吡非尼酮对三阴性乳腺癌4T1细胞增殖、迁移和侵袭影响的机制研究

Effects of pirfenidone on the proliferation, migration, and invasion of triple‑negative breast cancer 4T1 cells

摘要

目的 探究吡非尼酮（pirfenidone，PFD）对三阴性乳腺癌4T1细胞增殖、迁移和侵袭能力影响的机制。 方法 培养三阴性乳腺癌4T1细胞株，将不同浓度PFD（2、4、6、8 mmol/L）处理4T1细胞作为药物处理组，未加PFD的处理4T1细胞为对照组。Western blot检测芳胺N‑乙酰转移酶1（arylamine N‑acetyltransferase 1，NAT1）蛋白的表达；CCK‑8实验和克隆形成实验检测PFD对4T1细胞增殖能力的影响；划痕实验和Transwell迁移实验检测PFD对4T1细胞迁移能力的影响；Transwell侵袭实验检测PFD对4T1细胞侵袭能力的影响；分子对接验证PFD与NAT1之间的相互作用。 结果 与对照组相比，PFD在8 mmol/L浓度时明显抑制NAT1蛋白的表达（P<0.000 1）；与对照组相比，经2、4、6、8 mmol/L PFD处理的4T1细胞增殖、迁移、侵袭能力逐渐减弱，具有浓度依赖性；其中，PFD浓度为8 mmol/L时明显抑制了4T1细胞的增殖、迁移与侵袭能力（P<0.001）；此外，分子对接显示，PFD与NAT1之间存在氢键及疏水相互作用。 结论 8 mmol/LPFD通过抑制NAT1蛋白表达降低三阴性乳腺癌4T1细胞增殖、迁移和侵袭能力。

Abstract

Objective To explore the effects of of pirfenidone （PFD）on the proliferation， migration， and invasion abilities of triple‑negative breast cancer 4T1 cells and its mechanisms. Methods The triple‑negative breast cancer 4T1 cell line was cultured. The 4T1 cells treated with different concentrations of PFD （2， 4， 6， and 8 mmol/L） were taken as the drug treatment group， and the 4T1 cells not treated with PFD were taken as the control group. The expression of arylamine N‑acetyltransferase 1 （NAT1） protein was detected by Western blot. The effect of PFD on 4T1 cells' proliferation ability was detected by CCK‑8 assay and clone formation assay. The scratch assay and Transwell migration assay were used to detect the effect of PFD on 4T1 cells' migration ability. The Transwell invasion assay was used to detect the effect of PFD on 4T1 cells' invasion ability. Molecular docking was used to verify the interaction between PFD and NAT1. Results Compared to the control group， PFD significantly inhibited the protein expression of NAT1 at the concentration of 8 mmol/L （P<0.000 1）； Compared to the control group， the proliferation， migration， and invasion abilities of 4T1 cells treated with PFD at 2， 4， 6 and 8 mmol/L gradually weakened in a concentration‑ dependent manner. Among them， when the concentration of PFD was 8 mmol/L， it significantly inhibited the proliferation， migration， and invasion abilities of 4T1 cells （P<0.001）； Furthermore， molecular docking indicated that there were hydrogen bonds and hydrophobic interactions between PFD and NAT1. Conclusion The concentration of PFD at 8 mmol/L reduces the proliferation， migration， and invasion abilities of triple‑negative breast cancer 4T1 cells by inhibiting the expression of NAT1 protein.

Graphical abstract

关键词

三阴性乳腺癌 / 吡非尼酮 / 增殖 / 迁移 / 侵袭

Key words

Triple negative breast cancer / Pirfenidone / Proliferation / Migration / Invasion

乳腺癌是威胁女性生命健康的常见肿瘤，2024年国际癌症研究机构的统计数据显示，2022年乳腺癌的新发病例占全球新增癌症病例数的11.6%，稳居全球女性恶性肿瘤发病率之首^［1］。三阴性乳腺癌是乳腺癌中恶性程度最高的亚型，具有高侵袭、高转移、易复发和预后差等特点^［2‑4］。手术和常规化疗是三阴性乳腺癌目前主要的治疗手段，但治疗效果不佳，患者在治疗过程中易发生转移^［5］，控制转移是治疗三阴性乳腺癌的关键因素。因此，临床迫切需要寻找针对三阴性乳腺癌的精准治疗靶点和更有效的治疗方法。

