氧化物歧化酶（T‑SOD）试剂盒、8% SDS‑PAGE凝胶购于塞维尔公司；PCR引物购于北京祥鸿公司；TBST缓冲液、RIPA缓冲液、ERVFRD‑1多克隆抗体购于北京索莱宝公司；ERVW‑1多克隆抗体、GCM1多克隆抗体、ZO‑1多克隆抗体、兔抗、鼠抗、PVDF膜购于武汉三鹰公司。

酶标仪购于美国BioRad公司；多功能酶标仪购于北京悦昌行公司；荧光显微镜购于尼康精机上海公司；共聚焦显微镜购于日本Nikon公司；PCR仪购于瑞士罗氏公司。

1.3 细胞培养及模型组制备

Bewo细胞常规生长并维持在补充有10% FBS、1%青霉素/链霉素和1%L‑谷氨酰胺的Ham's F‑12培养基中，置于37 ℃、5% CO₂的潮湿培养箱中培养。未分化的Bewo细胞（单核滋养细胞）用50 µmol/L Hcy处理48 h。为了诱导单核滋养细胞分化融合形成STB，使用50 µmol/L FSK分化48 h，以促进细胞融合。据更换相应的培养条件处理而分组为：Control组（完全培养基组）；FSK组（50 µmol/L FSK+完全培养基）；Hcy组（50 µmol/L Hcy+完全培养基）；FSK+Hcy组（50 µmol/L FSK+50 µmol /L Hcy+完全培养基）。判断细胞融合的标准：（1）显微镜下观察到的多核细胞数量较多；（2）融合相关分子ERVW‑1、ERVFRD‑1、GCM1在mRNA与蛋白层面明显上调；（3）功能学指标明显上调，滋养层合胞体会分泌特定的激素，如hCG的分泌量明显增多；（4）FSK组与Control组差异具有统计学意义。

1.4 CCK‑8检测最佳Hcy浓度

将Bewo细胞接种至96孔板中。将含有培养基而不含细胞的一组作为空白组，而既有培养基又含细胞的一组设为对照组，处理组分别为50、100、200 µmol/L Hcy。每组在培养24 h后，更换相应条件再培养48 h后每孔加10 µL的CCK‑8试剂，在37 ℃、5% CO₂的潮湿环境中放置2 h。立即使用酶标仪在450 nm处记录吸光度。计算细胞存活率，结果以（处理组-空白组）吸光度/（对照组-空白组）吸光度的百分比（%）表示，挑选细胞活力约为80%的Hcy浓度用于后续对细胞融合影响方面的实验。

1.5 激光共聚焦显微镜观察各组细胞融合情况

将Bewo细胞接种于共聚焦培养皿中，依据“1.3”项中所述的组别条件处理细胞48 h，吸出共聚焦培养皿中的旧培养基，用多聚甲醛固定15~20 min。用1% TBST润洗细胞，0.2%TritonX‑100进行渗透处理，用1% BSA封闭30~60 min。用TBST稀释成1%的BSA将ZO‑1作一抗按1∶800的比例稀释，在4 ℃孵育过夜。第2天用TBST稀释成1%的BSA将山羊抗兔作二抗按1∶400的比例稀释，并在室温下孵育2 h。随后加入DAPI，使用共聚焦显微镜观察细胞融合情况。每个样本采集3个视野，计算不同视野的平均融合百分比，以此量化细胞融合程度，计算融合指数。其中融合细胞的判定标准为每个连续膜具有2个或更多个细胞核的细胞。ZO‑1用于标记细胞边界，呈绿色；DAPI用于染色细胞核，呈蓝色。

1.6 ELISA检测各组细胞hCG的表达水平

hCG为分泌蛋白，将Bewo细胞接种于6孔板上培养24 h，更换相应的培养条件处理48 h后收集上清液，采用hCG ELISA试剂盒通过酶联免疫吸附测定分析hCG蛋白分泌水平。

