XKR8基因敲除小鼠可以保护由噪声诱导的听力损伤

XKR8 knockout mice can protect against noise‑induced hearing damage

摘要

目的 探讨XKR8基因在噪声性耳聋（noise‑induced hearing loss，NIHL）中对其听力的影响。 方法 选用6~8周龄XKR8纯合子小鼠（XKR8^‑/‑，XKR8 KO）和野生型（Wild‑type，WT）进行实验，并且先通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、琼脂糖凝胶电泳和蛋白免疫印迹实验（Western blot）来确定基因敲除小鼠的基因型。将小鼠分为未进行噪声暴露的WT组和XKR8组与进行噪声暴露的WT‑110 dB组和XKR8‑110 dB组。将XKR8 KO小鼠和WT小鼠暴露于范围为8~20 kHz、强度为110 dB SPL的宽带噪声中持续2 h，在暴噪后的1、3、7、14 d时分别进行听觉脑干反应（auditory brainstem response，ABR）测听，在第14天ABR测听结束后将小鼠处死并取耳蜗进行铺片和解剖，通过免疫荧光染色，检测外毛细胞（outer hair cell，OHC）的形态和丢失数量。 结果 基因型鉴定后，选用XKR8 KO（XKR8^‑/‑）小鼠和WT小鼠进行实验。暴露噪声前，ABR测听结果显示XKR8 KO和WT小鼠的基础听力差异无统计学意义（P>0.05）。暴露噪声后第1天，ABR结果提示XKR8‑110 dB组和WT‑110 dB组的听阈达到85 dB左右；在噪声暴露后第3、7、14天，XKR8‑110 dB组小鼠的听力阈值较WT‑110 dB组小鼠低（P<0.05）。OHC免疫荧光染色显示，XKR8‑110 dB组和WT‑110 dB 2组在顶回（Apex）和中回（Middle）前段差异无统计学意义（P>0.05），而在Middle中后段和底回（Base），XKR8‑110 dB组OHC的丢失较WT‑110 dB组少（P<0.05）。 结论 在噪声暴露后，XKR8 KO小鼠的听力水平优于WT小鼠，减轻了由噪声诱导的听力损伤。免疫荧光染色结果显示，XKR8 KO小鼠的OHC的丢失少于WT小鼠，减轻了由噪声诱导的OHC损伤。

Abstract

Objective To explore the impact of the XKR8 gene on hearing in noise‑induced hearing loss （NIHL）. Methods In this experiment， 6‑8 week old XKR8 homozygous knockout mice （XKR8^‑/‑， XKR8 KO） and wild‑type （WT） mice were selected. Polymerase chain reaction （PCR）， agarose gel electrophoresis， and Western blot were used to determine the genotype of the knockout mice. Mice were divided into non‑noise‑exposed WT and XKR8 groups， and noise‑exposed WT‑110 dB and XKR8‑110 dB groups. XKR8 KO and WT mice were exposed to broadband noise with a frequency range of 8‑20 kHz and an intensity of 110 dB SPL for 2 hours. Auditory brainstem response （ABR） tests were conducted at 1， 3， 7，14 days after noise exposure. On day 14， after ABR testing， the mice were sacrificed， and their cochleae were dissected and sectioned. Immunofluorescence staining was used to examine the morphology and loss of outer hair cell （OHC）. Results After genotyping， XKR8 KO （XKR8^‑/‑） and WT mice were used for the experiments. ABR test results before noise exposure showed no significant difference in baseline hearing between XKR8 KO and WT mice （P>0.05）. On day 1 after noise exposure， ABR results indicated that the hearing thresholds of both the XKR8‑110 dB and WT‑110 dB groups were around 85 dB. On days 3， 7， 14 after noise exposure， the hearing thresholds of the XKR8‑110 dB group were lower than those of the WT‑110 dB group （P<0.05）. Immunofluorescence staining of OHC showed no significant difference between the XKR8‑110 dB and WT‑110 dB groups in the apex and middle segments （P>0.05）. However， in the middle and basal segments， the XKR8‑110 dB group had less OHC loss than the WT‑110 dB group （P<0.05）. Conclusion After noise exposure， XKR8 KO mice exhibited superior hearing levels compared to WT mice， mitigating noise-induced hearing damage. Immunofluorescence staining revealed that XKR8 KO mice had less OHC loss than WT mice， reducing noise-induced OHC damage.

