竹荪多糖通过抑制NLRP3/GSDMD/IL‑1β信号通路缓解慢性乙醇暴露小鼠小脑浦肯野细胞的损伤

Dictyophora polysaccharides alleviate the damage to Purkinje cells in the cerebellum of mice with chronic ethanol exposure by inhibiting the NLRP3/GSDMD/IL‑1β signaling pathway

摘要

目的 探究竹荪多糖（dictyophora polysaccharide，DIP）通过抑制NLRP3/GSDMD/IL‑1β信号通路缓解慢性乙醇暴露对小鼠小脑浦肯野细胞（Purkinje cell，PC）的损伤。 方法 构建小鼠慢性乙醇暴露模型，按照随机数字表法将小鼠分成5组（n=8）：对照（Con）组、100 mg/kg DIP（DIP_H）组、4 g/kg 20%乙醇（EtOH）组、4 g/kg 20%乙醇+25 mg/kg DIP（EtOH+DIP_L）组、 4 g/kg 20%乙醇+100 mg/kg DIP（EtOH+DIP_H）组。采用步态实验和转棒实验检测小鼠的运动协调和平衡能力，ELISA实验检测炎症因子白细胞介素‑1β（interleukin‑1β，IL‑1β）和白细胞介素‑18（interleukin‑18，IL‑18）表达水平。苏木精‑伊红（hematoxylin‑ eosin staining，H&E）染色观察PC的形态，尼氏染色观察PC尼氏小体的分布及形态，钙结合蛋白（Calbindin）染色观察PC的形态、分布和数量，TUNEL染色观察PC凋亡情况。利用胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）染色和离子钙结合衔接分子‑1（ionized calcium‑binding adapter molecule‑1，Iba‑1）染色观察胶质细胞增殖状态；2'，3'‑环核苷酸3'‑磷酸二酯酶（CNP）染色用于反映髓鞘的完整性，甘氨酸银染色用于观察PC轴突的改变，透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）观察PC表面的形态、突触的数量、细胞膜、细胞核及线粒体的损伤情况，Western blot检测小脑组织内NLRP3炎症通路相关蛋白表达水平，高尔基染色观察PC树突棘的改变。 结果 与Con组相比，EtOH组小鼠的运动协调性和平衡力明显降低（P<0.01）。H&E、尼氏、Calbindin染色结果显示，EtOH组小鼠PC数量明显减少（P<0.01），GFAP及Iba‑1阳性细胞数量明显增多（P<0.01），且大量PC有脱髓鞘病变及轴突和树突丢失的现象（P<0.01），NLRP3炎症通路下游蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。TEM显示，PC突触密度明显降低（P<0.01），突触后致密区（postsynaptic density，PSD）长度变短、厚度变薄（P<0.01），神经元内线粒体嵴消失，线粒体空泡化；DIP干预后，小鼠的运动协调性和平衡能力明显好转，PC的数量及形态恢复正常，NLRP3炎症通路下游蛋白表达水平明显降低（P<0.01），GFAP和Iba‑1阳性细胞数量明显下降（P<0.01），PC的突触数量增加、PSD长度增长、厚度增加及神经元内线粒体形态有所改善（P<0.05）。 结论 DIP能通过抑制NLRP3/GSDMD/IL‑1β炎症通路缓解乙醇对小鼠小脑PC的损伤和小鼠运动能力损伤，改善PC超微结构，并抑制PC发生焦亡。