1.7 qPCR检测各组细胞融合基因及线粒体和氧化应激相关基因表达水平

将Bewo细胞接种在6孔板，并用各组条件处理48 h后用TRIzol试剂裂解收获细胞进行RNA的提取。使用试剂盒进行反转录备用，以β‑actin为内参，配置10 µL的实验体系（Mix 5 µL，DEPC水3.6 µL，cDNA 1 µL，前引和后引各0.2 µL），反应条件：变性95 ℃，30 s；退火60 ℃，30 s；延伸50 ℃，30 s。基因及其各自的引物序列见表1。使用2^-ΔΔCT分析定量mRNA的相对表达量。ERVW‑1、ERVFRD‑1、CGB、GCM1为滋养细胞融合基因；MNF1、MNF2、OPA1为线粒体融合基因，DRP1为线粒体分裂基因；NRF2、HSP60、HSP70为氧化应激相关基因。

1.8 Western blot检测各组细胞ERVW‑1、ERVFRD‑1、GCM1蛋白表达水平

将Bewo细胞接种在6孔板，并用各组条件处理48 h，加入RIPA缓冲液裂解细胞，获取蛋白，进行BCA蛋白定量并通过8% SDS‑PAGE分离，再转移到PVDF膜上。用ERVW‑1（syncytin1）多克隆抗体、ERVFRD‑1（syncytin2）多克隆抗体、GCM1多克隆抗体对膜进行免疫印迹，并在与之对应种属的二体孵育后使用超敏发光液通过化学发光显示特异性条带。结果以目的条带灰度值/GAPDH灰度值表示。抗体浓度稀释比例为：GAPDH（1∶100 000）、ERVW‑1（1∶800）、ERVFRD‑1（1∶800）、GCM1（1∶600）。

1.9 试剂盒检测细胞ATP水平

将细胞接种于6孔板培养24 h，根据相应组别条件处理细胞48 h后按照试剂盒说明书步骤收获细胞，用多功能酶标仪进行化学发光检测定信号强度，同时使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，最后计算单位蛋白浓度内ATP的含量。

1.10 试剂盒检测线粒体膜电位水平

将细胞接种于6孔板培养24 h后根据各组条件处理细胞48 h，使用JC‑1试剂盒通过荧光显微镜观察各组细胞膜电位变化情况。

1.11 荧光显微镜观察细胞ROS情况

将细胞接种于6孔板24 h，根据相应组别条件处理48 h后按照说明书用DCFH‑DA荧光探针加入细胞与ROS反应，放入培养箱中37 ℃避光孵育30 min，取出后用1% PBS清洗2~3次。采用荧光显微镜观察结果，绿色分布越多间接反映ROS水平越高。

1.12 试剂盒检测细胞SOD活力

根据相应组别条件处理细胞48 h后收获细胞，按照试剂盒说明书步骤进行操作，测定SOD活力，同时使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，最后计算单位蛋白浓度内SOD的活力。

1.13 统计学处理

使用SPSS 28.0软件进行数据统计分析。符合正态分布的计量资料以\overline{x}\pm s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。采用GraphPad 9进行绘图。

2 结果

2.1 Hcy降低滋养细胞活力

Hcy对细胞存活率的影响呈剂量依赖性（图1）。与Control组相比，随着Hcy浓度的升高，细胞的存活率逐渐降低（P<0.05），由于本实验主要探究Hcy对细胞融合方面的影响，所以选用对细胞活力影响较小的50 µmol/L Hcy作为细胞的处理浓度。

2.2 Hcy抑制滋养细胞融合及激素分泌

使用共聚焦显微镜观察细胞融合情况（图2A），计算融合指数（图2B），并用ELISA检测hCG表达量（图2C）。结果显示，与Control组相比，FSK组细胞融合明显，多核细胞常见，融合的细胞可见边界消失，hCG浓度明显上升（P<0.001）；与FSK组相比，FSK+Hcy组细胞边界清晰明显，融合指数降低（P<0.001），hCG浓度明显下降（P<0.001），见图2A~C。

