miR⁃296⁃3p通过靶向ZBTB20抑制HSC⁃T6细胞的活化

miR⁃296⁃3p inhibits the avtivation of HSC⁃T6 cell by targeting ZBTB20

摘要

目的 探讨miR⁃296⁃3p通过靶向锌指和BTB结构域蛋白20（BTB domain⁃containing protein 20，ZBTB20）对大鼠肝星状细胞HSC⁃T6活化的调控作用。 方法 采用qRT⁃PCR检测经过转化生长因子⁃β1（transforming growth factor⁃β1，TGF⁃β1）刺激的大鼠肝星状细胞HSC⁃T6中纤维化标志物和miR⁃296⁃3p的表达水平；利用脂质体转染法将miR⁃296⁃3p mimic/inhibitor及各自的对照转染到HSC⁃T6细胞中，分组为：mimic NC组、miR⁃296⁃3p mimic组、inhibitor组和miR⁃296⁃3p inhibitor组，并且通过qRT⁃PCR、Western Blot、CCK⁃8、集落形成和Transwell实验检测转染miR⁃296⁃3p mimic/inhibitor后对HSC⁃T6细胞活化能力的影响；利用生物信息学方法预测miR⁃296⁃3p的候选靶基因，并用双荧光素酶基因报告实验进行验证；qRT⁃PCR和Western blot实验检测miR⁃296⁃3p与候选靶基因ZBTB20之间的靶定关系；qRT⁃PCR、CCK⁃8及Transwell实验分析pcDNA3.1⁃ZBTB20能否逆转miR⁃296⁃3p+mimics对HSC⁃T6细胞活化能力的抑制作用。 结果 HSC⁃T6细胞被TGF⁃β1刺激后进一步活化，并且活化的细胞中的miR⁃296⁃3p表达水平下调；miR⁃296⁃3p抑制HSC⁃T6的增殖、迁移，降低肝纤维化标志物I型胶原蛋白（Col1A1）和α⁃平滑肌肌动蛋白（α⁃SMA）的表达水平；通过生物信息学数据库预测以及双荧光素酶基因报告实验验证显示ZBTB20是miR⁃296⁃3p的功能靶基因，并且在HSC⁃T6中miR⁃296⁃3p负调控ZBTB20的表达；过表达ZBTB20可以部分逆转过表达miR⁃296⁃3p对HSC⁃T6活化的抑制作用。 结论 miR⁃296⁃3p通过靶向抑制ZBTB20的表达从而抑制HSC⁃T6细胞的进一步活化。

Abstract

Objective To investigate the role of miR⁃296⁃3p in the regulation of HSC⁃T6 activation in rat hepatic stellate cells by targeting zinc finger and BTB domain⁃containing protein 20 （ZBTB20）. Methods The expression levels of fibrosis markers and miR⁃296⁃3p in rat hepatic stellate cells HSC⁃T6 stimulated by transforming growth factor⁃β1（TGF⁃β1）were detected by qRT⁃PCR. The miR⁃296⁃3p mimic/inhibitor and their respective controls were transfected into HSC⁃T6 cells using liposome transfection， respectively.There were mimic NC group， miR⁃296⁃3p mimic group， inhibitor group and miR⁃296⁃3p inhibitor group. The effects of miR⁃296⁃3p on the activation ability of HSC⁃T6 cells were detected by qRT⁃PCR， Western Blot， CCK⁃8， colony formation， and Transwell assays. After transfection with miR⁃296⁃3p mimic/inhibitor， the candidate target genes of miR⁃296⁃3p were predicted by bioinformatics methods and validated with dual luciferase gene reporter assay. qRT⁃PCR and Western Blot experiments were performed to detect the binding relationship between miR⁃296⁃3p and the candidate target gene ZBTB20. qRT⁃PCR， CCK⁃8 and Transwell assays were performed to analyse whether pcDNA3.1⁃ZBTB20 could reverse the inhibitory effect of miR⁃296⁃3p+mimics on the activation ability of HSC⁃T6 cells. Results HSC⁃T6 cells were further activated by TGF⁃β1 stimulation， and the expression level of miR⁃296⁃3p was down⁃regulated in activated cells. miR⁃296⁃3p inhibited the proliferation and migration of HSC⁃T6， and decreased the expression level of hepatic fibrosis markers， collagen type I （Col1A1） and α⁃smooth muscle actin （α⁃SMA）. The bioinformatics database prediction and the verification of the double luciferase gene reporter assay showed that ZBTB20 was a functional target gene of miR⁃296⁃3p and that miR⁃296⁃3p negatively regulates ZBTB20 expression in HSC⁃T6. ZBTB20 could partially reverse the inhibitory effect of miR⁃296⁃3p on HSC⁃T6 activation. Conclusion miR⁃296⁃3p inhibits further activation of HSC⁃T6 cells by targeting and inhibiting ZBTB20 expression.