芳胺N‑乙酰转移酶1（arylamine N‑acetyltrans‑ ferase 1，NAT1）基因是一种致癌物代谢基因^［6］，参与芳香化胺的降解，编码一种在体内广泛表达的药物代谢酶——N‑乙酰转移酶1，研究发现其可促进癌细胞的增殖，参与癌症的进展^［7‑9］。研究表明，NAT1在乳腺癌中表达上调，并促进乳腺癌生长和转移^{［10‑12］}。吡非尼酮（pirfenidone，PFD）是一类具有强烈的抗纤维化、抗炎、抗氧化损伤和调节凋亡作用的吡啶酮类化合物^{［13，14］}。有研究报道，PFD具有抑制细胞增殖的作用。例如，PFD可抑制心脏成纤维细胞^［15］、肺成纤维细胞^［16］、胰腺星状细胞^［17］及胰腺癌细胞^［18］增殖。也有研究显示，PFD在促进三阴性乳腺癌MDA‑MB‑231细胞凋亡，同时以剂量依赖的方式抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭^［19］。Liu等^［20］研究发现，PFD通过抑制N‑钙黏蛋白上调，抑制肿瘤相关成纤维细胞（cancer‑associated fibroblasts，CAFs）的分化和活化，同时PFD还能促进CAFs分泌exo‑miR‑200，进而抑制锌指E盒结合同工酶1（ZEB1）的表达，减缓肺癌细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化过程。然而，PFD调控NAT1对三阴性乳腺癌4T1细胞的抑制作用机制尚不明确。因此，本研究主要探讨PFD作用于三阴性乳腺癌4T1细胞后NAT1蛋白表达情况，并通过增殖、迁移与侵袭实验验证其对三阴性乳腺癌细胞生物学行为的影响，采用分子对接实验探寻PFD与NAT1之间的互作位点，以探讨PFD通过调控NAT1蛋白表达影响三阴性乳腺癌发生、发展过程的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

三阴性乳腺癌4T1细胞购于ATCC细胞库，PFD购于上海麦克林生化科技股份有限公司，Matrigel基质胶购自美国BD Biosciences公司，DMEM基础培养基购于美国Gibco公司，胎牛血清购于苏州依科赛生物科技股份有限公司，NAT1抗体和Tubulin抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司，Bradford蛋白浓度测定试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，CCK‑8试剂盒购于爱必信上海生物科技有限公司，青链霉素混合液购于北京索莱宝科技有限公司，胰蛋白酶购于美国Gibco公司，结晶紫购于北京索莱宝科技有限公司。

1.2 细胞培养

从液氮中取出三阴性乳腺癌4T1细胞株进行复苏，采用含1%双抗及10%胎牛血清的DMEM培养基对细胞进行培养。当细胞生长至接近80%培养皿底面覆盖时，加入0.25%浓度的胰蛋白酶以进行消化处理，随后进行细胞传代操作。

1.3 检测方法

1.3.1 PFD药物作用后4T1细胞形态变化

培养2组野生型4T1细胞，当细胞生长密度处于30%~40%范围时，将2组细胞的培养基更换为含2% FBS的培养基。其中一组加入8 mmol/L浓度的PFD，另一组不添加PFD作为对照组。培养48 h后，采集2组细胞在10倍镜下的形态图。

1.3.2 Western blot检测PFD作用4T1细胞后NAT1蛋白的表达

在冰面上进行细胞裂解操作，随后提取0、2、4、6、8 mmol/L不同浓度PFD处理48 h后的细胞样本中的总蛋白。采用Bradford蛋白质定量法测定样本中总蛋白质的含量，向样品中加入适量的5×蛋白上样缓冲液。使用金属浴将蛋白样品在100 ℃下加热5 min以实现变性，随后将其转移至-80 ℃的低温冰箱中保存。取20 μg蛋白质样品进行上样，通过SDS‑PAGE凝胶电泳对蛋白质进行分离，将分离得到的蛋白质转移到PVDF膜上。使用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液将膜进行封闭处理。将该膜置于4 ℃条件下的摇床上，加入一抗进行过夜孵育。第2天在常温下进行二抗孵育，时间控制为2 h。完成二抗孵育后，向样本加入ECL发光液使其与蛋白条带充分反应，最后借助凝胶成像仪观察结果，选用tubulin作为内参。

