益气活血通络方药对双侧颈总动脉结扎术诱导的大鼠眼缺血综合征的影响及抗氧化机制

Effects and antioxidant mechanism of Yiqi Huoxue Tongluo Decoction on ocular ischemic syndrome induced by bilateral common carotid artery occlusion in rats

摘要

目的 观察益气活血通络方药（YHTD）对双侧颈总动脉结扎（bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO）术诱导大鼠眼缺血综合征（ocular ischemic syndrome，OIS）的保护作用，并探索其抗氧化机制。 方法 将40只雄性SD大鼠随机分为4组：假手术组、模型组、治疗组、对照组，每组各10只，假手术组大鼠仅分离颈总动脉，模型组、治疗组、对照组大鼠行BCCAO术。干预4周后，分别测量各组大鼠视网膜循环时间、视网膜神经细胞功能变化，光学、电子显微镜观察大鼠视网膜组织病理和超微结构改变，免疫法检测过氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）在视网膜的表达。 结果 与模型组相比，治疗组大鼠视网膜静脉充盈时间明显缩短（P<0.01），视网膜a、b波振幅升高、潜伏期缩短（P<0.05）；治疗组大鼠视网膜神经细胞排列整齐，各层神经细胞萎缩减轻；治疗组大鼠视网膜中SOD含量增加、MDA含量减少、iNOS表达下降（P<0.05）。 结论 YHTD通过改善大鼠视网膜血液循环和视网膜神经细胞功能，同时抑制氧化因子释放、下调iNOS蛋白表达从而发挥治疗OIS作用。

Abstract

Objective To observe the protective effects of Yiqi Huoxue Tongluo Decoction （YHTD） on ocular ischemic syndrome （OIS） induced by bilateral common carotid artery occlusion （BCCAO） in rats， and to explore its antioxidant mechanism. Methods A total of 40 male SD rats were randomly divided into four groups： the sham surgery group， the model group， the treatment group， and the control group， with 10 rats in each group. The sham surgery rats only had the common carotid artery isolated. Rat in the model， treatment， and control groups were operated by BCCAO. After 4 weeks of intervention， the retinal circulation time and the function of retinal nerve cells of rats were measured. The retinal histomorphology and ultrastructural changes were observed by light and electron microscopy. The expressions of superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA）， and inducible nitric oxide synthase （iNOS） in the retina were detected by immunoassays. Results Compare to the model group， retinal venous blood time in the treatment group was significantly shortened （P<0.01）. The retinal a and b wave amplitudes were increased， and latency was shortened （P<0.05）. The retinal nerve cells in rats of the treatment group were arranged in order and the atrophy was reduced. In the rats' retina of the treatment group， the level of SOD was increased， the level of MDA level was decreased， and the expression of iNOS were reduced （P<0.05）. Conclusions By improving retinal blood circulation and retinal nerve cell function， inhibiting the release of oxidation factor， and down‑regulating the expression of iNOS protein， YHTD exerts a therapeutic effect on OIS.

Graphical abstract

关键词

益气活血通络方药 / 眼缺血综合征 / 双侧颈总动脉结扎 / 氧化机制

Key words

Yiqi Huoxue Tongluo Decoction / Ocular ischemic syndrome / Bilateral common carotid artery occlusion / Oxidative mechanism

眼缺血综合征（ocular ischemic syndrome，OIS）属于眼部血液循环障碍或灌注不足性疾病范畴，是缺血性视神经病变、视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、新生血管性青光眼等眼病的重要病理基础^［1，2］。颈动脉狭窄或阻塞是其主要诱因^［3］。项目组前期研究结果显示^［4］，采用双侧颈总动脉结扎（bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO）术诱导的OIS动物模型与临床OIS具有相似的病理特征：大鼠眼球血流灌注量明显下降；大鼠鼠尾‑视网膜、视网膜动‑静脉充盈严重迟缓（10~20 s），同时眼底出现视网膜小出血、静脉扩张、毛细血管无灌注区等；在大鼠视网膜电流图上可呈现a、b波潜伏期明显延迟、振幅明显降低等表现；相应病理改变包括视网膜神经节细胞萎缩、凋亡，小胶质细胞增生活化等。缺血、缺氧微环境下超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和脂质过氧化物丙二醛（malondialdehyde，MDA）代谢失衡，加重氧自由基损伤，活性氧（reactive oxygen species，ROS）释放增加，通过介导一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）等途径参与视网膜氧化损伤机制^［5，6］。