Graphical abstract

关键词

miR⁃296⁃3p / ZBTB20 / HSC⁃T6细胞 / 肝纤维化 / 增殖 / 迁移

Key words

MiR⁃296⁃3p / ZBTB20 / HSC⁃T6 cells / Hepatic fibrosis / Proliferation / Migration

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是一个动态发展过程，其特征是肝脏内慢性肝损伤引起过量的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）积累^［1］。HF的发生主要由肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的激活主导，从而使肝脏瘢痕组织形成^［2］。随着肝组织损伤程度加重，肝纤维化可进展为不可逆的肝硬化以及死亡率更高的肝细胞癌^［3］。因此，HSCs与细胞通路中重要的细胞因子仍然是治疗HF的研究热点，对HF的发病机制和治疗具有重要意义。

微小RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一类长度约为22个核苷酸的小RNA分子，miRNAs可以通过与靶基因的3'非翻译区（3'UTR）结合，以抑制其翻译或诱导其降解^［4］。miRNAs控制生物过程，如细胞分裂、细胞分化、血管生成、细胞凋亡和肿瘤发生^［5，6］。多种miRNAs可用作癌症生物标志物和癌症治疗，并且有望成为早期癌症检测的生物标志物^［7，8］。现有文献报道，miR⁃296⁃3p在正常细胞中高表达，而在癌细胞系中低表达，过表达miR⁃296⁃3p可增加胰腺癌细胞和甲状腺癌细胞放射敏感性^［9］。另外，miRNAs通过调控激活肝星状细胞、胶原蛋白合成以及炎症反应等多个方面影响肝脏纤维化的发生、发展^［10］。在急性心肌梗死患者中与炎症相关的miRNAs如miR⁃296⁃3p、miR⁃17⁃3p和miR⁃101⁃3p的表达水平明显下调^［11］。经过往文献报道，锌指和BTB结构域蛋白20（Zinc finger and BTB domain protein 20，ZBTB20）作为一种转录因子，参与细胞周期控制和炎症反应的调节。ZBTB20具有调节细胞分化代谢、神经发育、免疫反应和炎症等生理作用，参与调控肝细胞癌、胃癌、中枢神经系统癌症以及血癌等多种癌症的致病机制^［12］。课题组前期研究结果提示miR⁃296⁃3p能够抑制BDL胆总管结扎大鼠的肝纤维化进程。然而，miR⁃296⁃3p与ZBTB20在肝星状细胞HSC⁃T6中的关系尚不明确。为此，本文将探究miR⁃296⁃3p如何通过调控ZBTB20对HSC⁃T6细胞产生影响。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠肝星状细胞系（HSC⁃T6）购自湖南丰晖生物科技有限公司。DMEM高糖细胞培养基、青霉素⁃链霉素（P/S）混合液、胰蛋白酶（含0.02%EDTA）、CCK⁃8试剂购自北京中生奥邦生物科技有限公司，胎牛血清（FBS）购自武汉普诺赛生命科技有限公司，TGF⁃β1购自美国BI公司，Lipofectamine2000、Trizol总RNA提取试剂购于美国Thermo公司，ZBTB20兔多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，逆转录及qRT⁃PCR试剂盒购自北京聚合美生物科技有限公司，Col1A1兔单克隆抗体、α⁃SMA和GAPDH鼠单克隆抗体购自中国Affinity公司，质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，BCA蛋白定量测定试剂盒购自上海雅酶生物科技有限公司，一步法SDS⁃PAGE凝胶快速制备试剂盒购自北京博泰斯生物技术有限公司，PMSF（蛋白酶抑制剂）购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，ECL发光液、10×电转和电泳缓冲液、羊抗兔/鼠二抗购自北京普利莱基因技术有限公司，Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit试剂盒购自上海碧云天有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