1.3.3 CCK‑8法检测PFD对4T1细胞增殖能力的影响

CCK‑8细胞增殖实验选取处于对数生长期的4T1细胞，通过0.25%胰酶消化处理，随后用培养基轻柔吹打的方式，制备成单细胞悬液。将4T1细胞接种到96孔板中，每孔接种2 000个细胞进行贴壁培养。实验分组如下：以0 mmol/L浓度的PFD为对照组，2、4、6、8 mmol/L PFD为药物处理组，每个浓度设置3个复孔。分别培养0、24、48、72 h后，向每个孔加入10 μL的CCK‑8试剂，然后将实验板放在培养箱中孵育2 h。使用酶标分析仪测量各孔的吸光度值（波长设定为450 nm），并记录相应的光密度值，采用GraphPad Prism 10.0软件绘制细胞增殖图并进行统计分析。

1.3.4 克隆形成实验检测PFD对4T1细胞增殖能力的影响

将待测细胞以每孔900个的密度均匀分布接种在6孔培养板内，确保细胞铺展均匀。待细胞成功贴壁后，向各组分别加入浓度为0、2、4、6、8 mmol/L的PFD。经过14 d的培养，根据细胞克隆球形成情况可终止克隆，吸弃6孔培养板中的培养基。用PBS对样本进行2次温和的清洗。在各培养孔中加入1 mL浓度为4%的多聚甲醛，固定细胞30 min。固定步骤完成后，用PBS洗2遍，以彻底清除残留的多聚甲醛。向每个孔中加入1 mL浓度为0.1%的结晶紫染色剂，染色细胞30 min。完成染色步骤后，用PBS多次清洗，直至6孔板背景无明显残留染色液。将6孔板自然晾干并拍照留存，采用ImageJ软件进行量化统计与分析。

1.3.5 划痕实验检测PFD对4T1细胞迁移能力的影响

在6孔培养板内接种数量为1×10⁶的4T1细胞，每孔细胞数量保持一致。培养24 h后，向相应孔中分别加入0、2、4、6、8 mmol/L浓度的PFD。用10 μL无菌移液管尖端在6孔板中心均匀划痕，PBS轻轻洗涤2次，采用含有2%胎牛血清的完全培养基进行细胞培养。分别在0、12、24 h拍摄同一位置的细胞，借助ImageJ软件进行分析，并据此计算平均的划痕愈合比例。

1.3.6 Transwell迁移实验检测PFD对4T1细胞迁移能力的影响

用0.25%的胰酶消化不同浓度PFD处理后的4T1细胞，消化完成后计数。使用无血清培养基重悬细胞，在Transwell小室的上室内，以每孔200 μL的体积接种细胞，细胞数量约为3×10⁴个。同时，向下室加入含有20%胎牛血清的DMEM。完成细胞接种后，把培养板放在温度37 ℃、CO₂浓度为5%的恒温培养箱中孵育9~10 h。在室温条件下，使用4%浓度的多聚甲醛固定细胞30 min。完成固定后，采用0.1%浓度的结晶紫溶液染色细胞30 min。染色结束后，细胞经过多次PBS清洗后待其自然晾干，随后在10倍显微镜下进行图像采集，随机挑选5个视野。采用GraphPad Prism 10.0软件对收集的数据进行分析，并据此绘制出了相应的柱状统计图。

1.3.7 Transwell侵袭实验检测PFD对4T1细胞侵袭能力的影响

提前2 h将Matrigengel基质胶与DMEM按1∶8的比例混合，在Transwell小室的上室底部进行铺展，以此构建侵袭模型。之后的操作步骤与“1.3.6”项中Transwell迁移实验流程一致。

1.4 分子对接验证

下载蛋白PDB文件，导入后使用Protein preparation模块检查蛋白质晶体结构中是否存在任何缺失的原子或残基，并相应地进行校正。将筛选出的化合物通过Schrodinger软件进行化合物能量最小化处理，力场选择OPLS4。再通过SiteMap模块预测蛋白能结合配体小分子的活性口袋，使用Receptor Grid Generation模块将复合物中与靶蛋白结合的配体作为参考从而生成对接靶点。使用薛定谔套件的Ligand Docking模块中的精确精度将制备好的配体库对接至蛋白质的活性位点，得到化合物与靶点对接后的GlideScore分值，GlideScore值越大，配体与受体结合越稳定。通过GlideScore值的高低评价化合物与靶点的结合活性。最后用pyMOL 2.5对相互作用细节进行可视化处理。