Abstract

Objective To explore the alleviating effects of dictyophora polysaccharide （DIP） on the damage of Purkinje cells （PC） in the cerebellum of mice caused by chronic ethanol exposure through inhibiting the NLRP3/GSDMD/IL‑1β signaling pathway. Methods A mouse model of chronic ethanol exposure was constructed. The mice were divided into 5 groups （n=8） according to the random number table method： the Control （Con） group， the 100 mg/kg DIP（DIP_H） group， the 4 g/kg 20% ethanol（EtOH）group， the 4 g/kg 20% ethanol+25 mg/kg DIP（EtOH+DIP_L） group， and the 4 g/kg 20% ethanol+100 mg/kg DIP（EtOH+DIP_H） group. The gait test and rotarod test were used to detect the motor coordination and balance ability of the mice， the expression levels of inflammatory factors interleukin‑1β （IL‑1β） and interleukin‑18 （IL‑18） were detected by ELISA. Hematoxylin‑eosin staining （H&E） was used to observe the morphology of PC. Nissl staining was used to observe the distribution and morphology of Nissl bodies in PC. Calbindin staining was used to observe the morphology， distribution， and number of PC. TUNEL staining was used to observe the apoptosis of PC. Glial fibrillary acidic protein （GFAP） staining and ionized calcium‑binding adapter molecule‑1 （Iba‑1） staining were used to observe the proliferation state of glial cells. Staining with 2'，3'‑cyclic‑nucleotide 3'‑phosphodiesterase （CNP） was used to reflect the integrity of myelin sheaths. Gomori's silver impregnation staining was used to observe the changes of axons of PC. Transmission electron microscopy （TEM） was used to observe the surface morphology of PC， the number of synapses， and the damage of cell membranes， cell nuclei， and mitochondria. Western blot was used to detect the expression levels of proteins related to the NLRP3 inflammatory pathway in cerebellar tissues. Golgi staining was used to observe the changes of dendritic spines of PC. Results Compared to the Con group， the motor coordination and balance ability of mice in the EtOH group were significantly decreased （P<0.01）. H&E staining， Nissl staining， and Calbindin staining showed that in the EtOH group， the number of PC was significantly decreased （P<0.01）， the number of GFAP and Iba‑1 positive cells was significantly increased （P<0.01）， and a large number of PC had demyelinating lesions， as well as the loss of axon trees and dendrites （P<0.01）. The expression levels of downstream proteins of the NLRP3 inflammatory pathway were significantly increased （P<0.01）. TEM showed that the synaptic density was significantly decreased （P<0.01）， the length of the postsynaptic density （PSD） became shorter and the thickness became thinner （P<0.01）， cristae structure of mitochondria in neurons disappeared， and the mitochondira was vacuolized. After DIP intervention， the motor coordination and balance ability significantly improved， the number and morphology of PC became normal， the expression levels of downstream proteins of the NLRP3 inflammatory pathway were significantly decreased （P<0.01）， the numbers of GFAP and Iba‑1 positive cells were significantly decreased （P<0.01）， the number of synapses of PC increased， the length of PSD increased， the thickness increased， and the morphology of cell membranes， cell nuclei， and mitochondria was improved （P<0.05）. Conclusion DIP alleviates ethanol‑induced mice cerebellar PC damage and mice motor dysfunction， improves ultrastructural abnormalities， and suppresses PC pyroptosis by inhibiting the NLRP3/GSDMD/IL‑1β inflammatory pathway.

Graphical abstract

关键词

竹荪多糖 / 小脑浦肯野细胞 / NLRP3/GSDMD/IL‑1β炎症通路 / 细胞焦亡 / 乙醇暴露

Key words

Dictyophora polysaccharide / Purkinje cells in the cerebellum / NLRP3/GSDMD/IL‑1β inflammatory pathway / Pyroptosis / Ethanol exposure

乙醇是一种精神活性物质，长期大量饮酒会对身体的各个器官造成不同程度的损害，尤其对中枢神经系统、肝脏和心脏损伤最为明显^［1‑3］。研究显示，全球每年约有300万人死于与酗酒相关的疾病或损伤，占所有死亡人数的5.3%，尤其在20~39岁的人群中，15.3%的死亡病例可归因于乙醇滥用^［4］。长期大量饮酒对人体造成的损伤已成为公共卫生领域研究的热点问题，引起了全球的广泛关注。

乙醇具有一定的脂溶性，容易穿越血脑屏障，对中枢神经系统的影响主要表现为影响神经递质的正常功能及导致神经元形态和功能发生改变^［5，6］。长期大量饮酒后，如果不停止饮酒行为或者接受有效的治疗，小脑会发生严重的炎症反应，造成神经元大量死亡，同时神经元的死亡也会促进炎症的发生、发展^［7，8］，从而陷入恶性循环。在中枢神经系统中，小脑是乙醇作用的重要靶器官^［9，10］。小脑内部结构从外向内为分子层、浦肯野细胞层、颗粒层，其中浦肯野细胞层中的浦肯野细胞（Purkinje cell，PC）与运动能力密切相关，且PC是小脑皮层中唯一的传出神经元，在运动协调能力和运动学习中至关重要^［11］。研究表明，PC极容易受到乙醇的损伤^{［12，13］}，但具体损伤机制尚不明确。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（nod‑like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1（cysteinyl aspartate‑specific proteinase‑1，Caspase‑1）、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis‑associ‑ ated speck‑like protein，ASC）结合为炎性小体，白细胞介素‑1β（interleukin‑1β，IL‑1β）和白细胞介素‑18（interleukin‑18，IL‑18）等炎性因子的激活，促进机体分泌炎性因子，从而诱导细胞死亡^{［14‑18］}。活化后的Caspase‑1会识别并切割消皮素D（gasdermin D，GSDMD），随后有活性的GSDMD‑N terminal会迁移到细胞膜上并打孔，形成直径约为10~14 nm的孔道，此时胞外的水分子会进入胞内，形成细胞水肿，胞内的大量炎性物质和乳酸脱氢酶会释放到胞外，导致炎症反应的发生^{［19‑21］}，但此通路及细胞焦亡过程是否参与乙醇诱导的PC损伤尚不明确。