HSC‑T6细胞在10%FBS、1%P/S和DMEM高糖配置的完全培养基中培养。培养条件为37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱，每隔2~3 d用含有0.02% EDTA胰蛋白酶进行消化后按照1∶3~1∶4的比例传代。将HSC⁃T6细胞按照1×10⁶个/孔的密度接种至6孔板，随后用含有10 ng/mL的TGF⁃β1刺激48 h后进一步活化。

1.2.2 细胞转染

将处于对数生长期的HSC⁃T6细胞按照1×10⁶个/孔的密度接种至6孔板，按照脂质体Lipofectamine 2000试剂说明书进行转染，分别配置A液（245 μL DMEM培养基和5 μL Lip 2000）和B液（245 μL DMEM培养基和5 μL各组对应的质粒），混匀后静置5 min；等体积的A液与B液混合，静置15 min待用。以未处理的HSC⁃T6细胞作为对照组，将mimic NC、miR⁃296⁃3p mimic、inhibitor NC和miR⁃296⁃3p inhibitor分别转染到HSC⁃T6细胞作为mimic NC组、miR⁃296⁃3p mimic组、inhibitor NC组和miR⁃296⁃3p inhibitor组。挽救实验部分分成mimic NC+pcDNA3.1组、miR⁃296⁃3p mimic+pcDNA3.1组、mimic NC+pcDNA3.1⁃ZBTB20组和miR⁃296⁃3p mimic+pcDNA3.1⁃ZBTB20组。转染4~6 h后弃原液，每孔加入2 mL无双抗培养基继续培养用于后续实验。

1.2.3 生物信息学网站筛选靶基因

利用生物信息学网站DIAIA Tools（https：//dianalab.e-ce.uth.gr/）、miRDB（http：//mirdb.org/）和TargetScan（https：//www.targetscan.org/）预测miR⁃296⁃3p可能的下游靶基因，取3个数据库的交集靶基因形成韦恩图。

1.2.4 双荧光素酶基因报告实验

首先构建ZBTB20⁃3'UTR⁃wt（野生型）和ZBTB20⁃3'UTR⁃mut（突变型）质粒。质粒ZBTB20⁃3'UTR⁃wt含有与miR⁃296⁃3p序列互补的野生型ZBTB20 mRNA 3′UTR，质粒ZBTB20⁃3'UTR⁃mut含有与miR⁃296⁃3p序列互补的突变型ZBTB20 mRNA 3′UTR。质粒转染浓度为200 ng/孔，miR⁃296⁃3p mimic或mimic NC转染浓度为40 nmol/L/孔，每组3个复孔。转染48 h后参照试剂盒说明书检测各组细胞的荧光素酶活性。

1.2.5 CCK⁃8实验

转染48 h后的细胞胰酶消化后离心计数，按照2.5×10³个/100 μL的细胞密度接种于96孔板中，每组设置3个复孔，在培养的第24、48、72、96 h时，每孔加入110 μL CCK⁃8工作液（培养基与CCK⁃8试剂按照10∶1的比例混合），37 ℃温箱孵育2 h，使用酶标仪检测450 nm波长下的OD值。

1.2.6 集落形成实验

转染48 h后的细胞胰酶消化后离心计数，按照1×10³个/500 μL的细胞密度接种于6孔板中，每组3个复孔，37 ℃温箱培养，3 d更换1次培养基，7~10 d镜下观察到细胞团中细胞个数>50个时终止培养，结晶紫染色后白色背景下拍照记录图片信息。

1.2.7 Transwell实验

转染48 h后的细胞胰酶消化后离心计数，将完全培养基更换为DMEM培养基（不含FBS），按照1×10⁵个/150 μL的细胞密度接种于Transwell小室，将小室置于24孔板中，每组3个复孔，37 ℃温箱培养24 h后结晶紫染色，置于倒置显微镜下观察并记录图片信息。