1.5 统计学处理

使用GraphPad Prism 10.0软件和ImageJ软件进行实验结果的定量和统计学分析，计量资料以\overline{x}\pm s表示，2组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PFD作用三阴性乳腺癌4T1细胞的形态变化

未添加PFD的三阴性乳腺癌4T1细胞为贴壁生长细胞，培养48 h后，细胞形态呈多边或椭圆形，细胞表面色泽明亮，生长状态较好，见图1A。加入8 mmol/L PFD药物的4T1细胞培养48 h后，细胞形态呈细长梭形，细胞体积变小，胞质突触减少，细胞表面色泽模糊，生长状态不佳，见图1B。

2.2 PFD抑制三阴性乳腺癌4T1细胞NAT1的蛋白表达

不同浓度的PFD作用三阴性乳腺癌4T1细胞48 h后，Western blot检测NAT1蛋白表达量。结果显示，以0 mmol/L的PFD浓度为对照组，在0、2、4、6、8 mmol/L的PFD浓度梯度中，NAT1蛋白表达量呈现逐渐降低的趋势（P<0.01）。其中，在PFD浓度8 mmol/L的处理组中，NAT1蛋白的表达量最低（P<0.000 1），见图2。

2.3 PFD抑制三阴性乳腺癌4T1细胞的增殖

2.3.1 CCK‑8实验检测PFD对4T1细胞的增殖能力的影响

以梯度浓度0、2、4、6、8 mmol/L的PFD处理三阴性乳腺癌4T1细胞，加入CCK‑8试剂，使用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。结果显示，与0 mmol/L对照组相比，随着PFD浓度的增加，三阴性乳腺癌4T1细胞增殖明显受到抑制（P<0.05），其抑制作用具有时间和浓度依赖性。PFD浓度在8 mmol/L时，抑制效果最明显（P<0.000 1），见图3。

2.3.2 克隆形成实验检测PFD对4T1细胞的增殖能力的影响

在各孔4T1细胞中加入不同浓度的PFD作用14 d后，进行染色拍照。细胞克隆形成实验结果显示，与0 mmol/L对照组相比，2、4、6、8 mmol/L PFD作用4T1细胞后增殖能力明显减弱（P<0.001），在8 mmol/L时，细胞集落形成数量最少（P<0.000 1），见图4A~C。随着给药浓度的增加和时间的延长，细胞增殖抑制率呈现浓度、时间依赖性，提示PFD明显抑制了4T1的细胞克隆形成能力。

2.4 PFD对三阴性乳腺癌4T1细胞迁移的明显抑制作用

细胞划痕实验结果显示，与0 mmol/L对照组相比，2、4、6、8 mmol/L PFD处理三阴性乳腺癌4T1细胞12、24 h的愈合程度逐渐减慢（P<0.01），在24 h及8 mmol/L浓度下效果最为明显，差异具有统计学意义（P<0.000 1），见图5A、B。

2.5 不同浓度PFD抑制4T1细胞的迁移能力

通过Transwell迁移实验分析PFD对4T1细胞迁移能力的影响，实验结果显示，与0 mmol/L对照组相比，2、4、6、8 mmol/L PFD组穿过下室的细胞数目明显减少（P<0.01），当浓度达到8 mmol/L时，迁移的细胞数目最少，抑制作用最明显，提示8 mmol/LPFD能有效抑制三阴性乳腺癌4T1细胞的迁移（P<0.000 1），见图6A、B。

2.6 不同浓度PFD抑制4T1细胞的侵袭能力

通过Transwell侵袭实验分析PFD对4T1细胞侵袭能力的影响。Transwell侵袭实验表明，与0 mmol/L对照组相比，2、4、6、8 mmol/L PFD组穿过下室的细胞数目明显减少（P<0.01），其中8 mmol/L浓度PFD穿过的细胞数最少，这表明8 mmol/L PFD明显抑制三阴性乳腺癌4T1细胞的侵袭能力（P<0.001），见图7A、B。

2.7 靶基因NAT1与PFD药物的分子对接评价

分子对接结果显示，NAT1与PFD结合力较好，结合构象比较稳定。PFD与NAT1之间主要存在2种相互作用，氢键以及疏水相互作用。由图8可见，NAT1的287位苯丙氨酸的氧原子与PFD形成氢键相互作用（黄色虚线），除此之外，NAT1的ILE‑106、VAL‑216、PHE‑217、PHE‑37、PHE‑288与PFD之间存在疏水相互作用。

