HAMA增强GelMA的可打印性能应用于数字光处理3D打印骨支架的研究

Research on the application of HAMA enhanced GelMA printable performance on digital light processing 3D printing bone scaffolds

摘要

目的 通过甲基丙烯酸酯化透明质酸（hyaluronic acid methacrylate，HAMA）增强GelMA的可打印性能，用于光固化3D打印机制备高精度生物支架。 方法 基于GelMA中加入不同浓度的HAMA，通过将不同浓度和配比的水凝胶墨水进行3D打印，观察各个打印结果的情况。通过对所打印支架的力学测试和杨氏模量计算，了解HAMA对GelMA在机械性能方面的作用。通过降解实验了解HAMA对GelMA墨水降解的影响，了解其对结构稳定性的作用。对各组支架进行了CCK‑8、活/死染色和细胞骨架实验，检验各组水凝胶材料的生物相容性。 结果 通过调节组分的配比，优化了墨水的可打印性和高保真性，配制出适合数字光处理3D打印的水凝胶墨水。HAMA增加了GelMA硬度，提高了可打印性，减缓了支架的降解速率，证明了GelMA‑HAMA杂化水凝胶获得了更好的可打印性能，同时具备良好的生物相容性。 结论 HAMA从机械性能方面和结构稳定性方面促进了GelMA水凝胶的可打印性，为复杂的生物结构的精准打印提供了新思路。

Abstract

Objective To enhance the printable performance of GelMA through hyaluronic acid methacrylate （HAMA） and use it in the photocuring 3D printing mechanism to prepare high‑precision biological scaffolds. Methods Based on adding different concentrations of HAMA in GelMA， 3D printing was performed by using hydrogel inks with different concentrations and ratios. The situations of each printing result were observed. Through mechanical testing and Young's modulus calculation of the printed scaffolds， the effect of HAMA on the mechanical properties of GelMA was studied. Through degradation experiments， the influence of HAMA on the degradation of GelMA ink was investigated and its effect on structural stability was studied. CCK‑8， live/dead staining， and cytoskeleton experiments were carried out on each group of scaffolds to test the biocompatibility of hydrogel materials in each group. Results By adjusting the ratio of components， the printability and high fidelity of the ink were optimized， and a hydrogel ink suitable for digital light processing 3D printing was prepared. HAMA increased the hardness of GelMA， improved the printability， and slowed down the degradation rate of the scaffold. It was proved that GelMA‑HAMA hybrid hydrogel obtained better printability performance while having good biocompatibility. Conclusion HAMA promotes the printability of GelMA hydrogel in terms of mechanical properties and structural stability， providing a new idea for the precise printing of complex biological structures.

Graphical abstract

关键词

水凝胶 / HAMA / GelMA / 3D打印 / 可打印性

Key words

Hydrogel / HAMA / GelMA / 3D printing / Printability

临床上由于各种原因导致的皮肤组织损伤、骨骼组织损伤和神经血管损伤等问题一直存在，往往容易进一步发展为感染或者损伤部位修复效果不佳等问题，严重影响患者的生活质量^［1‑3］。大面积的骨组织缺损导致难以修复问题一直是临床实践中具有挑战性的难题。临床中选择最广泛的解决办法为自体骨移植和异体骨移植治疗，及金属骨取代物治疗^［4］。但是自体骨有限，且操作过程复杂、手术切口大，异体骨替代物存在免疫排斥及易感染的缺点^［5，6］，而金属取代物因缺乏生物活性则容易导致骨整合困难甚至出现感染等风险^［7，8］。在我国，患者因骨创伤后愈合不良和康复受损并发运动功能受限问题一直存在，病例已达1 000万^［9，10］。同时随着老龄化人口上升带来的骨发病率日益加重，对修复骨缺损部位的骨替代品材料需求不断增长，给患者及临床诊疗工作造成了巨大的负担^{［11，12］}。为了缓解临床上面对骨修复难题的治疗压力，专家学者开发了具有三维空间结构的水凝胶材料，其具备模拟体内环境外基质的特性，以及良好的生物相容性，被组织工程证明为适合体内植入的生物材料^{［13，14］}。近年来，利用3D打印技术将水凝胶材料设计成个体化支架用于各种组织填充的案例不计其数^{［15‑19］}，其中应用最为广泛的是GelMA^{［20，21］}。