竹荪多糖（dictyophora polysaccharide，DIP）是竹荪的一种重要成分。竹荪是一种珍贵的食用菌，其抗氧化特性能延缓机体衰老^{［22‑24］}。最近有研究表明，DIP对砷暴露大鼠的中枢神经系统损伤具有缓解作用^{［25，26］}，此外，近期研究也发现，DIP能缓解乙醇诱导的大鼠记忆功能障碍^［27］，及甲基苯丙胺引发的小鼠神经退行性病变^［28］，故本课题组推测DIP对于慢性乙醇暴露小鼠的中枢神经系统也有缓解作用。有文献报道，乙醇暴露会导致小鼠PC损伤并影响其运动功能^［29］，但是干预方法有待进一步研究。故本研究拟建立小鼠慢性乙醇暴露模型，探究乙醇暴露对PC的损伤及DIP的缓解作用，明确DIP通过调节NLRP3/GSDMD/IL‑1β炎症通路来缓解乙醇暴露后导致的运动功能障碍，为酒精性小脑损伤的防治提供一个可能的潜在治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

1.1.1 实验动物

C57BL/6J雄性小鼠（20~22 g，6周龄，SPF级）购于贵州医科大学实验动物中心，动物操作程序严格按照动物保护和使用委员会的规定进行，并经动物伦理委员会批准（编号：2403580）。动物生产许可证号：SCXK（京）2024‑0001，动物使用许可证号：SYXK（贵）2023‑0002。DIP购买于陕西宝鸡科斯麦植物多糖开发有限公司（生产批号：202306090023，纯度≥95%），小鼠适应性喂养1周，可自由获取食物和水，动物饲养环境：温度23~27 ℃，湿度50%~60%，保证室内、外环境相对安静。

1.1.2 动物模型建立

根据既往研究^{［28，30］}，本研究将DIP的低剂量及高剂量分别确定为25 mg/kg与100 mg/kg用于小鼠灌胃。将小鼠按随机数字表法分成以下5组（每组8只）：对照（Con）组、100 mg/kg DIP（DIP_H）组、4 g/kg 20%乙醇（EtOH）组、4 g/kg 20%乙醇+25 mg/kg DIP（EtOH+DIP_L）组、4 g/kg 20%乙醇+100 mg/kg DIP（EtOH+DIP_H）组。EtOH、EtOH+DIP_L、EtOH+DIP_H组小鼠每天中午12∶00~12∶30 i.p.给予20% EtOH（4 g/kg）^［31］，Con组小鼠i.p.给予同等体积的生理盐水，DIP_H组小鼠i.g.给予DIP_H溶液（100 mg/kg），在EtOH+DIP_L、EtOH+DIP_H组都完成乙醇处理1 h后，随后分别i.g.给予两组小鼠低、高浓度的DIP溶液，持续天数为21 d，在第14~16天时对各组小鼠进行行为学练习，第17~21天为正式测试时间，测试完毕后记录数据。

1.1.3 样本采集

行为学实验结束后，i.p.给予各组小鼠1%戊巴比妥钠（0.2 mL/100 g）使其深度麻醉并处死，在冰上取出小脑组织。将各组所有小脑组织平均分成三等分，取三分之一迅速放入-80 ℃冰箱保存以便后续免疫印记（Western blot）实验和酶联免疫吸附实验（enzyme‑linked immunosorbent assay，ELISA），三分之一浸于4%多聚甲醛用于后续的苏木精‑伊红（hematoxylin‑eosin staining，H&E）、Nissl染色及免疫组化等实验，三分之一用于高尔基染色和透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）检测。