Graphical abstract

关键词

噪声性耳聋 / XKR8 / OHC损伤 / 听力保护

Key words

Noise‑induced hearing loss / XKR8 / OHC damage / Hearing protection

噪声性耳聋（noise‑induced hearing loss，NIHL）是全球范围内导致听力障碍的主要因素之一，影响着超过6亿人口。据世界卫生组织（World Health Organization， WHO）统计，约三分之一的听力损失案例可归因于噪声暴露^［1‑3］。长期处于噪声环境中，不仅会使耳蜗受损，导致听力减退，还可能引发耳鸣等其他听觉功能障碍^［1，2］。NIHL的发生机制较为复杂，其可由暂时性（temporary threshold shift，TTS）或永久性听力阈值偏移（permanent threshold shift，PTS）引起^［9‑12］，这取决于噪声的类型、持续时间和强度。研究表明，Corti器的细胞结构损伤，尤其是外毛细胞（outer hair cells，OHC），这些细胞较为脆弱且在耳蜗中起到放大器的作用。传统观点认为，NIHL的损伤源于噪声引起的机械性剪切力直接破坏耳蜗微结构^［13］。然而，近年研究揭示，噪声暴露触发的一系列分子级联反应，尤其是线粒体功能障碍、氧化应激损伤和能量代谢失衡才是导致毛细胞死亡和听力永久丧失的核心机制^［14］。而其中存在某些基因可以调控细胞凋亡或者氧化应激损伤的相关通路，如敲除Cochlin基因后，其小鼠会出现迟发型的听力损伤和前庭功能受损，但是其内耳OHC和内毛细胞（IHC）突触细胞与野生型（WT）小鼠相比并无差异。而且在噪声暴露后，其表现出对OHC的保护作用，其主要通过调节内耳局部免疫反应来调节耳蜗内的氧化应激损伤^［7，8］。许多研究表明，在敲除某个基因后，听觉系统会受到损害，表现出类似听神经病（auditory neuropathy，AN），和前庭功能障碍的表型，这些是沿听觉通路的损害^［6，7］。听觉通路是声音信号从外耳传递到大脑皮层的神经处理链条，简而言之就是由外耳收集声波通过中耳放大传入内耳，内耳内的基底膜和毛细胞将机械信号转化为电信号，进一步传入中枢的过程。此外，这些基因敲除小鼠在噪声暴露后与WT小鼠相比，都显示出对OHC和IHC突触细胞的保护作用，基因敲除小鼠噪声暴露后其OHC和突触细胞的丢失较少^［6，7］。在之前团队的研究中，发现一个新的与听觉神经相关的基因XKR8，该基因可能在内耳发育和神经稳态维持中发挥重要作用^［6］。

小鼠XKR8基因位于4号染色体区域，全长为4 238 bp，其中编码区长度为1 194 bp；而人类XKR8基因位于染色体区域，全长为2 718 bp，编码区长度为1 188 bp［NM_018053］。人类的XKR8基因与小鼠体内XKR8基因作用基本相同，具有高度保守性，该基因编码XK相关蛋白8（XKR8），该蛋白包含395个氨基酸和10个跨膜区域，主要定位于细胞膜表面^［4，5］。这种蛋白在凋亡细胞的吞噬和成肌细胞分化的调节中起着关键作用^［4，5］。有研究报道XKR8能够促进磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine， PS）向外翻转至细胞膜，并介导细胞凋亡过程^［3-5］。这一过程在免疫系统中至关重要，PS外露可被巨噬细胞识别，从而促进凋亡细胞的清除^［3，4］。匹兹堡大学的研究团队发现，抑制XKR8可减少PS外露，增强化疗效果并改善肿瘤微环境。因为化疗后，XKR8表达上调，促进PS外露，导致肿瘤细胞逃避免疫清除，形成化疗耐药性^{［15，16］}。噪声暴露可导致耳蜗毛细胞凋亡，而XKR8作为PS外翻酶，可能参与这一过程。PS外露通常促进凋亡细胞的清除，但过度激活可能导致炎症反应，加重耳蜗损伤，进一步加速毛细胞的凋亡，加剧听力损失^［6］。尽管XKR8在多种器官和细胞中的功能已得到广泛研究，但其在噪声性耳聋中的作用尚未被报道。因此，选择6~8周龄的XKR8基因敲除纯合子（XKR8^‑/‑）小鼠和WT小鼠作为研究对象，旨在探究XKR8基因在噪声暴露后在NIHL发生、发展中的表现。

