益肺宣肺降浊方调节STAT5/RIPK3/MLKL通路干预VaD坏死性凋亡的实验研究

Mechanistic study of Yifei Xuanfei Jiangzhuo Formula in modulating the STAT5/RIPK3/MLKL pathway to intervene in VaD⁃Related necroptosis

摘要

目的 以STAT5/RIPK3/MLKL通路为切入点，探讨阐明益肺宣肺降浊方对血管性痴呆（vascular dementia，VaD）模型大鼠坏死性凋亡的影响及其作用机制。 方法 选取50只SD雄性大鼠，其中40只采用双侧颈总动脉永久性结扎（2VO）法建立VaD模型，将大鼠随机分为模型组和益肺宣肺降浊方低剂量组、高剂量组及盐酸多奈哌齐组，另选取10只大鼠作为假手术组（SHAM组）。采用Morris水迷宫实验检测评估大鼠学习记忆行为；H&E染色和尼氏染色分析大鼠海马组织病理形态；免疫荧光染色法观察各组大鼠海马组织STAT5、p⁃RIPK3阳性表达；ELISA法检测各组大鼠血清中IL⁃10、TNF⁃α因子水平；Real⁃time PCR检测STAT5、FADD、iNOS和HO⁃1 mRNA水平；Western blot检测海马组织STAT5、p⁃RIPK3/RIPK3、p⁃MLKL/MLKL、FADD蛋白表达。 结果 与假手术组相比，模型组大鼠海马组织呈现明显病理学改变，其逃避潜伏期明显延长（P<0.05），穿越平台的次数明显减少（P<0.05），提示大鼠空间学习记忆功能受损；大鼠血清中TNF⁃α水平升高，IL⁃10水平下降；海马组织中STAT5、p⁃RIPK3阳性表达量升高；海马组织中STAT5、FADD、iNOS和HO⁃1 mRNA表达升高，且STAT5、p⁃RIPK3/RIPK3、p⁃MLKL/MLKL、FADD蛋白表达量增加。与模型组相比，益肺宣肺降浊方明显减轻了VaD大鼠海马组织损伤并改善其学习记忆能力，调节血清中IL⁃10、TNF⁃α因子水平，降低海马组织中STAT5、FADD、iNOS、HO⁃1mRNA水平和STAT5、p⁃RIPK3阳性表达量，抑制STAT5、p⁃RIPK3/RIPK3、p⁃MLKL/MLKL、FADD蛋白表达（P<0.05）。 结论 益肺宣肺降浊方通过抑制VaD大鼠坏死性凋亡途径减轻其病理表现和炎症反应，从而改善其记忆学习能力。

Abstract

Objective To investigate the effect and mechanism of Yifei Xuanfei Jiangzhuo Formula on necrotic apoptosis in vascular dementia （VaD） model rats， this study takes the STAT5/RIPK3/MLKL pathway as the starting point. Methods In this study， 50 male SD rats were selected， of which 40 were established using the bilateral common carotid artery permanent ligation （2⁃VO） method. They were randomly divided into a model group， a low⁃dose group of YifeiXuanfeiJiangzhuo Formula， a high⁃dose group， and a donepezil hydrochloride group. Additionally， 10 SHAM group rats were also included. Using Morris water maze test to evaluate the learning and memory behavior of rats； H&E staining and Nissl staining were used to analyze the pathological morphology of rat hippocampal tissue； Immunofluorescence staining was used to observe the positive expression of STAT5 and p⁃RIPK3 in the hippocampal tissues of rats in each group； ELISA method was used to detect the levels of IL⁃10 and TNF ⁃ α factors in the serum of rats in each group； Real time PCR was used to detect the mRNA levels of STAT5， FADD， iNOS， and HO⁃1； Western blot was used to detect the expression of STAT5， p⁃RIPK3/RIPK3， p⁃MLKL/MLKL， and FADD proteins in hippocampal tissue. Results Compared to the SHAM group， the hippocampal tissue of the model group rats showed significant pathological changes， with significantly prolonged escape latency （P<0.05） and significantly reduced platform crossing times （P<0.05）， indicating impaired spatial learning and memory function. The level of TNF ⁃ α in rat serum increased while the level of IL⁃10 decreased； The positive expression levels of STAT5 and p⁃RIPK3 increased in hippocampal tissue； The mRNA expression of STAT5， FADD， iNOS， and HO⁃1 increased in hippocampal tissue. The protein expression levels of STAT5， p⁃RIPK3/RIPK3， p⁃MLKL/MLKL， and FADD also increased in hippocampal tissue. Compared to the model group， the YifeiXuanfeiJiangzhuo Formula significantly reduced hippocampal tissue damage and improved learning and memory abilities in VaD rats. It regulated the levels of IL⁃10 and TNF ⁃ α factors in serum， reduced the mRNA levels of STAT5， FADD， iNOS， and HO⁃1， as well as the positive expression levels of STAT5 and p⁃RIPK3 in hippocampal tissue， and inhibited the protein expression of STAT5， p⁃RIPK3/RIPK3， p⁃MLKL/MLKL， and FADD （P<0.05）. Conclusion YifeiXuanfeiJiangzhuo Formula alleviates the pathological manifestations and inflammatory response of VaD rats by inhibiting the necrotic apoptosis pathway， thereby improving their memory and learning abilities.