1.2 主要仪器与试剂

酶标仪（K6600A，北京凯奥科技发展有限公司）；Bio‑Rad垂直Mini电泳液、湿式转膜仪（伯乐公司，美国）；伯乐化学发光成像系统（ChemiDoc Touch，1708370，美国）；TEM仪器（TH‑F‑120，国仪量子）；显微镜（日本奥林巴斯 CX23型）；石蜡切片机（2235，徕卡，德国）。

TUNEL Assay试剂盒‑HRP‑DAB（ab206386，abcam，英国）；ELISA试剂盒IL‑1β（KE10003，武汉三鹰，中国）；IL‑18（TD6252，abmart，中国）；NLRP3（ab4207，abcam，美国）；ASC（10500‑1‑AP，武汉三鹰，中国）；Caspase‑1（ab24232，CST，美国）；Caspase‑1（P20）（PC6368，abmart，中国）；IL‑1β（ab12703，CST，美国）；IL‑18（ab243091，abcam，美国）；GSDMD‑N terminal （ab222407，abcam，美国）；GSDMD（ab219800，abcam，美国）；GFAP（GFP‑M5148，武汉三鹰，中国）；Iba‑1（ab178846，abcam，美国）；2'，3'‑环核苷酸3'‑磷酸二酯酶（CNP）（ab6319，abcam，美国）；GAPDH（ab181602，abcam，美国）；甘氨酸银染色试剂盒（G1052‑500T，赛维尔，中国）；尼氏染色试剂盒（G1430，索莱宝，中国）；RIPA裂解液（R0010，索莱宝，中国）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（PC0020，索莱宝，中国）；ECL Plus超敏发光液（PE0010，索莱宝，中国）；4%组织细胞固定液（P1110，索莱宝，中国）；预染蛋白Marker（abs924，爱必信，中国）。

1.3 实验方法

1.3.1 步态实验与转棒实验

步态实验用于评估小鼠的运动协调性^{［32，33］}，和本课题组先前的测试方法一致^［34］，在桌面上放置白色A4纸（210 mm×297 mm），测试前，将小鼠的前爪和后爪分别用墨水涂成红色和黑色，正式测试前，小鼠进行为期3 d的适应性训练，正式测试期间，在A4纸的两边用挡板挡住，中间仅留出一条宽约12 cm的通道，使用相机拍下小鼠运动后留下的脚印，测量并记录步长和步宽进行分析。转棒实验的目的是评估小鼠的运动平衡和运动协调能力^{［32，35］}。本实验使用1个加速的转棒并以4~40 r/min的速度旋转，观察小鼠在转棒上的稳定性及持续时间。第14~16天对动物进行适应性训练，第17~21天为正式测试时间，记录每只小鼠的掉落潜伏期。

1.3.2 ELISA检测

将小脑组织放入预冷的匀浆器中，加入适量的组织匀浆RIPA裂解液，在冰浴条件下进行匀浆，使组织充分破碎，释放出细胞内的蛋白成分，将匀浆液转移到离心管中，4 ℃条件下以高转速（12 000 r/min）离心15 min，取上清液。操作步骤严格按照试剂盒说明书执行，测量不同组别的小鼠小脑组织内IL‑1β和IL‑18的表达情况，然后使用酶标仪在450 nm处检测光密度值，最后计算出IL‑1β和IL‑18炎症因子的相对表达水平。

1.3.3 Western blot检测

每只小鼠取50 mg小脑组织于研钵中，加入少许液氮使其凝固并充分捣碎，将捣碎的组织装入EP管中，每组EP管中加入适量的RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂及PMSF，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液放于新的EP管内，BCA法检测蛋白浓度，测3次取均值。每组取等体积蛋白上样，连接电源电泳，剪取PVDF膜（7.5 cm×2.0 cm），甲醇活化15 s，转印滤纸与海绵用1×转膜液浸泡后，组装转膜“三明治”，冰浴100 V湿法转膜，按蛋白分子量调整转膜时间，转膜完毕后，无蛋白快速封闭液封闭20 min，TBST漂洗3次，每次8 min，加入按照比例已经配好的特异性抗体并放在4 ℃的冰箱内过夜。用TBST多次洗膜，随后加入对应种属二抗室温孵育1 h，摇床振荡，TBST漂洗3次，每次8 min，最后，按1∶1体积比配ECL曝光液，避光浸透膜，用化学发光凝胶成像系统显影并采集图像。