1 材料与方法

1.1 动物

所有实验使用C57BL/6J小鼠进行。共使用10只6~8周龄、体重19~25 g的雄性SPF级C57BL/6J小鼠，这些小鼠购自武汉动物实验中心，并在动物设施中适应1周。携带杂合变异c.710G>A（称为XKR8^+/-）的转基因小鼠由武汉索莱宝公司提供。使用XKR8基因敲除小鼠的交配繁殖后代，并在小鼠2周龄时通过PCR和Western blot进行基因分型。基因分型后，选取22只6~9周龄的XKR8基因敲除纯合子小鼠（XKR8^‑/‑）进行实验，并将其分为4组：WT组（7只小鼠）、WT‑110 dB组（4只小鼠）、XKR8组（7只小鼠）和XKR8‑110 dB组（4只小鼠）。本研究动物实验已取得海南省人民医院伦理委员会的批准，伦理号：医伦研［2025］135号。

1.2 蛋白质提取和Western blot

从WT、WT‑110 dB、XKR8和XKR8‑110 dB组（每组3只小鼠）中提取耳蜗组织后，加入RIPA裂解液，在4 ℃下裂解30 min。然后将裂解物离心10 min，收集上清液以制备蛋白样品。将样品稀释后，取20 μL加入含有标准牛血清稀释剂的96孔板中。然后向每孔中加入200 μL蛋白测定试剂盒的工作液，并在562 nm处测量吸光度。根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。制备10%聚丙烯酰胺凝胶用于电泳。将样品与5×缓冲液混合后进行电泳。将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，然后用5%脱脂奶粉（溶于0.5% TBST）在室温下封闭1 h。按以下稀释度加入一抗，并在4 ℃下孵育过夜：GAPDH（武汉三鹰；1∶2 000）、XKR8（Abcam；1∶1 000）。孵育过夜后，用TBST洗涤膜3次，然后加入稀释的二抗，即HRP山羊抗兔抗体（武汉三鹰；1∶3 000），在室温下孵育1 h。然后用TBST洗涤膜3次，每次10 min。准备ECL底物，将膜曝光、显影和固定。使用Quantity One软件分析蛋白条带的灰度值，以目标条带的光密度与内参条带光密度的比值作为目标蛋白的相对表达水平。

1.3 耳蜗表面制备和免疫荧光染色

在噪声暴露后14 d，进行ABR测听后，通过颈椎脱臼处死小鼠，并移除其头部。切除脑组织以暴露颞骨，从中仔细取出耳蜗。将耳蜗转移到4%多聚甲醛中。使用注射器在耳蜗顶端钻孔，并移除镫骨足板。通过耳蜗顶端、卵圆窗和圆窗灌注多聚甲醛。然后将耳蜗浸入新鲜的多聚甲醛中，在室温下固定2 h。固定2 h后，将耳蜗转移到4% EDTA中进行脱钙。每天更换EDTA溶液，脱钙过程持续2、3 d，具体取决于组织的状况。然后将耳蜗用3% Triton X‑100（溶于PBS）在室温下处理30 min，随后用PBS洗涤3次。接下来，用10%山羊血清（溶于PBS）在室温下封闭耳蜗30 min，随后用PBS洗涤3次，每次5 min。加入100 μL Alexa Fluor 488‑Phalloidin一抗稀释液（1∶2 000），在室温下黑暗中孵育30 min。然后用PBS洗涤3次，每次5 min。加入100 μL DAPI（1∶1 000）对细胞核进行染色，在室温下黑暗中孵育10 min。最后，使用抗褪色封片剂对样本进行封片。