3 讨论

全世界每年约有100万名女性被诊断患有乳腺癌，其中15%~20%为三阴性乳腺癌患者^［21］。三阴性乳腺癌为雌激素、孕激素和人表皮生长因子受体表达呈阴性^［3］。此外，三阴性乳腺癌作为致命恶性肿瘤之一，其复发和转移的风险较高^［22］，目前主要治疗方法为化疗。然而，三阴性乳腺癌的异质性和高复发率使得化疗的效果不佳，患者预后普遍较差^［23］。因此，寻找新的治疗手段及药物成为当前亟需应对的挑战。

近年来，肿瘤纤维化和炎症反应被认为是影响肿瘤进展和转移的重要因素。PFD作为一种广谱抗纤维化药物^［24］，具有抗纤维化、抗炎、抗氧化的作用，主要作为特发性肺纤维化的一线治疗药物^［25］。随着对PFD的研究越来越广泛，已有报道表明PFD在肺癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤中可发挥一定的抗肿瘤作用^{［26‑28］}，与靶向药物或化疗药物联用时可增强治疗效果，具有成为新的肿瘤治疗药物的潜力^{［29‑31］}。在本研究中将不同浓度的PFD作用于三阴性乳腺癌细胞4T1后，观察其对细胞增殖、克隆形成、迁移与侵袭的影响。CCK‑8检测结果显示，PFD对4T1细胞的生长增殖具有明显的抑制效应，且呈浓度和时间依赖。尤其是当PFD浓度在8 mmol/L时，抑制作用最为明显。克隆形成实验发现PFD对4T1的克隆形成能力产生影响，在0、2、4、6、8 mmol/L的PFD浓度中，随着PFD浓度的增加，细胞团逐渐减小，在8 mmol/L时，几乎观察不到生长的细胞团，这提示PFD可能对4T1细胞的增殖及聚集能力产生影响。PFD不仅抑制了4T1细胞的迁移与侵袭，而且这种抑制作用还呈现出一种明显的浓度梯度依赖关系。在8 mmol/L浓度时可明显抑制4T1细胞的迁移和侵袭，以上结果可为PFD治疗乳腺癌提供相关实验依据。

NAT1作为一类药物代谢酶，发现与癌细胞的增殖及转移密切相关^［6］。已有研究通过40多项癌症微阵列数据分析显示，NAT1在多种癌症类型的正常组织与恶性组织间呈现明显的表达差异^［6］。在乳腺癌中，其高表达被证实可促进肿瘤转移进程^［32］。Li等^［33］的研究进一步揭示，当NAT1基因在MDA‑MB‑231、HT‑29和HeLa 3种癌细胞系中被敲除后，这些细胞系表现出胶原黏附能力增强、侵袭能力减弱以及细胞形态改变等表型。NAT1除了在乳腺癌中发挥促癌的作用，在其他癌症中也发挥相应的促进肿瘤进展的作用，如在结肠癌中^［34］，NAT1通过抑制E‑cadherin表达促进结肠癌细胞增殖、锚定非依赖性生长及体内肿瘤进展，其敲低可通过恢复接触抑制和分化表型抑制恶性行为。在胰腺癌中，Zhang等^［35］通过基因分析发现，NAT1快速基因型与胰腺癌的风险明显升高有关。推测较高的NAT1活性可导致在胰腺中形成高反应性DNA损伤，即快速NAT1基因型会增加个体患胰腺癌的风险。在膀胱癌中，Dhaini等^［36］通过检索不同数据库的数据集分析NAT1不同基因多态性与膀胱癌风险间的关联时发现，许多慢乙酰化基因型可增加膀胱癌风险。在前列腺癌中^［37］，一项对患者前列腺组织NAT1基因的表达研究发现，在前列腺上皮中存在NAT1特异性mRNA，且人前列腺NAT活性主要由NAT1催化，可通过激活致癌物而在前列腺癌中发挥作用。