OIS病因治疗包括颈动脉内膜切除术或颈动脉支架植入术^［7］；对症治疗如血管扩张剂、抗凝药、糖皮质激素和抗血管内皮生长因子等，但远期疗效不确切^［2］；部分研究报道采用中成药或针灸治疗OIS有一定疗效，但尚未阐明其作用机制^［8］。益气活血通络方药是团队临床长期治疗眼缺血综合征的经验方。项目组前期研究结果显示^［9］，采用益气活血通络方药治疗前部缺血性视神经病变（眼缺血综合征范畴），患者视力提高总有效率为69.51%，视野平均缺损值明显下降（P<0.05）。但是既往对益气活血通络方药干预眼缺血综合征的疗效机制阐述尚不充分。因此，本研究拟采用OIS大鼠模型，观察益气活血通络方药对OIS循环功能、神经功能、组织病理的影响，并探讨其药效和抗氧化机制，为中医药治疗OIS提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

本研究已获得我院实验动物伦理委员会批准（编号：170208）。实验选取成年雄性SD大鼠40只［北京华阜康，SCXK（京）2014‑0004］，饲养于我院SPF级中心实验室，饲养条件符合实验要求。

1.1.2 试剂与仪器

益气活血通络方药水煎液（黄芪、当归、红景天、桂枝、川芎、地龙，剂量比例为6∶3∶3∶1∶2∶1，浓度为1.1 g/mL）制作流程由我院制剂室提供；前列地尔注射液（PGE1）（批号：H10980023，北京泰德）；氨苄青霉素钠（批号：924H033，索莱宝），浓度50 mg/mL，过滤除菌后分装冻存；SOD与MDA检测试剂盒（批号：20170315、20170107，北京百诺威生物科技有限公司）；兔抗鼠诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）多克隆抗体（批号：AB15323，上海艾博抗）；荧光素钠注射液（批号：H20130649，爱尔康）。

照相系统（TRC‑501X，日本TOPCON公司）；电生理系统（RET Iport，德国 Roland Consult公司）；光学显微镜（BH‑2，日本OLYMPUS）；电子显微镜（H‑600，日本Hitachi）；图像分析系统（Image‑ Pro Plus 6.0，美国Media Cybernetics）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型建立

实验大鼠随机分为假手术（Sham）组、模型（BCCAO）组、治疗（BCCAO+YHTD）组、对照（BCCAO+PGE1）组，每组各10只。通过BCCAO法制备实验大鼠OIS模型，操作方法同项目组前期研究^［4］。术后给予氨苄青霉素钠肌肉注射连续3 d（50 mg/d）。大鼠清醒后分笼饲养，自由饮水和进食。

1.2.2 给药方法

造模后次日开始给药，给药时间固定每日上午8~10时，给药周期为4周。BCCAO+YHTD组参考徐叔云《药理实验方法学》^［10］附表11‑8“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值”，人与大鼠的换算系数为0.018，以大鼠200 g、成人70 kg为参考标准，成人每日中药生药用量共160 g/d，通过运算160 g×0.018/200 g=14.40，即大鼠给药量为14.40 g·kg^‑1·d^‑1，给药方法为灌胃。BCCAO+PGE1组的给药量和给药方法参考国内应用PGE1干预大鼠大脑中动脉闭塞模型的研究^［11］，给药量为2.5 μg·kg^‑1·d^‑1，给药方法为腹腔注射。BCCAO组和Sham组分别给予同等体积无菌水。