多年以来，人水凝胶支架在促进骨组织愈合方面的研究备受业界关注，如使用可注射水凝胶将缺损部位封闭促进骨组织再生^{［22‑24］}。当前的再生工程研究指出，支架的血管化作用同样重要^［25］，于是制备出精细的多孔结构支架对血管化研究尤为重要。

数字光处理（digital light processing，DLP）打印技术通过精确的光照使得水凝胶材料发生光交联而成型，因其具备较高的打印效率和打印精度，而比其他传统打印技术更优越，因此基于DLP的3D打印在打印植入物精细结构上的特有优势，其在组织工程和临床应用中得到了广泛的关注^{［26，27］}。

尽管DLP打印技术可以精准地调控光线，精确度在1~10 μm，但是纯GelMA墨水的网络结构较为单一，存在打印成型性不足的问题，不利于制备高精度的组织支架^{［28，29］}。本研究为了解决DLP打印技术在制备高精度水凝胶支架方面存在的低成型性、低保真度的问题，制备GelMA‑甲基丙烯酸酯化透明质酸（hyaluronic acid methacrylate，HAMA）杂化水凝胶。通过调节组分的配比，优化了GelMA墨水的可打印性和高保真性，配制出适合DLP 3D打印的水凝胶墨水。HAMA用于增加GelMA的黏度和硬度，提高可打印性，因此在DLP 3D打印进行支架制备时不需要添加辅料，也不需要设置支撑，也能具备足够的可打印性能。本研究制备出较GelMA支架更符合骨组织力学的支架，更贴近真实骨组织环境，该支架减缓了支架的降解速率，满足骨组织长时间愈合期间所需的支撑作用。本研究首先对不同浓度和配比生物墨水的可打印性进行了比较，包括成型性、保真度和电镜观察细微结构，随后检验了杂化水凝胶墨水的生物相容性，这些结果都证明了GelMA‑HAMA杂化水凝胶获得了更好的可打印性能，同时具备良好的生物相容性，HAMA从机械性能方面和结构稳定性方面促进了GelMA水凝胶的可打印性，可以提高生物墨水在打印中的保真度和精度。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器

GelMA90购自苏州永沁泉智能设备有限公司（中国），型号为EFL‑GM‑90，规格：1 g/支；DMEM/F12培养基、10%胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培养基、地塞米松、抗坏血酸、β‑甘油磷酸钠、吲哚美辛、碱性磷酸酶试剂盒（COD11592）购买自武汉普诺赛生命科技有限公司；FBS购自Gibco（美国）；青霉素‑链霉素和胰蛋白酶购自Hyclone（美国）；细胞计数试剂盒‑8（CCK‑8）购自DOJINDO Lab（日本）；茜素红、Calcein‑AM/PI活细胞/死细胞染色试剂盒购自Solarbio（中国）。

酶标仪（Thermo，美国）；冷冻干燥机（Labconco，美国）；3D打印机购自中建三维（中国）。

1.1.2 实验动物

SD大鼠，雄性，2~4周，体重80~100 g，购自山东济南朋悦实验动物繁殖有限公司，生产许可证号：SCXK（鲁）20220006。大鼠用于提取骨髓间充质干细胞，动物实验通过蚌埠医科大学实验动物中心伦理审查，审批号：2022159。按规程进行操作，遵循动物福利通则，所有手术在麻醉下进行，符合动物伦理。

1.2 方法

1.2.1 不同组分配比的水凝胶打印

按照说明书配制引发剂LAP溶液：称取0.05 g LAP粉末置入棕色玻璃瓶中，往瓶中加入20 mL的PBS溶液，避光条件下，于60 ℃水浴箱中加热15 min，充分震荡直至充分溶解。

称取相应重量的GelMA和HAMA冻干样品，放入离心管中，用锡纸包裹避光，往离心管中加入1 mL光引发剂，于60 ℃水浴箱中加热30 min，充分震荡直至充分溶解。制备出质量分数浓度为5%~10%的GelMA水凝胶、质量分数浓度为0.5%~2%的HAMA水凝胶溶液。将配制好的溶液用无菌过滤器过滤后置入打印机墨盒中，该打印机以UV‑led作为UV光源，可发出405 nm波长的紫外光，能短时间内快速与光引发剂发生反应并对细胞几乎无伤害，且具备10 μm的分辨率，与挤出打印不同的是该打印机Z方向最小层厚为10 μm，支持打印出更精细结构的支架，打印参数—打印精度：10 μm，光线波长：405 nm，层厚：0.1 mm，每层照射时长：8 s，打印抬升速度：60 mm/min。