本课题研究发现，三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭与NAT1蛋白密切相关。在本研究中，利用PFD药物处理三阴性乳腺癌4T1细胞后，Western blot分析显示，相较于阴性对照组，加入PFD的实验组中NAT1蛋白的表达水平呈现降低趋势，提示PFD可能抑制了NAT1蛋白的表达。进一步的研究通过应用不同浓度的PFD药物处理三阴性乳腺癌4T1细胞48 h后显示，NAT1的表达量在药物处理后明显下降，尤其是当使用8 mmol/L浓度的PFD处理时，NAT1的表达量降至最低，这表明PFD对三阴性乳腺癌4T1细胞中的NAT1蛋白表达具有抑制作用。分子对接结果显示，PFD与NAT1具有良好的结合能力，这提示PFD可能通过抑制NAT1蛋白表达，进而影响三阴性乳腺癌4T1细胞的生物学功能。此外，通过CCK‑8细胞增殖实验、克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移实验和侵袭实验也验证这一假说，经过PFD处理的三阴性乳腺癌4T1细胞的增殖、迁移与侵袭能力明显低于阴性对照组，当PFD浓度达8 mmol/L时，抑制作用最为明显。通过功能实验验证，PFD可调控NAT1蛋白的表达抑制三阴性乳腺癌4T1细胞的增殖、迁移与侵袭，但PFD通过NAT1抑制三阴性乳腺癌4T1细胞增殖、迁移与侵袭的具体作用机制仍需要进一步探究。

Zhao等^［32］研究发现，NAT1在乳腺癌中呈现高表达，其功能可通过核因子‑κB （nuclear factor kappa B，NF‑κB）信号通路影响乳腺癌的进展。而敲除NAT1后，其在乳腺癌中通过抑制NF‑κB通路下调IL‑1B的分泌，使乳腺癌细胞也减少分泌TNF‑α、IL‑1β、IL8等多种细胞因子，进而抑制乳腺癌细胞的增殖与转移能力。在乳腺癌细胞中敲除NAT1可明显抑制NF‑κB通路活性，导致IL‑1B表达下调，而过表达NAT1则激活该通路并上调IL‑1B，且抑制NF‑κB关键分子p65可阻断NAT1对IL‑1B的调控作用，表明NAT1是NF‑κB通路的上游调控因子之一。同时，PFD对NF‑κB通路的抑制作用在肿瘤中已证实^［38］，其通过减少IKKα活性、抑制IkBα磷酸化阻断NF‑κB p65/p50异二聚体的核转位，同时增加具有抗炎作用的p50同源二聚体比例，并通过激活PPARγ促进其与NF‑κB的互作，从而抑制TNF‑α、IL‑6等促炎因子及PDGFB等促纤维化因子的转录，进而抑制肿瘤进展。这种作用机制与NAT1的通路效应具有一定的相关性，敲低NAT1通过抑制NF‑κB通路抑制转移过程（如下调IL‑1B分泌），PFD则通过多重途径抑制NF‑κB核转位及下游因子表达，二者在“NF‑κB通路‑促炎因子释放‑肿瘤微环境重塑”都作用于同一核心通路。因此，PFD在三阴性乳腺癌中，可能通过抑制NAT1的表达或活性，阻断NF‑κB通路的激活，进而减少IL‑1B等促炎因子的释放，从而抑制三阴性乳腺癌增殖、迁移和侵袭。

综上所述，本研究揭示了PFD可调控NAT1蛋白抑制三阴性乳腺癌4T1细胞的增殖、迁移与侵袭，进而发挥抗肿瘤作用。这一发现为深入理解三阴性乳腺癌的恶性生物学行为提供了理论基础和新的研究方向，为开发靶向NAT1的新型抗肿瘤策略提供了科学依据，为改善三阴性乳腺癌患者的治疗提供了新的治疗路径。

作者贡献度说明：

周静：实验设计；亢世景：完成实验，分析实验结果数据、撰写论文；王娴娴：协助完成实验数据；史恩赐、余庆：统计分析；徐丽、刘海琴、叶思思：图片采集和数据分析。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

参考文献

[1] Bray F， Laversanne M， Sung H， et al. Global cancer statistics 2022： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries［J］. CA Cancer J Clin， 2024， 74（3）： 229‑263.

[2] Zhu S， Wu Y， Song B， et al. Recent advances in targeted strategies for triple‑negative breast cancer［J］. J Hematol Oncol， 2023， 16（1）： 100.

[3] Derakhshan F， Reis‑filho JS. Pathogenesis of triple‑ negative breast cancer［J］. Annu Rev Pathol， 2022， 17： 181‑204.

[4] Leon‑ferre RA， Goetz MP. Advances in systemic therapies for triple negative breast cancer［J］. BMJ， 2023， 381： e071674.