1.3 指标检测

1.3.1 鼠尾‑视网膜循环时间

每组随机选取8只大鼠分别行腹腔麻醉、散大瞳孔后，调整照相机镜头对准大鼠眼底视盘及周围区域，摄像视野30°，曝光度为50，拍摄彩色眼底照相和眼底无赤光图；鼠尾静脉注射10%荧光素钠注射液（40 mg/kg）后开始计时，连续拍摄眼底荧光血管造影图像，记录大鼠视网膜动脉、静脉充盈时间^［4］。

1.3.2 视网膜电流图

每组随机选取6只大鼠进行ERG检查。大鼠充分散瞳、表面麻醉后，将记录电极分别固定于大鼠双侧角膜表面，参考电极固定于大鼠双侧面颊，接地电极固定于大鼠尾部。行暗适应视网膜电图（electroretinograph，ERG）检测，观察ERG的a、b波潜伏期和振幅的变化，并进行a、b波形潜伏期和振幅的测量，获取图形和数据报告。

1.3.3 视网膜形态和超微结构观察

实验结束后，过量腹腔麻醉并腹主动脉取血后处死大鼠，迅速摘取一侧眼球，分离眼球，制作眼杯。制备石蜡组织切片，行H&E染色，观察视网膜各层组织结构；随机选取3个眼杯置于2.5%戊二醛内固定，取赤道部视网膜2 mm×2 mm组织脱水包埋，制作厚度为10 nm超薄切片，染色后于日立H‑600透射电子显微镜下观察视网膜超微结构。

1.3.4 SOD和MDA检测

摘取另一侧眼球，于冰块上平皿内分离视网膜，制作视网膜匀浆，3 000 r/min、4 ℃空间离心15 min后取上清液检测。参照试剂盒操作，比色法测定各组大鼠视网膜中SOD和MDA含量。

1.3.5 免疫组织化学法（EnVison法）检测iNOS蛋白表达

选择制备完成的石蜡组织切片，脱蜡透明后置于0.3% H₂O₂液中封闭内源性过氧化物酶，PBS缓冲液清洗，取50~100 μL 1∶200兔抗鼠iNOS抗体滴加于组织上，过夜后滴加1∶1 000羊抗兔二抗孵育1 h，清洗后DAB溶液显色，复染、脱水、透明后封片，观察并拍照。使用IPP 6.0软件测量阳性显色强度，并测量积分光密度，记录各组iNOS的平均光密度值。

1.4 统计学处理

采用SPSS 26.0统计软件进行分析，计量资料以\overline{x}\pm s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠视网膜血管充盈时间比较

与Sham组相比，所有BCCAO大鼠的鼠尾‑视网膜循环时间明显延长（P<0.01）；与BCCAO组相比，BCCAO+YHTD组和BCCAO+PGE1组经干预后的鼠尾‑视网膜静脉循环时间明显缩短（P<0.01），见图1、表1。

2.2 各组大鼠视网膜振幅和潜伏期比较

与Sham组相比，BCCAO组大鼠视网膜的a波和b波表现为振幅降低、潜伏期延长（P<0.01）；与BCCAO组相比，BCCAO+YHTD组和BCCAO+PGE1组a波和b波振幅升高（P<0.05），a波和b波潜伏期缩短（P<0.05），见表2、图2。

2.3 各组大鼠视网膜形态结构比较

光学显微镜下观察结果显示，Sham组大鼠视网膜各层细胞排列整齐、结构紧密，神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）层细胞器丰富；BCCAO组大鼠的视网膜神经纤维层、RCGs层、内核层、外核层、内丛状层、外丛状层、外界膜、感光细胞层有不同程度萎缩变薄，部分细胞核发生皱缩、裂解或空泡化，伴有染色质边集，细胞器肿胀变性，细胞间可见小胶质细胞（红色箭头），见图3A；BCCAO+YHTD组和BCCAO+PGE1组大鼠视网膜各层形态结构明显改善，见图3B~D。

2.4 各组大鼠视网膜SOD、MDA含量和iNOS蛋白阳性表达比较

2.4.1 SOD和MDA表达

与Sham组相比，BCCAO组大鼠视网膜中SOD含量下降、MDA含量上升（P<0.01）；与BCCAO组相比，BCCAO+YHTD组大鼠视网膜中SOD含量上升、MDA含量下降（P<0.05），见图4A、B。