1.2.8 qRT⁃PCR

各组细胞转染48 h后，使用Trizol试剂提取各组细胞总RNA，参照逆转录试剂盒说明书进行RNA逆转录合成cDNA，表达数据统一标准化为内参U6，qRT⁃PCR的反应条件为：95 ℃，30 s，循环1次；95 ℃，5 s→60 ℃，34 s，循环40次。计算公式：相对表达比率（relative expression ratio）=2^⁃ΔΔCt。记录并分析实验数据制作图表。实验重复3次，引物见表1。

1.2.9 Western Blot实验

各组细胞转染48 h后，PBS清洗2遍，使用RIPA裂解液冰上裂解30 min，置于低温离心机中离心15 min（12 000 r/min，4 ℃），取上清进行BCA蛋白定量。首先电压为80 V，Marker到达下层分离胶时电压调整为110 V，直到电泳至槽底端时关闭电源。电流调至180 mA，电压最大，在冰上电转90 min，将胶上的目的蛋白转到PVDF膜上。5%脱脂奶粉中室温封闭2 h。1×TBST洗涤之后，一抗（α⁃SMA、Col1A1、ZBTB20）孵育盒中4 ℃冰箱过夜。第2天1×TBST洗涤条带，放入二抗孵育盒中室温孵育2 h。ECL显影液（避光）滴加至膜表面，显影仪中曝光，记录条带信息。

1.3 统计学处理

使用SPSS 19.0软件进行统计学分析，数据使用\overline{x}\pm s表示。2组间比较使用独立样本t检验，多组间比较使用单因素方差分析。运用Graphpad Prism 8.0绘制统计图表，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR⁃296⁃3p在活化的HSC⁃T6细胞中表达下调

利用qRT⁃PCR、Western blot检测TGF⁃β1刺激HSC⁃T6细胞中纤维化标志物的表达水平，与control组相比，TGF⁃β1组细胞中α⁃SMA、Col1A1和CTGF mRNA表达水平以及α⁃SMA和Col1A1蛋白表达水平上调（P<0.05），见图1。提示HSC⁃T6细胞被TGF⁃β1进一步激活。与control组相比，TGF⁃β1组细胞中miR⁃296⁃3p表达水平下调（P<0.000 1），见图2。

2.2 miR⁃296⁃3p 转染有效性检测

将miR⁃296⁃3p mimic/inhibitor及其各自对照组转染入HSC⁃T6细胞中。qRT⁃PCR显示，转染miR⁃296⁃3p mimic/inhibitor后，miR⁃296⁃3p在HSC⁃T6细胞中的表达分别升高或降低（P<0.001），见图3。结果表明，miR⁃296⁃3p mimic和miR⁃296⁃3p inhibitor有效转染到HSC⁃T6细胞。

2.3 miR⁃296⁃3p抑制HSC⁃T6细胞的增殖能力

采用CCK⁃8和集落形成实验检测转染miR⁃296⁃3p mimic/inhibitor及其各自对照后细胞增殖能力的变化。实验结果显示，miR⁃296⁃3p mimic组的细胞增殖能力在转染96 h后明显低于mimic NC组，且与mimic NC组相比，细胞集落个数明显减少。相反，miR⁃296⁃3p inhibitor组的细胞增殖能力在转染96 h后明显高于inhibitor NC组，且与inhibitor NC组相比，细胞集落个数增加（P<0.05），见图4。结果表明，miR⁃296⁃3p抑制HSC⁃T6细胞的增殖能力。

2.4 miR⁃296⁃3p抑制HSC⁃T6细胞的迁移能力

采用Transwell实验检测转染miR⁃296⁃3p mimic/inhibitor及其各自对照后细胞迁移能力的变化。实验结果显示，与mimic NC组相比，miR⁃296⁃3p mimic组中细胞迁移数明显减少；相反，转染miR⁃296⁃3p inhibitor后，HSC⁃T6细胞迁移数明显增加（P<0.001），见图5。结果表明，miR⁃296⁃3p抑制HSC⁃T6细胞的迁移能力。