[5] Nakhjavani M， Samarasinghe RM， Shigdar S. Triple‑ negative breast cancer brain metastasis： An update on druggable targets， current clinical trials， and future treatment options［J］. Drug Discov Today， 2022， 27（5）： 1298‑1314.

[6] Minchin RF， Butcher NJ. Trimodal distribution of arylamine N‑acetyltransferase 1 mRNA in breast cancer tumors： Association with overall survival and drug resistance［J］. BMC Genomics， 2018， 19（1）： 513.

[7] Salazar‑González RA， Doll MA， Hein DW. Arylamine N‑acetyltransferase 1 activity is regulated by the protein acetylation status［J］. Front Pharmacol， 2022， 13： 797469.

[8] Carlisle SM， Trainor PJ， Doll MA， et al. Human arylamine N‑acetyltransferase 1 （NAT1） knockout in MDA‑ MB‑231 breast cancer cell lines leads to transcription of NAT2［J］. Front Pharmacol， 2022， 12： 803254.

[9] Habil MR， Doll MA， Hein DW. Acetyl coenzyme A kinetic studies on N‑acetylation of environmental carcinogens by human N‑acetyltransferase 1 and its NAT1*14B variant［J］. Front Pharmacol， 2022， 13： 931323.

[10] Stepp MW， Salazar‑gonzález RA， Hong KU， et al. N‑acetyltransferase 1 knockout elevates acetyl coenzyme A levels and reduces anchorage‑independent growth in human breast cancer cell lines［J］. J Oncol， 2019， 2019： 3860426.

[11] Zhang X， Carlisle SM， Doll MA， et al. High N‑acetyltransferase 1 expression is associated with estrogen receptor expression in breast tumors， but is not under direct regulation by estradiol， 5α‑androstane‑3β， 17β‑diol， or dihydrotestosterone in breast cancer cells［J］. J Pharmacol Exp Ther， 2018， 365（1）： 84‑93.

[12] Stepp MW， Doll MA， Carlisle SM， et al. Genetic and small molecule inhibition of arylamine N‑acetyltransferase 1 reduces anchorage‑independent growth in human breast cancer cell line MDA‑MB‑231［J］. Mol Carcinog， 2018， 57（4）： 549‑558.

[13] Torre A， Martínez‑sánchez FD， Narvaez‑chávez SM， et al. Pirfenidone use in fibrotic diseases： What do we know so far［J］. ImmunInflamm Dis， 2024， 12（7）： e1335.

[14] Martinez‑alvarado Y， Amezcua‑galvez E， Davilarodri‑ guez J， et al. Pirfenidone protects from UVB‑induced photodamage in hairless mice［J］. Molecules， 2023， 28（7）： 2929.

[15] Meyer FEU， Santos GL， Doan TP， et al. Pirfenidone affects human cardiac fibroblast proliferation and cell cycle activity in 2D cultures and engineered connective tissues［J］. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol， 2023， 396（8）： 1687‑1699.

[16] Ebrahimpour A， Ahir M， Wang M， et al. Combination of esomeprazole and pirfenidone enhances antifibrotic efficacy in vitro and in a mouse model of TGFβ‑induced lung fibrosis［J］. Sci Rep， 2022， 12（1）： 20668.

[17] Guo HL， Liang XS， Zeng XP， et al. Pirfenidone alleviates chronic pancreatitis via suppressing the activation of pancreatic stellate cells and the M1 polarization of macrophages［J］. Int Immunopharmacol， 2024， 130： 111691.

[18] Lei Y， Xu J， Xiao M， et al. Pirfenidone alleviates fibrosis by acting on tumour‑stroma interplay in pancreatic cancer［J］. Br J Cancer， 2024， 130（9）： 1505‑1516.

[19] Luo D， Zeng X， Zhang S， et al. Pirfenidone suppressed triple‑negative breast cancer metastasis by inhibiting the activity of the TGF‑β/SMAD pathway［J］. J Cell Mol Med， 2023， 27（3）： 456‑469.

[20] Liu J， Cao L， Li Y， et al. Pirfenidone promotes the levels of exosomal miR‑200 to down‑regulate ZEB1 and represses the epithelial‑mesenchymal transition of non‑ small cell lung cancer cells［J］. Hum Cell， 2022， 35（6）： 1813‑1823.