Graphical abstract

关键词

血管性痴呆 / 益肺宣肺降浊方 / STAT5/RIPK3/MLKL通路 / 坏死性凋亡

Key words

Vascular dementia / Yifei Xuanfei Jiangzhuo Formula / STAT5/RIPK3/MLKL pathway / Necroptosis

血管性痴呆（vascular dementia，VaD）是由脑血管损伤引起的一种认知功能障碍，表现为进行性的学习记忆能力及日常生活能力下降，是继阿尔茨海默病之后的第二大痴呆类型^［1］。据最新调查，我国约有392万人受VaD影响^［2］。VaD的具体发病机制尚不明确，但研究表明炎症反应、胆碱能神经损伤和氧化应激等在VaD的发生、发展中起着重要作用^［3］。目前，VaD的主要治疗方法包括胆碱酯酶抑制剂和NMDA拮抗剂，这些药物虽然能在一定程度上改善轻度VaD患者的认知障碍，但对于日常生活能力的提升效果有限，并伴有一定程度不良反应^［4，5］。中医药治疗VaD逐渐成为研究热点，课题组前期研究发现，益肺宣肺降浊方能够有效改善VaD患者的认知功能与日常生活能力^［6］，但该方具体作用机制仍有待深入探究。

近年研究揭示了坏死性凋亡在VaD中的重要角色，坏死性凋亡在VaD中被激活，并加剧神经元损失和认知功能下降^［7］。RIPK3/MLKL通路作为坏死性凋亡的经典路径^［8］，可受STAT家族成员如STAT5的调节，影响免疫细胞活性，进而影响坏死性凋亡的过程^［9，10］。且STAT5的高表达与VaD患者的神经元损伤和认知功能下降密切相关^［11］。因此，调控STAT5/RIPK3/MLKL通路可能为干预VaD提供新的策略。

本研究旨在评估益肺宣肺降浊方对VaD的疗效及其潜在机制，特别是通过调节STAT5/RIPK3/MLKL通路来减轻坏死性凋亡的影响，以期为VaD的治疗提供更有效的解决方案。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究选用50只8周龄SPF级SD雄性大鼠体重（280±20） g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供［许可证号：SCXK（湘）2019⁃0004］。实验动物饲养于广西中医药大学实验动物中心SPF级屏障环境［使用许可证号：SYXK（桂）2024⁃0004］，在恒温（24±1） ℃、12 h光/暗循环条件下进行标准化饲养，符合国家SPF级实验动物环境标准。实验方案经广西中医药大学动物实验伦理委员会审批通过（伦理批号：DW20220212⁃062⁃07），所有操作严格遵循实验动物福利伦理规范。

1.2 主要药品及实验试剂

益肺宣肺降浊方（组成：黄芪15 g，人参15 g，麦冬15 g，桔梗10 g，苦杏仁10 g，三七粉15 g，苏子15 g，石菖蒲15 g，酒大黄6 g）由广西中医药大学第一附属医院提供提供。盐酸多奈哌齐片5 mg/片，研磨溶于110 mL蒸馏水，0.045 mg/mL溶液［卫材（中国药业有限公司），国药批准字号：H20050978，生产批号2203026］。