2.3 Hcy抑制滋养细胞融合的基因表达

ERVW‑1、ERVFRD‑1和GCM1基因是调控滋养细胞融合的关键基因，CGB基因作为hCG的β亚基，影响hCG的表达，可间接反映滋养细胞融合情况。采用qPCR和Western blot检测探究Hcy对上述基因mRNA（图3A）和蛋白（图3B）水平表达的影响。结果显示，与FSK组相比，经Hcy处理的组别中，ERVW‑1、ERVFRD‑1、CGB、GCM1 mRNA表达水平及ERVW‑1、GCM1蛋白表达水平有不同程度降低，差异具有统计学意义（P<0.05），见图3A~C。

2.4 Hcy影响线粒体动态、电位、功能及其相关基因

线粒体动态平衡紊乱会致使膜电位降低，引发线粒体功能障碍，进而导致ATP水平下降。为探究Hcy对滋养细胞线粒体的影响，本研究检测了线粒体膜电位（图4A）及线粒体融合基因MFN1、MFN2、OPA1，分裂基因DRP1的mRNA水平和ATP水平（图4B、C）。结果显示，与FSK组相比，FSK+Hcy组的线粒体融合基因表达量明显降低（P<0.001），分裂基因表达量明显升高（P<0.05）；线粒体膜电位明显降低（P<0.001），ATP水平也明显降低（P<0.01），见图4A~C。

2.5 Hcy增加ROS的产生和滋养细胞氧化应激标志物的表达

线粒体功能障碍会导致ROS增多，而ROS紊乱又会诱导氧化应激反应。SOD、NRF2、HSP60、HSP70是氧化应激的重要调节分子。结果显示，用Hcy处理细胞后，与FSK组相比，FSK+Hcy组ROS明显升高（P<0.01），T‑SOD活性明显降低（P<0.001），维持机体氧化平衡的NRF2 mRNA表达量明显降低（P<0.001），HSP60和HSP70 mRNA表达量明显升高（P<0.05），见图5A~C。

3 讨论

胎盘的异常发育在多种妊娠并发症中扮演着重要角色，其中滋养细胞融合不良是胎盘发育异常的重要机制^［13］。STB形成异常会引发FGR、PE等妊娠疾病^［14］。近年来，Hcy水平升高与妊娠相关疾病的关系备受关注，Hcy已成为临床上评估健康妊娠的重要指标^［15］。妊娠期高Hcy血症主要与叶酸和维生素B₁₂缺乏有关，尽管目前对于叶酸的补充已经得到广泛重视，但维生素B₁₂的补充常被忽视。有研究证明，维生素B₁₂缺乏会增加妊娠糖尿病的风险^［16］，这可能与Hcy增高有关。有研究表明，高甲硫氨酸饲喂大鼠的出生体重明显降低，胎儿死亡率高出15%^［17］，提示Hcy会增加胎儿宫内受限的风险。Zhou等^［18］认为高水平的Hcy可干扰胎盘氨基酸转运，进而导致FGR。

本研究旨在探究Hcy对滋养细胞融合的影响机制。通过FSK诱导Bewo细胞融合模型，并加入50 µmol/L Hcy干预。共聚焦显微镜观察显示，与Control组比较，FSK组细胞边界消失，多核细胞常见，表明融合模型构建成功；FSK+Hcy组与FSK组相比，细胞边界清晰明显，且融合指数明显下降，提示Hcy抑制了滋养细胞融合。在妊娠期间STB分泌多种激素，其中hCG能促进孕酮的分泌、维持妊娠，反过来又能促进滋养细胞融合^［19］。本研究评估了滋养细胞hCG水平，发现随着细胞融合率降低，hCG的分泌与基因表达量也随之减少。在细胞融合中，合胞素扮演着十分重要的角色，在FGR患者中发现，编码合胞素及其受体的基因ERVW‑1、ERVFRD‑1及合胞素上游的GCM1基因在mRNA水平明显下调^{［20，21］}。合胞素与GCM1表达下降会造成滋养细胞融合不良，而滋养层合胞体的形成受阻会影响其分泌激素hCG的功能，从而进一步阻碍胎盘的发育。本研究也发现在高浓度Hcy影响下，这3个融合相关基因mRNA与蛋白水平的相对表达量明显降低，这与融合指数下降息息相关。综上所述，本研究观察到Hcy具有抑制滋养细胞融合和hCG激素分泌的功能，这与Soliman等^［22］在小鼠中的发现一致，并提示Hcy可能通过下调相关基因抑制这一过程。