1.3.4 H&E染色

利用石蜡切片机将蜡块切片，厚度5 μm，然后将载玻片放入70 ℃的温箱中烘烤30 min，经过苏木素染色1 min后用伊红染液染色30 s，切片经梯度乙醇脱水，二甲苯透明后用中性树胶封片，使用切片扫描仪扫片并用ImageJ软件分析。

1.3.5 免疫组织化学染色

将石蜡切片放入70 ℃烤箱中烘烤30 min，然后将切片放入干净的二甲苯溶液中充分脱蜡，随后放入无水乙醇、95%、85%、75%乙醇梯度复水，经过EDTA抗原修复液高压修复10 min后，小心取出载玻片后待其冷却至室温，用PBS充分淋洗，滴加山羊血清封闭液于37 ℃温箱中放置30 min，到时间后取出，冷却至室温，加入PBS充分淋洗，加入一抗目标蛋白于4 ℃冰箱中过夜，GFAP（稀释比1∶200）、Iba‑1（稀释比1∶200）、钙结合蛋白（Calbindin）（稀释比1∶200）、CNP（稀释比1∶200）一抗孵育时间达标后，PBS缓冲液充分淋洗3次，滴加山羊抗兔二抗，室温孵育1 h。使用DAB显色后，苏木素复染和盐酸乙醇分化，最终，经75%、85%、95%、无水乙醇各5 min梯度脱水和二甲苯充分透明后晾干，最后用中性树胶封片后密封保存并用ImageJ软件分析。

1.3.6 TUNEL染色

对小鼠小脑组织的石蜡切片进行TUNEL染色检测，操作过程严格按照说明书进行，使用显微镜记录扫片结果并观察、评估小鼠小脑PC的凋亡情况。

1.3.7 尼氏染色

石蜡切片常规脱蜡至水，用蒸馏水充分淋洗3次，5 min/次，随后用移液枪吸取焦油紫染色液，轻轻滴在组织上，随后置于56 ℃温箱中1 h，到时间后取出保湿盒待其冷却至室温，用蒸馏水冲洗掉多余的染液，随后滴加尼氏分化液分化5~8 s，降低背景颜色，常规脱水透明，最后封片并用ImageJ软件分析。

1.3.8 甘氨酸银染色

将石蜡切片脱蜡复水，常规脱蜡复水，蒸馏水洗3次，每次3 min，先将切片放入甘氨酸染液C中浸染5 min，蒸馏水洗3次，再将切片放入甘氨酸染液B（37 ℃提前预热好）中浸染5 min，最后将切片放入甘氨酸染液A中（45 ℃提前预热好）浸染3 s，迅速取出，观察染色情况，如染色较深，可滴加适量的甘氨酸染液D，常规脱水透明后封片并用ImageJ软件分析。

1.3.9 TEM观察

迅速取出小脑组织，放入预冷的固定液中（2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液）固定24 h，用缓冲液多次漂洗固定后的组织，将组织放入1 %的四氧化锇（0.1 mol/L PBS缓冲液稀释）中固定2 h，1%醋酸铀酰中浸泡1 h。随后依次通过梯度浓度的乙醇进行脱水处理，在65%的Epon树脂中包埋2 d，使用徕卡超薄切片机切片（7 nm），置于铜丝网上用柠檬酸铅染色，然后上机观察，每1组随机选择4只小鼠，每1只小鼠随机选择2个区域，共8个区域的代表图。统计突触的密度、长度及宽度等数值并进行统计学分析。最后，对采集到的图像使用Gatan Digital Micrograph和Graphpad Prism 9.0软件进行数据可视化处理和分析，并记录结果。

1.3.10 高尔基染色

小脑组织在高尔基液中避光浸泡5 d，使用振动切片机获取厚度为100 μm的小脑切片，72 h后，按以下顺序对小脑切片进行处理：双蒸水漂洗2次（6 min/次）、50%乙醇（6 min）、3∶1氨水溶液（8 min）、双蒸水漂洗2次（6 min/次）、5%硫代硫酸钠（10 min）、双蒸水漂洗2次（1 min/次）、75%、90%、95%和100%乙醇（各5 min）、二甲苯（5 min）。最后，使用显微镜采集图像，对树突棘数量进行计算，并按照先前描述的方法^［36］进行棘突类型分析。