实验所用苏木精（BA⁃4041）、伊红（BA⁃4024）及甲苯胺蓝（BA⁃4373）染色剂购自珠海贝索生物技术有限公司；RIPA组织裂解液（R0020）由北京索莱宝科技有限公司提供。SDS⁃PAGE快速凝胶制备试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、脱脂牛奶粉、超灵敏化学发光液（ECL）购自上海雅酶生物医药科技有限公司；PVDF膜购自Millipore（货号：IPVH00010）；RT逆转录试剂盒购自莫纳生物（货号：Cat#MQ00401S）；Trizol、氯仿、异丙醇及无水乙醇购自天津永大化学试剂有限公司。肿瘤坏死因子⁃α（TNF⁃α）和白细胞介素⁃10（IL⁃10）检测采用酶联免疫吸附法（ELISA），试剂盒购自江苏酶免实业有限公司（产品编号：MM⁃0180R2，MM⁃0195R2）。STAT5抗体购自美国CST（货号：#94205）；RIPK3抗体购自苏州博奥龙科技有限公司，MLKL、FADD抗体购自武汉爱博泰克科技有限公司（批号分别为：A21894、A26418DM），p⁃RIPK3、p⁃MLKL抗体购自杭州华安生物技术有限公司（货号分别为：HA721428、ET1705⁃51），GAPDH一抗（60004⁃1⁃Ig）及辣根过氧化物酶标记的二抗（山羊抗兔SA00001⁃2、山羊抗鼠SA00001⁃1）购自武汉三鹰生物技术有限公司。实时荧光定量PCR试剂盒（Q712）、RNA提取试剂（R701⁃01）和逆转录试剂盒（R123⁃01）由南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供。实验所需PCR引物由南宁捷尼斯生物科技有限公司完成设计与合成。

1.3 仪器

XR⁃XM101型Morris 水迷宫（上海欣软公司）、CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国BioRad公司）、BX43型光学显微镜、UC90型成像系统（日本Olympus公司）、电泳仪（DYY⁃4C）及凝胶成像系统（北京六一公司）等。

1.4 实验方法

1.4.1 造模、分组与给药

采用双侧颈总动脉永久性结扎法（2VO）建立VaD大鼠模型。大鼠经异氟烷麻醉后，行颈部正中切口，分离并结扎双侧颈总动脉。假手术组仅进行血管分离操作。50只SD大鼠随机分为假手术（SHAM，n=10）组和手术组（n=40）。术后将手术组大鼠随机分为模型（MOD）组和益肺宣肺降浊方低剂量组（YFXF⁃L，6.09 g‧kg^⁃1‧d^⁃1）、高剂量组（YFXF⁃H，24.36 g‧kg^⁃1‧d^⁃1）及盐酸多奈哌齐（DH，0.2 g‧kg^⁃1‧d^⁃1）组，每组10只。药物干预持续30 d，其中MOD组和SHAM组给予等体积生理盐水（10 mL‧kg^⁃1‧d^⁃1）。给药剂量依据临床等效剂量换算确定。

1.4.2 水迷宫实验

药物干预结束后，运用Morris水迷宫实验评估大鼠空间认知功能。实验每只大鼠连续进行5 d，将水迷宫划分为4个象限，平台置于第2象限，注水没过平台约3 cm。前5 d进行定位航行实验，分别将大鼠从4个象限放入，大鼠找到平台则停止实验，记录大鼠的逃避潜伏期，若大鼠60 s内未找到平台，则引导它们至平台并停留1 min后取出。实验第6天实施空间探索测试，移除平台后记录各组大鼠60 s内平台穿越频次及目标象限停留时间占比。

1.4.3 标本制备

水迷宫行为学测试完成后，大鼠经20%乌拉坦麻醉后处死。随机选取各组3只大鼠，分离其大脑皮层及海马组织，置于-80 ℃超低温冰箱保存，用于蛋白质印迹（WB）及实时荧光定量PCR（qPCR）检测。另取各组3只大鼠，经心脏灌注固定后取脑组织，采用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，分别进行苏木精⁃伊红（H&E）染色和甲苯胺蓝（Nissl）染色。所有样本保存于4 ℃环境备用。

1.4.4 H&E染色

取1.4.3项制备的石蜡切片（5 μm），经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，进行H&E染色，于光学显微镜下观察并采集大脑皮层组织病理学图像。

1.4.5 Western blot分析通路相关蛋白表达

取各组冻存海马组织，经低温匀浆后，采用RIPA裂解液进行蛋白提取，离心取上清，BCA法测定蛋白浓度并进行热变性处理。制备蛋白上样样品，蛋白质样品（10 μg）进行SDS⁃PAGE电泳分离，将分离的蛋白质转移到PVDF膜，并在室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h，将PVDF膜与不同浓度的一抗（抗GAPDH 1∶50 000、抗STAT5 1∶1 000、抗RIPK3 1∶1 000、抗p⁃RIPK3 1∶1 000、抗p⁃MLKL 1∶1 000、抗MLKL 1∶500、抗FADD 1∶4 500）在4 ℃条件下进行一抗孵育过夜后，与稀释度为1∶10 000的二抗在室温摇床中孵育2 h。经TBST缓冲液洗涤后，使用化学发光显影系统进行蛋白条带成像，并通过ImageJ图像分析软件对条带灰度值进行定量分析。