1.4 噪声暴露

野生型（WT）和XKR8基因敲除小鼠暴露于8~20 kHz、110 dB SPL的宽带噪声中，持续2 h。声音通过一个尺寸为60 cm×70 cm×40 cm（长×宽×高）的有机玻璃混响室传递。在噪声暴露期间，动物保持清醒，并可在室内自由活动。在噪声暴露后1、3、7、14 d对WT‑110 dB和XKR8‑110 dB组进行听觉脑干反应（ABR）测量，以评估听力。在14 d的ABR测量后，通过断头处死小鼠，并用多聚甲醛灌注耳蜗。

1.5 ABR测听

野生型（WT）和XKR8基因敲除小鼠在噪声暴露前1 d以及噪声暴露后1、3、7、14 d进行ABR测听。通过腹腔注射麻醉药对小鼠进行麻醉。使用TDT‑Ⅲ（Tucker‑Davis Technologies，美国）系列硬件和软件产生刺激信号并记录诱发的电位。刺激信号为短纯音，检测频率依次设置为click、8、16、24、32 kHz。刺激重复率为21次/s，最大刺激强度为90 dB SPL，以5~10 dB SPL的步长递减。诱发的电位被放大并输出，平均超过500次扫描。将产生可重复（至少2次）的波Ⅲ模式的最小刺激强度，且波Ⅲ潜伏期为2.25~3.25 ms，确定为阈值。阈值移动定义为听觉功能的丧失，即在给定频率下噪声暴露前后听觉阈值的差异。

1.6 外毛细胞（OHC）丢失率计数

在40×倒置荧光显微镜下，从耳蜗顶端到底部对用Phalloidin和DAPI染色的耳蜗毛细胞进行计数。同时测量并记录基底膜的总长度（以毫米为单位）。根据这些测量结果计算每0.5 mm基底膜的外毛细胞丢失率。然后据此构建细胞耳蜗图。

1.7 PCR和琼脂糖凝胶实验

本文采用剪取小鼠脚趾进行编号，使用基因组DNA提取试剂盒（货号K9053，南通麦杰生物科技有限公司）从小鼠尾部组织中提取基因组DNA。小鼠XKR8的正向和反向引物（ACACGAACCCTATCATCAAC；ACGCAAAGCCAGTCCC）扩增出962 bp的产物，而WT的产物大小为958 bp。实验过程：将含有3 mm左右鼠尾的离心管中，加入100 μLBuffer L以及10 μLProteinase K，振荡混匀，短暂离心，仔细观察确保鼠尾等组织充分浸没在裂解液中；58 ℃消化直至组织裂解液清澈，裂解完全；将样品裂解液中加入500 μLBuffer N，充分混匀后，将得到溶液（包括可能产生的沉淀）全部转移至DNA吸附柱内柱中。室温静置2 min后，10 000 r/min 离心30 s，倒掉废液收集管中的废液，将吸附柱重新放回DNA吸附柱对应的收集管中。加入600 μL Buffer W2于离心吸附柱中，10 000 r/min离心30 s。倒掉废液收集管中的废液，并将吸附柱重新放回对应的收集管中。12 000 r/min离心2 min，小心取出吸附柱，将其套入一个干净的1.5 mL离心管中，将DNA吸附柱在流风中静置10 min，有助于使DNA吸附柱上残留的乙醇彻底挥发。在吸附柱的膜中央加入65 ℃预热的200 μLBuffer E。室温放置1 min，10 000 r/min离心1 min。收集DNA溶液。取洗脱的基因组DNA溶液3.0 μL，跑1.0%琼脂糖凝胶电泳，检测DNA提取质量。收集的DNA可用于下游的PCR等分子生物学实验，长期存放，置于-20 ℃冰箱内，以防DNA降解。

1.8 统计学处理

采用SPSS 25.0统计学软件，计量资料以\overline{x}\pm s表示。2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较根据是否符合正态分布及方差齐性选定单因素方差分析（one‑factor ANOVA），根据在各个时间点不同组的听力阈值使用Boferroni法进行两两组比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 构建XKR8 KO小鼠模型

通过XKR8基因敲除后的杂合子（XKR8^+/‑）小鼠进行繁殖，繁殖小鼠在出生后1周左右时，剪取脚趾和鼠尾，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定（图1A、B）。通过Western blot验证XKR8 基因敲除纯合子小鼠（XKR8^‑/‑）的耳蜗内有无存在XKR8蛋白表达情况，结果显示，与WT小鼠相比，XKR8 KO小鼠耳蜗内无XKR8蛋白表达（图1C）。以上结果表明XKR8 KO小鼠模型构建成功。