1.4 统计学处理

本实验采取完全随机设计，实验数据采用SPSS22.0统计软件分析，分别进行正态分布和方差齐性检验，符合正态分布的计量资料采用\overline{x}\pm s表示，所有组的实验数据采用双因素方差分析（Two‑way ANOVA）结合Bonferroni's事后检测进行两两比较。采用Graphpad Prism 9.0进行数据可视化处理，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DIP能改善乙醇导致的小鼠行为学异常

小鼠造模时间轴见图1A。在步态实验中，与Con组相比，EtOH组小鼠步宽更宽，步长更短（P<0.01），DIP_H组小鼠的步宽和步长与Con组相比差异无统计学意义（P>0.05）。使用DIP干预后，小鼠步长和步宽具有明显改善，且EtOH+DIP_H组小鼠的改善更为明显（P<0.01），见图1B~D。在转棒实验中，与Con组小鼠相比，EtOH组小鼠在转棒上停留的时间明显减少（P<0.01）。DIP_H组小鼠在转棒上停留的时间与Con组相比差异无统计学意义（P>0.05），反映出DIP对小鼠并无任何毒性作用或不良反应。行为学实验的第5天，EtOH+DIP_H组小鼠从转棒上掉落的时间与Con组小鼠相近。使用DIP干预后，小鼠在转棒上停留的时间有所延长，EtOH+DIP_H组的效果更为明显（P<0.01），见图1E、F。

2.2 DIP能抑制乙醇导致的小鼠小脑内炎症因子水平的升高

ELISA结果显示，Con组与DIP_H组小鼠小脑内IL‑1β、IL‑18炎症因子表达水平正常，EtOH组小鼠IL‑1β、IL‑18表达明显升高（P<0.01），EtOH+DIP_L组IL‑1β、IL‑18表达水平相较于EtOH组有所降低（P<0.01），但是EtOH+DIP_H组炎症因子的表达水平更低，趋于Con组（P<0.01），见图2A、B。

2.3 DIP能缓解乙醇导致小鼠PC的病理改变

H&E染色结果显示，Con组与DIP_H组小鼠小脑PC形态正常、排列紧密，而EtOH组则排列疏松，黑色箭头指示PC空泡化，EtOH+DIP_L组较EtOH组PC排列有所改善，EtOH+DIP_H组较EtOH+DIP_L组PC形态和排列进一步恢复正常。Nissl染色结果显示，与Con组相比，EtOH组PC胞体不再呈现出正常时候的梨形或者烧瓶形，而是表现出不规则的形态，且胞体内的尼氏小体也明显减少，颜色变浅。Calbindin染色结果显示，乙醇暴露后，Calbindin阳性细胞数明显减少。TUNEL染色分析显示，各组PC细胞未出现明显的阳性信号，见图3。

为探究慢性乙醇暴露导致小鼠小脑炎症反应的情况，使用GFAP和Iba‑1染色评估星形胶质细胞和小胶质细胞的数量。结果显示，与Con组比较，乙醇的摄入会导致小鼠小脑内星形胶质细胞和小胶质细胞大量增殖（P<0.01），DIP_H组小鼠小脑内胶质细胞数量与Con组相比差异无统计学意义（P>0.05），接受DIP处理的EtOH组小鼠小脑中星形胶质细胞和小胶质细胞数量明显少于EtOH组（P<0.01），见图4A~D。

为评估DIP对乙醇诱导的轴突和髓鞘丢失的保护作用，对小鼠小脑进行甘氨酸银染色和CNP染色，见图5A。结果显示，与Con组比较，乙醇的摄入会导致小鼠小脑PC轴突断裂和髓鞘丢失（P<0.01），DIP干预后，小鼠小脑PC轴突和髓鞘的数目和形态趋于正常，见图5B~D。

2.4 DIP缓解慢性乙醇暴露诱导的PC超微结构损伤

为评估乙醇对小鼠小脑PC突触及对PC细胞膜、细胞核、线粒体的影响，使用TEM技术更加细微地观察小鼠小脑PC突触及PC胞体的形态变化，与Con组小鼠相比，EtOH组小鼠的突触密度明显减少（P<0.01），突触后致密区（postsynaptic density，PSD）长度变短及PSD厚度变薄（P<0.01），见图6A~D；PC细胞线粒体肿胀，体积明显增大，线粒体嵴消失、空泡化，见图6E。DIP干预后，突触密度、PSD长度及厚度都趋于正常且PC的细胞线粒体形态也趋于正常。