1.4.6 PCR基因水平检测

取各组大鼠冻存的大脑海马组织适量，用Trizol通用试剂裂解大鼠脑组织，用异丙醇沉淀氯仿，加入75%乙醇纯化得到总RNA，分析纯度与浓度后，将总RNA逆转录合成cDNA并进行PCR扩增。见表1。

1.4.7 ELISA检测炎性因子水平

按照ELISA试剂盒说明书步骤操作，采用酶标仪于450 nm波长处依次测定实验孔吸光度A，通过标准曲线计算样本血清TNF⁃α、IL⁃10水平。

1.4.8 免疫荧光化学染色检测

免疫荧光化学染色检测海马组织中STAT5、p⁃RIPK3阳性表达。海马组织石蜡切片同H&E染色。组织切片脱水、漂洗、封闭后与抗STAT5、p⁃RIPK3体孵育过夜。再使用二抗进行孵育，接着用DAPI染色细胞核，室温下孵育5~10 min，以标记核位置。对样本进行封片，使用显微镜观察和成像。

1.5 统计学处理

采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。计量资料以\overline{x}\pm s表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐性时选用LSD检验，方差不齐时采用Games⁃Howell检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 益肺宣肺降浊方改善VaD大鼠学习及空间记忆能力

2VO术后，水迷宫实验结果显示，逃避潜伏期：与SHAM组比较，其余组大鼠逃避潜伏期延长，表明VaD大鼠的学习能力下降。与SHAM组对比，MOD组逃避潜伏期明显延长（P<0.01）；与MOD组相比，YFXF⁃L组、YFXF⁃H组、DH组逃避潜伏期明显缩短（P<0.05），表明用药对VaD大鼠学习缺陷具有明显保护作用；与YFXF⁃L组对比，YFXF⁃H组和DH组逃避潜伏期缩短明显，见图1。同时评估了大鼠的空间记忆能力，与SHAM组相比，MOD组大鼠准确穿越次数明显缩短，表明VaD模型大鼠空间记忆功能受损；与MOD组比较，YFXF⁃L组、YFXF⁃H组和DH组平台穿越次数呈剂量依赖性增加（P<0.05）。与YFXF⁃L组对比，YFXF⁃H组和DH组穿越平台的次数增加明显，且效果类似，见图1、2。表明益肺宣肺降浊方对VaD大鼠空间记忆障碍有明显改善作用。

2.2 益肺宣肺降浊方改善VaD大鼠海马神经元损伤

VaD可诱导神经元形态学改变和功能障碍，神经元损伤是脑缺血的关键病变。因此进一步研究了益肺宣肺降浊方对VaD大鼠海马结构及神经元损伤的影响。结果显示：SHAM组大鼠海马结构完整，CA1区锥体细胞层（蓝色箭头）排列规整，细胞核形态正常，染色均匀，未见明显细胞凋亡及炎性浸润，见图3A。MOD组大鼠海马组织损伤明显，CA1区结构紊乱，锥体细胞呈现广泛坏死。细胞排列紊乱、染色不均，细胞之间间隙较大；大量神经元凋亡，固缩，深染（黄色箭头），见图3B。与MOD组相比，各用药组有改善VaD大鼠海马损伤的效果，且呈现一定的量效关系，其中YFXF⁃L组大鼠海马CA1区组织损伤程度较模型组有所改善，表现为细胞间隙缩小，但仍可见大量神经元呈现固缩深染现象（黄色箭头）；部分锥体细胞（蓝色箭头）排列相对整齐，细胞核形态正常，染色均匀（图3C）。与MOD组相比，YFXF⁃H组和DH组海马组织损伤明显减轻，两组治疗效果相当，其中CA1区锥体细胞（蓝色箭头）排列较为整齐，细胞核形态完整，仅见少量神经元固缩深染（黄色箭头），见图3D、E。