2.2 WT组和XKR8 KO组小鼠噪声暴露前的听力阈值情况

选用6周龄小鼠，通过ABR实验检测XKR8 KO组小鼠和WT组小鼠听力阈值水平。检测结果显示，WT组小鼠此时针对Click刺激的听力阈值为22~26 dB，与XKR8 KO组小鼠的听力阈值无明显差异，听力波形完整，无杂乱（图2A）。本研究还检测了关于纯音8、16、24、32 kHz所刺激的听力阈值，检测结果提示XKR8 KO组小鼠和WT组小鼠的听力阈值在噪声暴露前无明显差异（P>0.05）（图2B）。以上结果表明，在噪声暴露前，XKR8 KO组和WT组小鼠的ABR测听阈值之间无明显差异。

2.3 WT组和XKR8 KO组噪声暴露前的OHC

对WT组和XKR8 KO组进行ABR测听，结束后处死小鼠并取小鼠耳蜗，将耳蜗分为顶回（Apex）、中回（Middle）和底回（Base）3个区域，并进行了免疫荧光染色（图3）。免疫荧光染色结果显示，在噪声暴露前，WT组和XKR8组小鼠的Apex、Middle、Base各个区域的OHC排列整齐，无核固缩、核破裂等；进行统计分析后显示，WT组小鼠和XKR8 KO组小鼠的OHC数无明显丢失（图3、4），2组无明显差异（P>0.05）。

2.4 WT组和XKR8 KO组小鼠噪声暴露后的听力阈值情况

WT‑110 dB组和XKR8‑110 dB组连续暴露于110 dB、音源为8~20 kHz的白噪声2 h，噪声暴露结束后，分别在噪声暴露后1、3、7、14 d对WT、XKR8、WT‑110 dB组和XKR8‑110 dB组小鼠进行了ABR听力测定（图5、6）。在噪声暴露后的第1天，XKR8‑110 dB组和WT‑110 dB组小鼠click和纯音的听力阈值提高至85 dB左右（图6），这表明噪声造模良好。而在第3天时，XKR8‑110 dB小鼠的Click及8、16、24 kHz听力阈值低于WT‑110 dB小鼠（图6），差异具有统计学意义（P<0.05）。噪声暴露后第7天时，XKR8‑110 dB组和WT‑110 dB组在24 kHz差异无统计学意义，在其余的Click及8、16、32 kHz频率，XKR8‑110 dB组的听力阈值低于WT‑110 dB组（图6），差异具有统计学意义（P<0.05）。在噪声暴露后第14天，XKR8‑110 dB组和WT‑110 dB组小鼠的听力阈值有下降且趋于稳定，且XKR8‑110 dB组小鼠的听力阈值低于WT‑110 dB组小鼠（图6）。与XKR8‑110 dB组小鼠相比，WT‑110 dB组小鼠的波形紊乱（图5）。这些结果表明在噪声暴露后，与 WT组小鼠相比，XKR8 KO组小鼠听力损失更轻，对听力保护作用更明显。

2.5 XKR8 KO小鼠在噪声暴露后可以保护OHC的丢失

在噪声暴露后第14天，进行了ABR测听，并处死了小鼠。耳蜗Apex、Middle和Base 3个区域进行了免疫荧光染色（图7）。统计分析显示，噪声暴露后第14天时，在顶端区域，WT和XKR8 KO小鼠的 OHC丢失率没有明显差异（图8A）。然而，在中部和底部区域，WT小鼠的丢失率明显更高（图8B、C）。这些结果表明，在噪声暴露后，XKR8 KO小鼠可以减少OHC的丢失。