1.2.2 支架物理性质表征实验

1.2.2.1 扫描电子显微镜观察

将打印好的水凝胶支架进行冷冻干燥处理，冻干后的样品进行喷金处理，随后将支架放在平台上，在真空状态下，使用扫描电子显微镜观察水凝胶的孔道情况和内部微观结构。

1.2.2.2 支架的力学性能

为了了解支架的机械性能，通过打印机将对应的水凝胶墨水制备出直径为5 mm、高度为5 mm的圆柱体，将支架放在力学万能试验机测试平台上，施加载荷大小为1 kN，在实验过程中，加载速率设定为0.1 mm/min，当支架被压缩至碎裂时，实验被停止。

1.2.2.2 支架的降解率

将打印好的水凝胶支架进行冻干并称重，记录初始质量为W₀。将已称重的水凝胶支架置入24孔板中，每孔加入1 mL的PBS充分浸泡，在室温37 ℃环境下，放在100 r/min的摇床上，每隔7 d从PBS中取出水凝胶支架，冻干称重，再称重记为W₁，连续检测28 d。根据重量损失情况绘制降解曲线，水凝胶的降解率计算公式为：

降解率（%）=（W₀－W₁）/W₀×100%

1.2.2.3 支架的孔隙率

利用吸水法，测量支架的孔隙率。将各组支架冻干后备用，取15 mL离心管，管中加入1 mL的PBS，体积记录为V₁，将各组支架放入离心管中，用气泵适当挤压管中液体，使液体充分进入支架内部，记录此时的体积为V₂，然后将支架从离心管中取出，记录离心管中剩余体积，记录为V₃，孔隙率计算公式为：

孔隙率（%）=（V₁－V₃）/（V₂－V₃）×100%

1.2.3 骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

取SD大鼠，麻醉后按照颈椎脱臼法处死，将大鼠在酒精中浸泡30 min，随后用无菌器械将大鼠的双下肢剥离，仔细清除长骨上的肌肉后放在装有无菌PBS的培养皿中，消毒后放入无菌操作台中将长骨两端剪除，用培养基冲洗出骨髓间充质干细胞，用滤网过滤血块，将带有细胞的培养基移至离心管中离心并分瓶培养，每间隔3 d进行1次换液。提前配制成骨培养基：DMEM培养基+10% FBS+100 nmol/L地塞米松+50 μmol/L抗坏血酸+10 mmol/L β‑甘油磷酸钠，成脂培养基：DMEM培养基+10% FBS+1 μmol/L地塞米松+0.5 mmol/L IBMX+0.2 mmol/L吲哚美辛。在细胞传至第3代时，将细胞接种在6孔板中，用成骨培养基进行细胞培养，培养至21 d后进行茜素红实验。同样地，在细胞传至第3代时，将细胞接种在6孔板中，用成脂培养基进行细胞培养，培养至21 d后进行茜素红实验。

1.2.4 支架的生物相容性

1.2.4.1 细胞毒性实验

将细胞接种在Transwell孔板的下室中，水凝胶支架放在上室中，细胞密度为5×10³/孔，同时设置空白对照组，即无水凝胶支架干预的骨髓间充质干细胞组，每组3复孔。培养第1、3、5天时，按照说明书配制好CCK‑8工作液，将工作液加入孔中，于37 ℃恒温培养箱中孵育2 h，每孔各取100 μL溶液转移至新的96孔板中，检测450 nm波长处的吸光度值。

1.2.4.2 活/死细胞染色

将细胞接种在孔板中，步骤与分组同“1.2.4.1”项。培养第3天时，使用AM/PI活细胞/死细胞染色试剂盒进行染色，37 ℃恒温培养箱中孵育15 min，在倒置荧光显微镜下观察细胞的存活情况。

1.2.4.3 细胞骨架实验

将细胞接种在孔板中，步骤与分组同“1.2.4.1”项。当细胞生长到充分长出伪足后，用多聚甲醛将细胞固定，在避光条件下，用FITC标记的鬼笔环肽进行细胞外基质染色30 min，用DAPI进行细胞核染色5 min，在倒置荧光显微镜下拍照。