2.5 DIP能通过NLRP3/GSDMD/IL‑1β信号通路抑制相关蛋白及炎症因子的分泌

为探究DIP对乙醇诱导的小脑退变发挥保护作用的机制，分析NLRP3/GSDMD/IL‑1β信号通路相关蛋白，见图7A。结果显示，与Con组相比，EtOH组小鼠小脑中NLRP3、ASC、Caspase‑1（P20）、GSDMD‑N、IL‑1β、IL‑18表达水平明显升高（P<0.01）。Con组和DIP_H组小鼠小脑内NLRP3信号通路相关蛋白及炎症因子的表达差异无统计学意义（P>0.05）。此外，低剂量和高剂量的DIP都抑制了乙醇诱导的NLRP3、ASC、Caspase‑1（P20）、IL‑1β、GSDMD‑N、IL‑18蛋白水平的升高情况，但高浓度组比低浓度组的效果更为明显（P<0.01），见图7B~G。

2.6 DIP缓解慢性乙醇暴露诱导的PC树突棘的减少

Con组小鼠小脑PC经高尔基染色后，树突棘形态多样且分布有序，蘑菇状树突棘头部圆润饱满，大小均一，整体树突棘密度适中，沿树突干呈规律性排列，而在EtOH组中，PC树突棘明显减少（P<0.01）且形态不规则，蘑菇状棘头部萎缩、表面粗糙，与树突干连接松散，树突干也有表面异常与形态改变。DIP干预后，树突棘的数量明显增加且形态趋于正常（P<0.05），见图8A~D。

3 讨论

有研究表明，乙醇的摄入会导致小鼠PC形态发生改变及产生行为障碍和运动缺陷^{［37，38］}，且PC的损伤会直接导致运动功能受损^［39］，本研究的发现与上述研究一致，持续的乙醇暴露会导致小鼠PC坏死。首先，乙醇会导致小脑PC水肿、形态和大小异常、同时还导致星形胶质细胞和小胶质细胞大量激活，这提示慢性乙醇暴露会导致小鼠小脑发生炎症反应；同时，髓鞘丢失、轴突数量减少，这会导致神经冲动传导减慢，从而影响运动协调和平衡功能，并使PC的超微结构发生明显的变化，细胞膜上可见明显破损，核膜变形、出现扭曲、凹陷和局部肿胀，线粒体的嵴结构受到破坏，变得稀疏甚至断裂，还会导致PC的树突棘数量降低。此外，NLRP3炎症小体的激活，增加了Caspase‑1（P20）、GSDMD‑N terminal及炎症因子IL‑1β和IL‑18的表达水平。本研究证实，DIP对NLRP3炎症小体的激活具有抑制作用，同时促使Caspase‑1/GSDMD/IL‑1β通路相关蛋白表达水平下调，从而对NLRP3炎症小体产生抑制，缓解了因乙醇持续暴露所引发的小脑PC水肿、神经元变性及神经胶质细胞活化等一系列病理状况，且小鼠的运动功能障碍也得到明显改善。这一结果表明，NLRP3炎症小体所介导的Caspase‑1/GSDMD/IL‑1β炎症通路，可能成为应对乙醇长期摄入导致运动功能受损的关键治疗靶点。

研究发现，长时间暴露于乙醇环境下，PC会遭受严重损伤，细胞形态学层面有明显改变，如PC水肿、坏死，另外可见噬神经现象、髓鞘丢失、轴突数量减少，小脑内部神经胶质细胞大量被激活。借助Calbindin染色发现，PC表面的标志物数量锐减。为探究PC细胞的死亡方式，进行TUNEL染色实验。结果显示，乙醇处理后，PC未出现明显的凋亡，因此本课题组认为，乙醇导致的PC死亡方式主要为焦亡。此外，高尔基染色观察到小脑PC的蘑菇状树突棘和细状树突棘数量减少。通过TEM分析突触和PC胞体的形态后发现，持续的乙醇暴露会导致突触变性、小脑PC突触数量和PSD的厚度与长度降低，PC细胞膜表面受损且线粒体肿胀，嵴的形态紊乱，而DIP的干预会使上述情况得到改善，且高剂量的DIP改善效果更为明显。