3 讨论

NIH是一种全球常见的耳鼻喉疾病，影响着大部分人群^［3］。它由急性或慢性暴露于过度噪声引起，导致TTS或PTS ^［9‑12］。NIHL的病理生理学涉及复杂的机制，其中线粒体功能障碍和氧化应激是耳蜗损伤和听力损失发展的关键因素^［17］。XKR8基因编码凋亡过程中PS外化的 scramblase 蛋白XKR8，这种蛋白在凋亡细胞的吞噬和成肌细胞分化的调节中起着关键作用^［4，5］。本团队曾研究确定XKR8是AN的潜在致病因素，这是一种保留完整的OHC功能但神经传导受损为特征的听力损失形式^［3］。在NIHL中，小鼠耳蜗OHC不可逆死亡存在许多病理机制，对在噪声暴露时，如何保护OHC的功能和少量丢失比较重要。许多研究表明，在敲除某个基因后，听觉系统会受到损害，表现出类似AN和前庭功能障碍的表型，这些是沿听觉通路的损害。此外，这些基因敲除小鼠在噪声暴露后与WT小鼠相比，都显示出对OHC和IHC突触细胞的保护作用^［9，10］。敲除Cochlin基因后，其小鼠会出现迟发型的听力损伤和前庭功能受损，但是其内耳OHC和IHC突触细胞与WT小鼠相比并无差异^［6］。本研究进一步分析了暴露噪声的情况下，噪声对小鼠耳蜗OHC的作用机制。

WT小鼠和XKR8 KO小鼠在噪声暴露后相较于未暴露噪声的XKR8 KO组小鼠和WT组小鼠，其听力阈值出现明显升高，在噪声暴露后第一天达到85 dB左右。与未进行噪声暴露的XKR8 KO组和WT组小鼠相比，噪声暴露的XKR8‑110dB组和WT‑110 dB组的ABR波形杂乱，且Ⅰ波无法测出。而在噪声暴露后的3、7、14 d分别进行ABR测听，结果提示XKR8‑110dB组小鼠和WT‑110dB组小鼠的听力阈值逐渐下降，而XKR8‑110dB组的听力阈值要较WT‑110 dB组低，到第14天时，听力变化趋于稳定，ABR测听结果提示XKR8‑110 dB组的听力阈值低于WT‑110 dB组，差异具有统计学意义（P<0.05）。这些结果表明在噪声暴露后，XKR8 KO组小鼠的听力水平较WT组小鼠好，可以保护由噪声诱导的听力损伤。

OHC相当于一个放大器也是一个效应器，在噪声暴露后最开始是先 OHC损伤和丢失^{［18‑22］}，进而导致整个听觉传导系统受损，导致耳蜗内不可逆的病理损伤，最后导致听力下降^{［10，11］}。这些细胞的死亡是不可逆的，其也是导致不可逆听力下降的病理机制^{［23，24］}。为了更好地了解噪声暴露后听力损伤的机制，本研究进行耳蜗基底膜的解剖铺片和免疫荧光染色，分别进行OHC染色和IHC突触细胞的染色。在噪声暴露后第14天时进行ABR测听后，将小鼠处死进行耳蜗解剖和免疫荧光染色，将耳蜗OHC铺片根据不同的听力频率分成3个区域，分别为对应低频听力的Apex、中频频率的Middle和高频频率的Base。结果提示，相比于未进行噪声暴露的WT组和XKR8组，噪声暴露后的XKR8‑110 dB组和WT‑110 dB组在Middle的后半段和Base 的OHC形态变得固缩、核破裂，并且OHC数量减少，具有统计学意义（P<0.05）；而XKR8‑110 dB组和WT‑110 dB组在Apex和Middle的前半段与未暴露噪声组相比差异无统计学意义（P>0.05）。在噪声暴露后，XKR8‑110 dB组在Middle的后半段和Base的OHC数丢失少于WT‑110 dB组，且XKR8‑110 dB组的OHC排列整齐，具有统计学意义（P<0.05）。

本研究显示，在噪声暴露后，XKR8 KO小鼠的听力水平优于WT小鼠，减轻了由噪声诱导的听力损伤。免疫荧光染色结果显示，XKR8 KO组小鼠的OHC的丢失少于WT组小鼠，减轻了由噪声诱导的OHC损伤。

作者贡献度说明：

许禄华：负责整个实验过程，组织和分析实验数据以及制作图表；范君琪、周浩和周志汉：制作图表；范君琪：负责润色论文；祝园平：审阅论文；吴满满：检查图像完整性；廖康：确保数据完整性；姜鸿彦：指导实验过程和整体方向，审阅论文。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

海南省自然科学基金(823RC558)

海南省重大科技项目(ZDKJ2021040)