[21] Siegel RL， Miller KD， Fuchs HE， et al. Cancer statistics， 2022［J］. CA Cancer J Clin， 2022， 72（1）： 7‑33.

[22] Bianchini G， De Angelis C， Licata L， et al. Treatment landscape of triple‑negative breast cancer—Expanded options， evolving needs［J］. Nat Rev Clin Oncol， 2022， 19（2）： 91‑113.

[23] Dillekås H， Rogers MS， Straume O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases［J］. Cancer Med， 2019， 8（12）： 5574‑5576.

[24] Liu B， Rong Y， Sun D， et al. Costunolide inhibits pulmonary fibrosis via regulating NF‑κB and TGF‑β1/Smad2/Nrf2‑NOX4 signaling pathways［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2019， 510（2）： 329‑333.

[25] Aimo A， Spitaleri G， Nieri D， et al. Pirfenidone for idiopathic pulmonary fibrosis and beyond［J］. Card Fail Rev， 2022， 8： e12.

[26] Fujiwara A， Funaki S， Fukui E， et al. Effects of pirfenidone targeting the tumor microenvironment and tumor‑ stroma interaction as a novel treatment for non‑small cell lung cancer［J］. Sci Rep， 2020， 10（1）： 10900.

[27] Zou W， Huang Z， Jiang TP， et al. Pirfenidone inhibits proliferation and promotes apoptosis of hepatocellular carcinoma cells by inhibiting the Wnt/Β‑Catenin signaling pathway［J］. Med Sci Monit， 2017， 23： 6107‑6113.

[28] Aboulkheyr Es H， Bigdeli B， Zhand S， et al. Mesenchymal stem cells induce PD‑L1 expression through the secretion of CCL5 in breast cancer cells［J］. J Cell Physiol， 2021， 236（5）： 3918‑3928.

[29] Marwitz S， Turkowski K， Nitschkowski D， et al. The multi‑modal effect of the anti‑fibrotic drug pirfenidone on NSCLC［J］. Front Oncol， 2020， 9： 1550.

[30] Qin W， Zou J， Huang Y， et al. Pirfenidone facilitates immune infiltration and enhances the antitumor efficacy of PD‑L1 blockade in mice［J］. Oncoimmunology， 2020， 9（1）： 1824631.

[31] Branco H， Oliveira J， Antunes C， et al. Pirfenidone sensitizes NCI‑H460 non‑small cell lung cancer cells to paclitaxel and to a combination of paclitaxel with carboplatin［J］. Int J Mol Sci， 2022， 23（7）： 3631.

[32] Zhao C， Cai X， Wang Y， et al. NAT1 promotes osteolytic metastasis in luminal breast cancer by regulating the bone metastatic niche via NF‑κB/IL‑1B signaling pathway［J］. Am J Cancer Res， 2020， 10（8）： 2464‑2479.

[33] Li P， Butcher NJ， Minchin RF. Effect arylamine N‑acetyltransferase 1 on morphology， adhesion， migration， and invasion of MDA‑MB‑231 cells： Role of matrix metalloproteinases and integrin αV［J］. Cell AdhMigr， 2020， 14（1）： 1‑11.

[34] Tiang JM， Butcher NJ， Cullinane C， et al. RNAi‑ mediated knock‑down of arylamine N‑acetyltransferase‑1 expression induces E‑cadherin up‑regulation and cell‑cell contact growth inhibition［J］. PLoS One， 2011， 6（2）： e17031.

[35] Zhang K， Gao L， Wu Y， et al. NAT1 polymorphisms and cancer risk： A systematic review and meta‑analysis［J］. Int J Clin Exp Med， 2015， 8（6）： 9177‑9191.

[36] Dhaini HR， El Hafi B， Khamis AM. NAT1 genotypic and phenotypic contribution to urinary bladder cancer risk： A systematic review and meta‑analysis［J］. Drug Metab Rev， 2018， 50（2）： 208‑219.

[37] Gong C， Hu X， Gao Y， et al. A meta‑analysis of the NAT1 and NAT2 polymorphisms and prostate cancer： A huge review［J］. Med Oncol， 2011， 28（1）： 365‑376.

[38] Silva‑Gomez JA， Galicia‑Moreno M， Sandoval‑Rodriguez A， et al. Hepatocarcinogenesis prevention by pirfenidone is PPARγ mediated and involves modification of nuclear NF‑κB p65/p50 ratio［J］. Int J Mol Sci， 2021， 22（21）： 11360.