尼氏染色分析大鼠脑组织神经元活性，结果显示：SHAM组大鼠海马神经元胞体大小均匀，形态完整，排列整齐，尼氏体呈紫色，细胞核呈蓝色，见图4A；与SHAM组对比，MOD组大鼠海马脑组织神经元胞体萎缩、形态不完整，形状不一，排列紊乱不齐，大部分坏死溶解；尼氏体数量明显减少，细胞核明显破坏，见图4B；与MOD组相比，各用药组有改善VaD大鼠海马神经元损伤的效果，且呈现一定的量效关系，其中YFXF⁃L组大鼠脑组织神经元损伤有所减轻，可见部分完整神经元，尼氏体数量上升，见图4C；与MOD组相比，YFXF⁃H组大鼠及DH组大脑神经元损伤明显减轻，神经元胞体完整，形态规整，排列整齐，尼氏体明显增多，且损伤恢复水平基本一致，治疗效果最佳，见图4D、E。

2.3 益肺宣肺降浊方对VaD大鼠海马组织STAT5、p⁃RIPK3水平的影响

同时进行免疫荧光测定VaD大鼠海马组织STAT5、p⁃RIPK3表达，结果可见，与SHAM组相比，MOD组大鼠海马组织STAT5、p⁃RIPK3蛋白核荧光强度表达明显增加（P<0.05），与MOD组相比，YFXF⁃L组、YFXF⁃H组、DH组海马组织STAT5、p⁃RIPK3蛋白核荧光强度表达明显减少（P<0.05），且与益肺宣肺降浊方浓度呈现一定的量效关系，见图5。与YFXF⁃L组相比，YFXF⁃H组大鼠及DH组大鼠海马组织STAT5、p⁃RIPK3蛋白核荧光强度表达明显减少，且治疗效果接近，见图5~7。

2.4 益肺宣肺降浊方改善VaD大鼠海马组织IL⁃10、TNF⁃α相对表达量

ELISA实验结果显示，与SHAM组相比，MOD组IL⁃10抗炎因子相对表达量明显降低（P<0.05）；与MOD组相比，YFXF⁃L组、YFXF⁃H组及DH组IL⁃10抗炎因子相对表达量明显升高（P<0.05），并且与益肺宣肺降浊方浓度呈一定量效关，表明益肺宣肺降浊方有效逆转了抗炎因子的下降；与YFXF⁃L组相比，YFXF⁃H组及DH组IL⁃10抗炎因子相对表达量明显升高，且效果接近，见图8。而与SHAM组相比，MOD组TNF⁃α促炎因子相对表达量明显升高；与MOD组相比，YFXF⁃L组、YFXF⁃H组及DH组TNF⁃α促炎因子相对表达量明显降低，与YFXF⁃L组相比，YFXF⁃H组及DH组TNF⁃α促炎因子相对表达量明显降低，且治疗效果接近，见图8。

2.5 益肺宣肺降浊方改善大鼠海马组织STAT5、FADD、iNOS、HO⁃1 mRNA表达量

PCR结果显示：与SHAM组相比，模型组STAT5、FADD、iNOS、HO⁃1mRNA相对表达量明显上升（P<0.05），而与MOD组相比，YFXF⁃L组、YFXF⁃H组及DH组STAT5、FADD、iNOS、HO⁃1mRNA相对表达量明显降低（P<0.05），且与中药浓度呈现一定的量效关系。与YFXF⁃L组对比，YFXF⁃H组及DH组STAT5、FADD、iNOS、HO⁃1mRNA相对表达量明显降低，且疗效接近，见图9。

2.6 益肺宣肺降浊方改善VaD大鼠脑组织STAT5/RIPK3/MLKL信号通路的影响

为了验证VaD大鼠脑组织中STAT5/RIPK3/MLKL通路蛋白表达情况，进行Western blot实验，结果显示，与SHAM组相比，MOD组STAT5、p⁃RIPK3/RIPK3、p⁃MLKL/MLKL、FADD蛋白表达量明显增加（P<0.05），而与MOD组对比，YFXF⁃L组、YFXF⁃H组及DH组STAT5、p⁃RIPK3/RIPK3、p⁃MLKL/MLKL、FADD蛋白表达量明显降低（P<0.05），并与中药浓度呈现一定的量效关系。与YFXF⁃L组对比，YFXF⁃H组及DH组STAT5、p⁃RIPK3/RIPK3、p⁃MLKL/MLKL、FADD蛋白表达量明显减少，疗效最佳，表明益肺宣肺降浊方能明显抑制VaD大鼠中STAT5/RIPK3/MLKL通路激活，见图10、11。