1.3 统计学处理

使用GraphPad Prism 9.0进行统计学处理，计量资料以\overline{x}\pm s表示，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 水凝胶支架的制备

GelMA和HAMA是经过基团修饰的高分子水凝胶材料，在可见光范围内的特定紫外线波长照射下，能发生交联反应并凝固成型，因此减少了化学交联法对细胞的损害，水凝胶的凝固过程见图1。虽然低浓度的GelMA也可以发生光固化，但是交联度通常较低，目前多应用于注射型水凝胶的制备，而用在挤出型的光固化打印机上则只能制备出精度要求较低的支架，制备出的支架往往也不如数字光固化打印机精细与完美，低浓度水凝胶墨水在打印支架时表现出成型性不足的结果（图2A），表明低浓度墨水的可打印性能不能达到打印要求。合适浓度和配比打印出的支架展图，肉眼可见支架具备良好的可打印性和保真度，可以很好地还原出设计的孔道和外形（图2B）。墨水浓度较高时出现了过度交联结果的展图，可见墨水因过度凝固而无法完成打印（图2C），这可能与浓度过高的墨水在室温下较为黏稠有关，在打印过程中出现了墨水提前凝固的情况，可能是导致支架出现过度交联现象的原因。不同浓度和组分配比的打印示意图显示，8% GelMA和2% HAMA杂化水凝胶的可打印性能表现最好，最适合应用于DLP打印机打印骨支架（图2D）。该墨水打印出的孔道直径为300 μm的多孔骨支架，具备较好的保真度，能良好地还原软件上设计的模型（图2E），于是本研究采用单一组分的GelMA墨水与GelMA‑HAMA杂化墨水进行后续实验，进一步探讨HAMA对单一水凝胶材料的优化作用。

2.2 水凝胶支架的表征

为了观察支架更细微的结构改变，将8% GelMA组（G组）支架和8% GelMA+2% HAMA组（GH组）支架进行扫描电子显微镜检测，结果可见（图3），单一组分的G组支架较为粗糙，孔道形状不规则，孔道内部出现了堵塞情况，证明单网格水凝胶的可打印性和保真度都较差，不利于进行DLP打印。GH组支架则表现出更好的成型性，能较大程度地还原支架内部的多孔结构，这可能与GelMA‑HAMA的交联网络增强了水凝胶支架的结构稳定有关，提高了可打印性和支架的保真度。

2.3 机械性能评估

各组支架的力学性能测试结果显示，GH组支架的机械性能比G组更高，能在较大变形下承受更大的力，杨氏模量也比单组分的G组高（P<0.000 1），见图4A、B。说明HAMA增强了支架的力学性能，提高了支架的稳定性，表现在每一层的稳定结构为打印提供了良好的支撑，这是打印能顺利完成的关键，如果没有良好的结构支撑，容易导致支架在打印过程中出现变形，甚至打印失败。

2.4 体外降解性能

在目前现有的研究中，其他水凝胶材料多存在降解过快或者不易降解等问题，降解过快容易导致药物突释，不易降解则不利于新生骨组织的整合作用，二者会影响组织的愈合效果。本研究对GelMA‑HAMA支架的降解性能进行了评估，结果显示，在1个月时，G组支架已经降解了50%，而GH组只降解了30%，说明HAMA的掺入能减缓支架的降解速度，GelMA‑HAMA杂化水凝胶具有更好的降解控制能力，有利于长时间的作用于愈合时间较长的组织，如骨组织（图5）。

2.5 孔隙率评估

支架的孔隙率计算结果显示，G组和GH组的孔隙率差异无统计学意义（P>0.05），见图6。

2.6 大鼠骨髓间充质干细胞培养及成骨分化、成脂诱导分化能力

细胞培养到第3代，细胞贴壁生长，形状为长梭形，细胞外基质铺开形似伪足（图7A）。成骨诱导21 d时进行的茜素红染色结果显示双折射的钙沉积结节（图7B）。成脂诱导21 d时进行的油红O染色结果显示脂滴被染成红色（图7C），证明了本研究所使用的细胞具备多向分化的能力，为骨髓间充质干细胞。