2.5 miR⁃296⁃3p抑制HSC⁃T6细胞活化

qRT⁃PCR和Western Blot实验检测miR⁃296⁃3p对HSC⁃T6细胞中的纤维化标志物的表达水平。结果显示，与mimic NC组相比，miR⁃296⁃3p mimic组的α⁃SMA、Col1A1和CTGF mRNA表达水平以及α⁃SMA、Col1A1蛋白表达水平下调（P<0.05），见图6；而与inhibitor NC组相比，miR⁃296⁃3p inhibitor组的α⁃SMA、Col1A1和CTGF mRNA表达水平以及α⁃SMA、Col1A1蛋白的表达水平上调（P<0.05），见图7。

2.6 ZBTB20是miR⁃296⁃3p的功能靶基因

通过生物信息学miRNA靶标预测工具（DIANA、miRDB和Targetscan）预测miR⁃296⁃3p的可能靶基因，3个数据集取交集后最终得到5个候选靶基因：JOSD1、ETF1、TNPO1、STRN3和ZBTB20，见图8A。qRT⁃PCR检测mimic NC组和miR⁃296⁃3p mimic组HSC⁃T6细胞中5个候选靶基因的表达情况。结果显示，与mimic NC组相比，miR⁃296⁃3p mimic组中5个候选靶基因的表达水平下调，其中ZBTB20下调程度最为明显（P<0.001），见图8B。查阅文献发现ZBTB20与肝脏疾病相关。

利用TargetScan网站查询并绘制miR⁃296⁃3p与ZBTB20之间的结合位点，见图9A。双荧光素酶报告基因实验分析结果表明，与ZBTB20⁃3'UTR⁃WT+mimic NC组相比，ZBTB20⁃3'UTR⁃WT+miR⁃296⁃3p mimic组中荧光素酶活性明显降低（P<0.05）；与ZBTB20⁃3'UTR⁃MUT+mimic NC相比，ZBTB20⁃3'UTR⁃MUT+miR⁃296⁃3p mimic组中荧光素酶的活性未发生明显改变（P>0.001），见图9B。上述结果说明ZBTB20是miR⁃296⁃3p的功能靶基因。

2.7 miR⁃296⁃3p抑制ZBTB20的表达

qRT⁃PCR和Western blot结果表明，与mimic NC组相比，miR⁃296⁃3p mimic组HSC⁃T6细胞中ZBTB20 mRNA和蛋白表达水平下调（P<0.05），见图10A~C。与inhibitor NC组相比，miR⁃296⁃3p inhibitor组HSC⁃T6细胞中ZBTB20 mRNA和蛋白表达水平上调（P<0.05），见图10D~F。结果提示，miR⁃296⁃3p负调控ZBTB20 mRNA和蛋白的表达。

2.8 ZBTB20部分逆转miR⁃296⁃3p对HSC⁃T6细胞增殖的抑制作用

CCK⁃8实验结果显示，在转染72 h后，与转染mimic NC+pcDNA3.1相比，转染miR⁃296⁃3p mimic+pcDNA3.1抑制HSC⁃T6细胞的增殖；转染mimic NC+pcDNA3.1⁃ZBTB20则促进HSC⁃T6细胞的增殖能力（P<0.05）。与转染miR⁃296⁃3p mimic+pcDNA3.1抑制HSC⁃T6细胞的增殖能力相比，miR⁃296⁃3p mimic和pcDNA3.1⁃ZBTB20共同转染的HSC⁃T6细胞增殖能力被ZBTB20部分促进；与转染mimic NC+pcDNA3.1⁃ZBTB20促进细胞的增殖能力相比，miR⁃296⁃3p mimic和pcDNA3.1⁃ZBTB20共同转染的HSC⁃T6细胞增殖能力被miR⁃296⁃3p部分抑制（P<0.05），见图11。上述结果说明，过表达ZBTB20部分逆转miR⁃296⁃3p对HSC⁃T6细胞增殖能力的抑制作用。