3 讨论

VaD是与年龄相关的神经退行性疾病，受到多种神经细胞凋亡以及神经炎症的调控^［12］。坏死性凋亡（Necroptosis）是一种炎症有关的程序性细胞死亡形式，通常由死亡受体（如TNF受体）的激活引发，通过RIPK1、RIPK3以及混合谱系激酶结构域类似物（MLKL）相互作用来执行。其中RIPK3的磷酸化激活是启动坏死性凋亡的关键步骤，随后，MLKL被磷酸化并发生构象变化，移位到细胞膜上，形成离子通道或多聚体结构，导致细胞膜通透性增加，细胞内容物外泄，最终引发细胞的裂解和死亡^［13］。

坏死性凋亡已成为细胞生物学和医学研究中的一个重要领域，在疾病中的作用已被广泛报道。研究表明，坏死性凋亡在VaD中扮演重要角色，RIPK3和下游效应物MLKL介导的坏死性凋亡会引起血液供应受损和炎症状态进而导致VaD，而神经炎症反应可能通过抑制Bcl⁃2和诱导P53的表达从而也启动坏死性凋亡，产生新生血管和神经元肥大进而加重VaD症状^［7］。STAT通过IFN信号通路激活ZBP1的表达，可影响MLKL介导的细胞死亡途径。研究表明，STAT通过上调ZBP1的表达，在RIPK1缺失的情况下，ZBP1与RIPK3形成复合物，增强RIPK3的活性，进而触发MLKL依赖的坏死性凋亡^［9］。STAT5作为STAT家族的一员，调节免疫细胞的活性和功能，这些细胞的活性变化可能影响泛凋亡和坏死性凋亡的过程^［10］，且STAT5的高表达与VaD神经元损伤和认知功能下降有关^［11］。因此STAT5、RIPK3和MLKL在VaD的发病机制中扮演着重要角色，针对这些分子的治疗策略可能为VaD的干预提供新的方向。

VaD属于中医“痴呆”的范畴，《灵枢·天年》有言：“肺气衰，魄离，故言善误”，说明了肺气衰减，不能涵养魄而魄离散，所以容易发生痴呆，言语易错。课题组认为，肺气虚损、肺脏功能失调在痴呆的发生、发展中起着重要的作用，治疗上需重视益肺气以补五脏之不足，复肺之宣降以消体内痰浊瘀血浊毒，并制定益肺宣肺降浊方进行治疗。前期临床研究表明，益肺宣肺降浊方治疗VaD疗效确切，可明显提高患者认知与行为能力^［6，14］。动物实验研究也发现VaD模型大鼠存在着神经性炎症，大鼠海马组织iNOS及HO⁃1水平明显升高^［15］。本研究通过2VO法建立VaD大鼠模型，较为系统地评估了益肺宣肺降浊方是否可以通过调控海马STAT5/RIPK3/MLKL轴抑制坏死性凋亡，调控神经炎症，对VaD起到防治作用。

本次实验结果可以看到，益肺宣肺降浊方能减轻VaD大鼠海马组织的病理形态学损伤，降低大鼠在水迷宫中的逃避潜伏期，增加穿越平台次数，增强学习记忆能力，改善VaD大鼠因血管损伤所导致的认知障碍。VaD模型组大鼠STAT5/RIPK3/MLKL信号通路明显激活，表现为STAT5、RIPK3及其磷酸化蛋白（p⁃RIPK3、p⁃MLKL）表达水平上调，同时伴随促炎因子TNF⁃α含量升高，提示神经炎症反应加剧。此外，Fas相关死亡域蛋白FADD是介导细胞坏死性凋亡的关键分子之一，可通过介导TNF⁃α诱导的RIPK1⁃RIP3激酶复合物形成，形成坏死小体（necrosome），促进坏死性凋亡信号传导^［16］，在促进缺血性神经系统疾病进展方面起关键作用^［17］。本研究结果发现，FADD蛋白及mRNA水平在MOD组中表达较高，在DH组及益肺宣肺降浊方各剂量组中表达降低。这表明益肺宣肺降浊抑制了VaD中神经元细胞坏死性凋亡。且研究表明，益肺宣肺降浊方中多种中药及其活性成分可以通过调控坏死性凋亡途径中的关键分子，黄芪、人参主要成分可以降低RIPK3、MLKL等相关分子的表达，对I/R损伤的神经保护作用与抑制坏死性凋亡有关^{［18，19］}。三七总皂苷干预RIP1⁃RIP3⁃MLKL信号通路，减轻脑微血管内皮细胞的坏死性凋亡^［20］。此外，麦冬、桔梗、大黄等主要成分参与可通过RIP3/MLKL通路抑制坏死性凋亡^{［21⁃23］}。

综上所述益肺宣肺降浊方可以通过抑制STAT5/RIPK3/MLKL通路，减少坏死性凋亡发生，调节炎症反应以改善VaD大鼠学习记忆能力。

作者贡献度说明：

符钰岚、朱小敏：构思设计实验并执行、文章撰写；卓桂锋、黄颖睿、张颖：数据收集处理分析；顾洋、曹薛源：数据核查；陈炜、吴林：文章修改审查。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

参考文献

[1] Iadecola C， Duering M， Hachinski V， et al. Vascular cognitive impairment and dementia： JACC scientific expert panel［J］. J Am Coll Cardiol， 2019，73（25）：3326⁃3344.