线粒体功能障碍、氧化应激与滋养细胞发育密切相关^{［23，24］}。研究表明，线粒体产生的ROS异常增加会损害滋养细胞功能，影响激素产生并下调融合相关基因致使融合率降低5倍^［25］。本研究发现，与FSK组相比，FSK+Hcy组ROS明显增加，融合指数下降了1.4倍。线粒体膜电位降低和功能失调会促使ROS的生成，而ROS又进一步损伤线粒体，形成恶性循环^{［26，27］}，线粒体功能与细胞融合密切相关。有研究表明，缺乏MFN1或MFN2的胚胎成纤维细胞表现出不同类型的片段化线粒体，并导致膜电位水平降低，Chen等^［28］认为出现这种表型是由于线粒体融合的严重降低。胎盘作为细胞融合活跃的器官，其能量供应依赖于线粒体，线粒体通过融合与裂解维持动态平衡，一旦失衡将导致功能受损^［29］。本研究发现，在Hcy的影响下，线粒体融合基因MFN1、MFN2、OPA1表达下调；裂变基因DPR1表达上调，同时膜电位降低、ATP生成减少。线粒体氧化损伤加剧会引起功能障碍，进而丧失呼吸和生物合成活性，导致细胞不生产ATP^［30］。这表明Hcy增强细胞氧化作用又反过来影响线粒体功能，使ATP产生减少，无法充足提供细胞融合所需要的能量，从而导致细胞融合率降低。此外，健康的线粒体通过“穿梭”在合体滋养层中传递代谢信号与能量物质^［31］，而碎片化线粒体导致细胞间通讯效率降低，会阻碍滋养细胞融合信号与能量的获得，这说明Hcy促进线粒体裂解后可能导致滋养细胞之间信号传导不畅，从而影响细胞融合。

氧化与抗氧化系统的动态平衡对细胞功能至关重要。SOD作为重要的抗氧化剂，在细胞发生氧化时会积极参与抗氧化反应。本研究发现，FSK在与Hcy共同作用下，T‑SOD活性明显降低，线粒体伴侣蛋白HSP60和HSP70 mRNA表达上调，NRF2表达下调，与李亚奇等^［32］的研究结果一致，这提示了Hcy诱导滋养细胞中ROS过度产生，诱导氧化应激，导致氧化与抗氧化系统失衡。越来越多的证据表明，通常由胎盘滋养细胞内的线粒体功能障碍引起的氧化应激可能在PE前期的发生和进展中起主要作用^［33］。在病理条件下，滋养层应激导致促炎因子和血管活性因子的释放，上调了炎症因子，导致合胞素及其转录激活剂GCM1降低，抑制滋养细胞的融合作用^{［34，35］}，表明Hcy诱导的氧化应激可能通过破坏线粒体功能抑制滋养细胞融合。

综上所述，本研究发现，较高浓度（50 µmol/L）的Hcy可以破坏滋养细胞的线粒体功能，诱导细胞发生氧化应激，同时抑制滋养细胞融合相关基因的表达，最终达到抑制滋养细胞融合及hCG激素分泌的效果。由于细胞实验的局限性，后续研究需在个体层面进一步验证Hcy对胎盘功能的影响，以更准确地揭示其内在机制。

作者贡献度说明：

王议平：选题、实验设计、完成实验、数据统计分析、撰写论文；李铭洋：实验操作、数据分析、论文修改；蔡忠宇、李瑞霞：细胞培养、参与实验内容规划；魏晓星：手稿修改、润色、最终审核。

本文所有作者不存在利益冲突

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基金资助

青海省科学技术厅自然科学基金(2024‑ZJ‑923)

青海省“昆仑英才”高端创新创业人才项目(QHKLYC‑GDCXCY‑2022‑080)