2.4.2 iNOS表达

与Sham组相比，BCCAO组大鼠iNOS阳性表达明显升高（P<0.01）；与BCCAO组相比，BCCAO+YHTD组、BCCAO+PGE1组大鼠的iNOS阳性表达明显减少（P<0.05）。iNOS阳性表达呈棕黄色或棕褐色，主要集中在RCGs层、神经纤维层、内丛状层、外丛状层和感光细胞层等；BCCAO组iNOS在视网膜多层内广泛表达，Sham组RCGs层可见少量iNOS表达；BCCAO+YHTD组在RCGs层和感光细胞层有iNOS表达，见图4C、图5。

3 讨论

颈动脉狭窄或闭塞导致视网膜低灌注损伤是OIS不同表型发生的共同病理基础。前期研究已证实BCCAO大鼠模型具有相似的OIS病理特征^［4］。视网膜血流灌注量下降引起组织缺血、缺氧，ROS释放增加，与感光细胞外节中的不饱和脂肪酸产生反应，导致SOD下调、MDA蓄积，以及视网膜小胶质细胞过度增生活化导致iNOS被激活，释放大量一氧化氮^{［12，13］}，是视网膜氧化损伤的重要环节^{［14，15］}。本次研究结果显示，OIS大鼠视网膜中SOD下降、MDA上升、iNOS高表达，提示了视网膜中氧自由基的过剩和严重的氧化损伤。益气活血通络方药可以有效促进视网膜血液循环、提高神经细胞传导功能及改善神经细胞微观结构，同时抑制氧化因子释放、下调iNOS蛋白水平而发挥抗氧化作用。

OIS归属于中医“视瞻昏渺”范畴，或合并“络损暴盲”、“目系暴盲”等眼病。其主要病机为气虚血运不畅，目络瘀阻失养，神光发越无能，终致目无所视。依据中医“异病同治”和“整体辨证”理论，并结合长期临床应用经验，团队归纳总结出“气虚血瘀络阻”是OIS的核心病机；气行则血行，目受血而能视，“益气活血通络”治则是针对OIS病机实质的有效辨治。益气活血通络方药由黄芪、当归、红景天、桂枝、川芎、地龙组成。其中黄芪为君，当归、红景天为臣药，重在补益气血，以增强视网膜血流灌注量；桂枝可以温通经脉，推动五脏六腑之精气上注于目；川芎、地龙为行血要药，方中佐以川芎、地龙可加强活血通络作用。

团队前期研究中发现，黄芪和桂枝配伍可以增强大鼠视网膜毛细血管内皮细胞间紧密连接蛋白的表达，减轻视网膜微血管内皮损伤、降低毛细血管通透性，从而保护血‑视网膜屏障功能^［16］。研究报道，黄芪有效成分黄芪甲苷可以降低脑缺血大鼠MDA和NOS的活性^［17］，配伍当归有效成分蒿本内酯具有抑制大鼠神经细胞氧化损伤的作用^［18］。红景天属于常用的中药抗氧化剂，通过抑制NO释放和NOS活化，进而阻止大鼠视网膜神经细胞损害^［19］。川芎、地龙多次被证实在促进视网膜微循环中发挥关键作用^{［20，21］}。因此，诸药配伍组成的益气活血通络方药通过有效增加SOD活性、减少MDA蓄积，逆转SOD/MDA比例失调，降低iNOS表达等途径发挥抗氧化作用。

综上所述，本研究从视网膜血管功能、神经细胞功能、细胞超微结构保护和抗氧化机制等方面探讨了益气活血通络方药干预OIS的作用。结果表明，益气活血通络方药可以明显促进视网膜血液循环和提高神经细胞兴奋性，其机制可能与调节视网膜内SOD和MDA动态平衡、抑制氧化因子释放、下调iNOS蛋白表达等有关。其他靶向机制还需进一步深入研究。

作者贡献度说明：

金明、庞龙：设计和指导；秦亚丽、秦霖：完成实验和数据分析，并撰写论文。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家重点研发计划资助项目(2017YFB1002305)