[2] Ren R， Qi J， Lin S， et al. The China alzheimer report 2022［J］. Gen Psychiatr， 2022，35（1）：e100751.

[3] Tournier BB， Sorce S， Marteyn A， et al. CCR5 deficiency： Decreased neuronal resilience to oxidative stress and increased risk of vascular dementia［J］. Alzheimers Dement， 2024，20（1）：124⁃135.

[4] 宋颢， 孙冬， 章军建. 《2019年中国血管性认知障碍诊治指南》解读［J］. 中国临床医生杂志， 2021，49（6）：655⁃657.

[5] Song H， Sun D， Zhang JJ.Interpretation of the 2019 guidelines for diagnosis and treatment of vascular cognitive impairment in China ［J］. Chin J Clin Physician， 2021， 49 （6）： 655⁃657.

[6] Rundek T， Tolea M， Ariko T， et al. Vascular cognitive impairment （VCI）［J］. Neurotherapeutics， 2022，19（1）：68⁃88.

[7] 黄晓丹. 益肺宣肺降浊方联合多奈哌齐治疗痰浊阻窍型血管性痴呆的临床研究［D］. 南宁：广西中医药大学， 2019.

[8] Huang XD.Clinical study on the combination of Yifei Xuanfei Jiangzhuo formula and donepezil in the treatment of vascular dementia with phlegm turbidity obstruction ［D］. Nanning： Guangxi University of Chinese Medicine， 2019.

[9] Belkhelfa M， Beder N， Mouhoub D， et al. The involvement of neuroinflammation and necroptosis in the hippocampus during vascular dementia［J］. J Neuroimmunol， 2018，320：48⁃57.

[10] Yuan J， Amin P， Ofengeim D. Necroptosis and RIPK1⁃mediated neuroinflammation in CNS diseases［J］. Nat Rev Neurosci， 2019，20（1）：19⁃33.

[11] Ingram JP， Thapa RJ， Fisher A， et al. ZBP1/DAI drives RIPK3⁃mediated cell death induced by IFNs in the absence of RIPK1［J］. J Immunol， 2019，203（5）：1348⁃1355.

[12] Zhuang L， Sun Q， Huang S， et al. A comprehensive analysis of PANoptosome to prognosis and immunotherapy response in pan⁃cancer［J］. Sci Rep， 2023，13（1）：3877.

[13] Du Y， He J， Xu Y， et al. SIRT6 prevent chronic cerebral hypoperfusion induced cognitive impairment by remodeling mitochondrial dynamics in a STAT5⁃PGAM5⁃Drp1 dependent manner［J］. J Transl Med， 2024，22（1）：788.

[14] 丁瑞丛， 王峰， 徐晓玉， 等. 涤痰汤加味方对血管性痴呆认知功能、相关炎性指标的改善及影响［J］. 中华中医药学刊， 2024，42（7）：96⁃100.

[15] Ding RC， Wang F， Xu XY，et al.Improvement and effect of Ditan decoction on cognitive function and related inflammatory indicators in vascular dementia ［J］. Chin J Tradit Chin Med， 2024，42（7）：96⁃100.

[16] Seo J， Nam YW， Kim S， et al. Necroptosis molecular mechanisms： Recent findings regarding novel necroptosis regulators［J］. Exp Mol Med， 2021，53（6）：1007⁃1017.

[17] 唐农， 胡跃强， 吴林， 等. 益肺宣肺降浊胶囊治疗血管性痴呆患者107例临床观察［J］. 中医杂志， 2014，55（12）：1025⁃1028.

[18] Tang N， Hu YQ， Wu L， et al.Clinical observation on the treatment of 107 patients with vascular dementia with Yifei Xuanfei Jiangzhuo capsules ［J］. J Tradit Chin Med， 2014，55（12）：1025⁃1028.