2.7 支架的生物相容性

2.7.1 细胞毒性实验

G组和GH组支架对细胞存活率的影响与空白对照组相比差异无统计学意义（P>0.05），见图8。这一结果表明经过HAMA杂化的水凝胶墨水具有良好的生物相容性。

2.7.2 活/死染色结果分析

细胞培养至第3天，各组的细胞存活率都较高，死细胞出现较少，表明支架具有良好的生物相容性（图9）。

2.7.3 细胞骨架评估

细胞骨架染色结果显示（图10），细胞核完整，细胞外基质伸展良好，说明支架对细胞无毒性，具有良好的生物相容性，良好的生物相容性是GelMA‑HAMA杂化水凝胶可以用于3D生物打印的前提。

3 讨论

随着医学的不断进步与发展，3D打印定制个性化骨支架将很大程度地缓解骨取代物缺乏的问题，也是目前的研究热点^{［30，31］}。然而常用于3D打印的支架材料大多因为组分单一而存在力学性能差、成型性不足等问题^［32］，不适合应用于3D打印机，特别是对可打印性有更高要求的DLP打印机。目前大多研究表明，一款良好的支架植入物应同时具备血管化的能力，即需要有良好的孔径支持细胞和营养物质的运输及血管的生长^{［33，34］}，不会影响支架的整合。本研究通过测试不同浓度和组分配比，制备出了能打印出良好形态的GelMA‑HAMA杂化水凝胶墨水，该墨水适用于DLP打印机，可以应用于打印较高精度的结构，具备良好的可打印性，为DLP 3D打印生物墨水提供了参考。基于HAMA材料已架，同时具备了HAMA的上述优良化学特性，为后续通过化学结合方式赋予支架更多生物功能提供了可能性^{［35‑38］}。HAMA解决了单一GelMA的低成型性问题，这离不开GelMA‑HAMA之间的稳定结合。有研究指出，HAMA材料在被消化之后，会仍然存在一种柔软且稳定的结构，这为HAMA增强GelMA的可打印性提供了依据^［39］。支架的降解实验发现GelMA‑HAMA之间的网络结构还能减缓支架的降解，延长作用时间，有利于需要长时间修复的组织，如骨组织。GelMA更适合细胞的培养，HAMA则机械强度和成型性更佳^［40］，通过与骨髓间充质干细胞的共同培养实验发现，GelMA‑HAMA水凝胶的结合可以实现优势互补，本研究制备出既具有良好的生物相容性又具有良好的可打印性能和机械强度的杂化水凝胶，并且成功制备了细微结构更为精细、保真度良好的支架。

针对本研究中存在不足之处，本课题组会在后续研究中从分子层面、化学键形成等角度进行深入分析GelMA‑HAMA的优势互补机制的研究，同时进一步进行相关体内实验，完善所制备支架在动物体内的骨修复效果研究。展望未来，在DLP打印应用中，对于更小直径的复杂结构和微通道的打印，由于难以去除残留在孔道中的未固化水凝胶墨水，同时因光照而导致过交联反应，容易出现通道堵塞，导致3D打印微孔支架制造失败^{［41，42］}。因此，下一步研究本课题组将从如何有效清除残留墨水，及寻找一款生物活性遮蔽剂加入生物墨水中，降低过交联反应，这对为骨科在神经和血管再生方面制备高精度微孔支架至关重要。

综上所述，尽管先进的3D生物打印技术取得了长足的进步，但在载细胞结构中设计更小的微孔仍然具有挑战性。本研究证明HAMA增强了单网络结构GelMA水凝胶的结构稳定性和可打印性，可以提高生物墨水在打印中的保真度和精度，为光固化3D打印墨水的选择提供了参考，解决了DLP打印技术在打印高精度水凝胶支架方面存在着低成型性、低保真度的问题，为复杂的生物结构的精准打印提供了新思路，尤其是适用于目前热点研究血管化的骨仿生支架领域及神经支架领域，具有很大的应用前景和参考价值。

作者贡献度说明：

莫天得：研究设计、文章撰写；安笑言、唐昊旭：研究实施、数据收集整理；杨毅、牛冲、李金虎：统计分析；牛国旗：文章修改审阅、项目经费资助。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家卫生健康委医药卫生科技发展研究中心临床科研专项资金(WKZX2024JZ0116)

安徽省自然科学基金(KJ2021A0756)