2.9 ZBTB20部分逆转miR⁃296⁃3p对HSC⁃T6细胞迁移的抑制作用

Transwell实验结果显示，与转染mimic NC+pcDNA3.1相比，转染miR⁃296⁃3p mimic+pcDNA3.1抑制HSC⁃T6细胞的迁移能力；转染mimic NC+pcDNA3.1⁃ZBTB20则促进HSC⁃T6细胞的迁移能力（P<0.05）。与转染miR⁃296⁃3p mimic+pcDNA3.1抑制HSC⁃T6细胞的迁移能力相比，miR⁃296⁃3p mimic和pcDNA3.1⁃ZBTB20共同转染的HSC⁃T6细胞迁移能力被ZBTB20部分促进；与转染mimic NC+pcDNA3.1⁃ZBTB20促进HSC⁃T6细胞的迁移能力相比，miR⁃296⁃3p mimic和pcDNA3.1⁃ZBTB20共同转染的HSC⁃T6细胞迁移能力被miR⁃296⁃3p部分抑制（P<0.05），见图12。上述结果说明，过表达ZBTB20部分逆转miR⁃296⁃3p对HSC⁃T6细胞迁移能力的抑制作用。

2.10 ZBTB20部分逆转miR⁃296⁃3p对HSC⁃T6细胞活化及ZBTB20表达的抑制

qRT⁃PCR结果显示，HSC⁃T6细胞中过表达miR⁃296⁃3p可抑制其α⁃SMA、Col1A1和CTGF的mRNA表达；与转染miR⁃296⁃3p mimic+pcDNA3.1组相比，miR⁃296⁃3p mimic与pcDNA3.1⁃ZBTB20组的HSC‑T6细胞中α‑SMA、Col1A1和CTGF mRNA表达上调，说明ZBTB20部分逆转miR⁃296⁃3p对纤维化标志物表达的抑制（P<0.05），见图13A~C。

qRT⁃PCR和Western blot结果显示，HSC⁃T6细胞中过表达miR⁃296⁃3p可抑制ZBTB20的mRNA和蛋白表达；与转染miR⁃296⁃3p mimic+pcDNA3.1组相比，miR⁃296⁃3p mimic与pcDNA3.1⁃ZBTB20组的HSC⁃T6细胞中ZBTB20的mRNA和蛋白表达水平上调，说明ZBTB20部分逆转miR⁃296⁃3p对ZBTB20表达的抑制（P<0.05），见图13 D~F。

3 讨论

纤维化是组织修复反应的结果，在慢性炎症性疾病期间，组织修复反应会失调^［13］。肝纤维化是由多种病因如饮酒、药物及病毒等导致肝脏内的结缔组织异常增多，释放炎症和生长因子使HSCs向肌成纤维细胞转变，以及细胞外基质蛋白堆积^［14］。越来越多的证据表明，大量的miRNAs参与HSC的活化和巨噬细胞的极化分泌功能，从而调节HF的进展。miR⁃296⁃3p在免疫调控以及多种疾病中扮演着重要角色。在牙髓来源的牙髓干细胞的成骨/牙源性分化中，低表达的miR⁃296⁃3p抑制牙髓干细胞向成骨细胞分化，从而抑制成骨过程^［15］。在结核感染中，尼古丁通过抑制miR⁃296⁃3p和巨噬细胞中SIRPα的表达，减弱巨噬细胞的吞噬作用^［16］。在妊娠糖尿病患者中，miR⁃296⁃3p低表达并形成lncRNA⁃MEG8/miR⁃296⁃3p轴靶向调节胰岛素信号传导、葡萄糖代谢和炎症反应相关的基因^［17］。此外，miR⁃296⁃3p在胶质瘤表现出低表达，通过调节circHECTD1/miR⁃296⁃3p/SLC10A7轴有效抑制胶质瘤的侵袭性和发展^［18］。本研究利用TGF⁃β1诱导的肝纤维化细胞模型，在活化的HSC⁃T6细胞中miR⁃296⁃3p表达下调，且细胞中纤维化标志物α⁃SMA、Col1A1 mRNA和蛋白表达水平以及CTGF mRNA表达水平上调。过表达miR⁃296⁃3p抑制HSC⁃T6细胞的增殖和迁移能力，以及纤维标志物α⁃SMA、Col1A1 mRNA的表达；相反，降低miR⁃296⁃3p的表达促进HSC⁃T6细胞的增殖和迁移能力，以及纤维标志物α⁃SMA、Col1A1 mRNA的表达，以上结果证实miR⁃296⁃3p抑制HSC⁃T6细胞活化。然而，目前miR⁃296⁃3p在HF中调控机制尚不完全清楚。