[19] 黄立武， 陈妃， 雷裕军， 等. 益肺宣肺降浊方对血管性痴呆大鼠脑内iNOS及HO⁃1的影响［J］. 辽宁中医杂志， 2016，43（12）：2642⁃2644.

[20] Huang LW， Chen F， Lei YJ，et al.The effect of Yifei Xuanfei Jiangzhuo formula on iNOS and HO⁃1 in the brain of vascular dementia rats ［J］. Liaoning J Tradit Chin Med， 2016，43（12）：2642⁃2644.

[21] Irrinki KM， Mallilankaraman K， Thapa RJ， et al. Requirement of FADD， NEMO， and BAX/BAK for aberrant mitochondrial function in tumor necrosis factor alpha⁃induced necrosis［J］. Mol Cell Biol， 2011，31（18）：3745⁃3758.

[22] 蔡昱哲， 李定祥， 刘艺璇， 等. 左归降糖通脉方对2型糖尿病合并脑梗死大鼠坏死性凋亡通路的影响［J］. 中成药， 2024，46（9）：2936⁃2942.

[23] Cai YZ， Li DX， Liu YX，et al.Effect of Zuogui Jiangtang Tongmai recipe on necrotic apoptosis pathway in type 2 diabetes rats with cerebral infarction ［J］. Tradit Chin Patent Med Simple Preparat， 2024，46（9）：2936⁃2942.

[24] Tang B， She X， Deng CQ. Effect of the combination of astragaloside Ⅳ and panax notoginseng saponins on pyroptosis and necroptosis in rat models of cerebral ischemia⁃reperfusion［J］. Exp Ther Med， 2021，22（4）：1123.

[25] 姜明春， 孙丽霞， 李大伟， 等. 基于RIP1/RIP3/MLKL介导程序性坏死通路探讨人参皂苷Rb1拮抗LPS诱导的黑质多巴胺神经元损伤机制［J］. 现代中西医结合杂志， 2024，33（16）：2191⁃2200.

[26] Jiang MC， Sun LX， Li DW， et al.Exploring the mechanism of ginsenoside Rb1 antagonizing LPS induced damage to substantia nigra dopamine neurons based on RIP1/RIP3/MLKL mediated programmed necrosis pathway ［J］. J Mod Chin West Med， 2024，33（16）：2191⁃2200.

[27] 胡艳红. 基于RIP1⁃RIP3⁃MLKL信号通路探讨三七总皂苷对拟缺血再灌注脑微血管内皮细胞Necroptosis的干预作用［D］.北京： 北京中医药大学， 2017.

[28] Hu YH.Exploring the intervention effect of total saponins of panax notoginseng on Necroptosis of cerebral microvascular endothelial cells during ischemia⁃reperfusion injury based on the RIP1⁃RIP3⁃MLKL signaling pathway ［D］.Beijing： Beijing Univ Traditional Chin Med，2017.

[29] 王佳佳， 卢宗亮， 孔亚， 等. 麦冬皂苷D′通过RIP1/MLKL诱导前列腺癌PC3细胞程序性坏死［J］. 第三军医大学学报， 2017，39（03）：201⁃207.

[30] Wang JJ， Lu ZL， Kong Y， et al.Ophiopogon japonicus saponin D 'induces programmed necrosis of prostate cancer PC3 cells through RIP1/MLKL ［J］. J Third Military Med Univ， 2017，39（3）：201⁃207.

[31] 宋伟， 王佳佳， 王贺， 等. 桔梗皂苷D通过FOXO3a通路介导前列腺癌PC⁃3细胞程序性坏死［J］. 肿瘤， 2018，38（2）：85⁃93.

[32] Song W， Wang JJ， Wang H，et al.Platycodon grandiflorum saponin D mediates programmed necrosis of prostate cancer PC⁃3 cells through the FOXO3a pathway［J］.Tumor，2018，38（2）：85⁃93.

[33] 高磊. 大黄素介导RIP3⁃MLKL复合体抑制重症急性胰腺炎胰腺腺泡细胞程序性坏死的研究［D］. 上海：上海中医药大学， 2019.

[34] Gao L.Study on the inhibition of pancreatic acinar cell programmed necrosis in severe acute pancreatitis by RIP3⁃MLKL complex mediated by emodin ［D］. Shanghai：Shanghai University Traditional Chinese Medicine，2019.

基金资助

国家自然科学基金(82374387)

国家自然科学基金(82160885)

广西自然科学基金(2024JJA141356)

广西中医药重点学科建设项目(GZXK⁃Z⁃20⁃13)

广西中医药大学“岐黄工程”高层次人才培育项目(202410)