从行为学视角观察，小鼠表现出明显的运动缺陷，在步态实验里，主要特征为步长明显缩短、步宽明显增加；在转棒实验中，小鼠在转棒上停留的时长明显缩短，运动协调与平衡机能下降，这揭示了慢性乙醇暴露给机体神经系统带来了严重危害，本研究结果为探究乙醇性神经损伤提供了直观的动物模型参照。

DIP的干预带来积极的改善效果，DIP_H组小鼠无论是行为学实验还是NLRP3相关通路蛋白及炎症因子表达水平，都与Con组小鼠无明显差异，这说明新型天然药物DIP的安全性是可靠的。DIP干预后，小鼠小脑PC受损状况得到有效控制，细胞完整性逐步恢复正常，行为学表现也得到较大提升。值得注意的是，高剂量的DIP所产生的效果更为明显，充分表明DIP针对受乙醇侵害的神经细胞具有切实的保护能力。更为关键的是，分子机制研究表明，DIP作用于NLRP3/GSDMD/IL‑1β信号通路，该信号通路处于介导炎症小体激活、细胞焦亡及炎症因子释放进程的核心位置，一旦过度激活，在慢性乙醇的影响下，细胞损伤程度加剧，DIP却能对此予以抑制，降低炎症反应的强度，阻止细胞焦亡进程，为PC营造相对安稳的内部环境，最终推动细胞完成修复。

有研究表明，慢性乙醇暴露可导致小鼠海马体内NLRP3/GSDMD/IL‑1β炎症通路的异常激活^［40］。乙醇及其代谢产物可能作为损伤相关分子模式或通过影响细胞内环境，促使NLRP3识别并启动激活程序，进而导致GSDMD被切割活化，大量释放IL‑1β、IL‑18等炎症因子^［41］。这些炎症因子在小鼠海马体内营造出炎症环境，是导致海马体受损乃至坏死的重要因素之一。本研究结果表明，慢性乙醇暴露同样可导致小鼠小脑内NLRP3/GSDMD/IL‑1β炎症通路的异常激活，且发现小鼠小脑PC的坏死程度与神经胶质细胞的激活数量呈正相关。DIP通过作用于NLRP3/GSDMD/IL‑1β炎症通路，减轻慢性乙醇暴露导致的小脑PC坏死，最终能在整体上改善小脑的功能。在行为学测试方面，EtOH+DIP_H组小鼠表现出运动协调能力、平衡能力的恢复，相较于EtOH+DIP_L组小鼠，恢复更为明显，说明高剂量DIP对慢性乙醇暴露引发的小脑功能障碍具有切实的缓解效果。本研究发现乙醇可诱导小脑区域IL‑1及IL‑18炎症因子明显上升，而给予DIP后，可缓解炎症因子的上调。因此，本课题组推测PC细胞的坏死可能与炎症因子的释放有关。本研究为慢性乙醇暴露相关小脑损伤的治疗提供了新的途径和思路。DIP作为一种天然产物，具有来源相对广泛、毒副作用相对较小等优点^{［42，43］}，使得DIP有望成为防治慢性乙醇性小脑神经损伤的天然药物资源，不仅拓宽了DIP的药用价值，也为后续研发对抗乙醇性神经系统疾病的创新疗法提供了理论基础和实验支撑。然而，本研究也存在一定的局限性，例如，本研究中仅采用雄性小鼠作为研究对象，后续实验应考虑雄性和雌性小鼠的性别差异^{［44‑46］}，如雄性小鼠并不存在激素周期对行为学的影响^{［47，48］}，同时为了达到样本一致性的要求，减小实验误差，本课题组会将雌性小鼠作为研究对象，以得到更为全面的实验数据。综上所述，本研究为新型天然药物DIP通过调控NLRP3/GSDMD/IL‑1β信号通路抑制乙醇对小鼠小脑PC损伤提供了新的见解，但是仍需更多的研究来全面揭示其在酒精性脑损伤发生、发展过程中的作用和意义。

作者贡献度说明：

张健：实验开展、数据分析、论文撰写；朱安娥：实验开展、查找文献；王承飞：病理石蜡切片；余欢欢：动物饲养、免疫组化染色；丁九阳：实验指导、论文修改；王杰：基金支持；汪元河：论文修改、基金支持；李茂娟：基金支持。

所有作者声明不存在任何利益冲突关系。

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