ZBTB20是转录因子家族中重要一员，具有N端的BTB/POZ结构域和C端的DNA结合锌指结构域，介导蛋白⁃蛋白间的相互作用。炎症反应促进纤维化因子的分泌从而促进HF的发展^［19］，ZBTB20的表达与炎症途径NF⁃κB/IκBa相关，即过表达ZBTB20降低IκBα水平并且增加磷酸化NF⁃κB的水平^［20］。在慢性自发性荨麻疹中，高表达的ZBTB20可能激活肥大细胞，从而调控细胞免疫反应^［21］。敲除ZBTB20可降低M1极化，抑制促炎因子，抑制线粒体裂变，降低ox⁃LDL诱导的巨噬细胞氧化应激水平^［22］。在肝细胞中过表达ZBTB20和转化相关蛋白失活可诱导肝肥大、WNT/CTNNB1信号激活和肝肿瘤的发展^［23］。另外，有研究揭示ZBTB20参与肿瘤免疫，敲除ZBTB20可增强CD8⁺细胞毒性T细胞的抗肿瘤活性^［24］。HBV可以整合到ZBTB20基因中，并且在肝细胞癌患者中观察到整合与ZBTB20表达之间存在关联^［25］。以上表明，过表达ZBTB20通常与恶性肿瘤表型有关。此外，ZBTB20是小鼠肝脏再生中EGFR表达和肝细胞增殖的关键调节因子，并可能作为肝脏再生临床环境中的潜在治疗靶点^［26］。在基因表达调控的经典方式中，miRNAs与靶mRNA的3'UTR结合以调节靶基因表达^［27］。miR⁃296⁃3p通过靶向CEMIP使Wnt/β⁃catenin和PI3K/AKT通路失活，促进子痫前期的进展^［28］。在乳腺癌中，miR⁃634与ZBTB20的3'UTR结合并降低其mRNA水平^［29］。另外，circRNA通过对miR⁃876⁃3p的抑制作用促进ZBTB20的表达，进而加快乳腺癌的进展^［30］。同样，在AML细胞系中ZBTB20以类似的方式分别受到circ⁃SFMBT2/miR⁃582⁃3p和Hsa_circ_0003602/miR⁃502⁃5p/IGF1R轴的调控^{［31，32］}。综上所述，不同的非编码RNA可以直接或间接调控ZBTB20的表达，加快恶性肿瘤生长。然而miR⁃296⁃3p和ZBTB20在HSC⁃T6细胞中发挥的作用的关系尚不明确。

本研究通过生物信息学miRNA靶标预测工具发现miR⁃296⁃3p具有锌指和BTB结构域的互补结合序列。经过双荧光素酶基因报告实验证实，ZBTB20是miR⁃296⁃3p的功能靶基因。为了明确miR⁃296⁃3p是否靶向ZBTB20调控HSC⁃T6细胞活化。本研究通过转染miR⁃296⁃3p mimic和miR⁃296⁃3p inhibitor到HSC⁃T6细胞中，结果过表达/降低miR⁃296⁃3p分别下调/上调ZBTB20 mRNA和蛋白的表达。随后设计挽救实验，将miR⁃296⁃3p mimic和pcDNA3.1⁃ZBTB20分别转染到HSC⁃T6细胞中。结果表明，miR⁃296⁃3p对HSC⁃T6细胞活化抑制作用被过表达ZBTB20成功逆转。综上所述，miR⁃296⁃3p靶向ZBTB20发挥抑制HSC⁃T6细胞活化的作用，其参与抑制肝纤维化发生、发展的机制可能与调控细胞增殖、迁移能力有关，本文为探索miR⁃296⁃3p的抗肝纤维化作用机制提供了新思路。

作者贡献度说明：

周静：实验设计，实验操作，数据整理及分析，论文撰写；李以恒：部分数据及图片收集整理；李尹凡：部分实验操作、数据收集；崔笑妍、王梅梅：辅助实验操作；张荣花：文章修改；刘志勇：论文撰写指导；章广玲：指导实验设计，提供经费支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

河北省自然科学基金资助项目(H2023209047)

河北省教育厅在读研究生创新能力培养资助项目(CXZZSS2024056)