蛋白组学筛选胎儿生长受限羊水生物标志物的研究

Proteomic screening of amniotic fluid biomarkers for fetal growth restriction

摘要

目的 利用蛋白组学方法筛选生长受限胎儿羊水差异表达的蛋白，筛选潜在的可诊断胎儿生长受限的生物标志物。 方法 对晚孕期的29例羊水样本进行蛋白组学分析和验证。（1）18例羊水样本（包括8例严重生长受限胎儿、5例小于胎龄胎儿及5例正常胎儿）通过基于质谱的4D⁃Label⁃free Quantification（4D⁃LFQ）定量蛋白质组学技术鉴定蛋白并进行定量，当P<0.05时，以差异表达量变化超过1.5作为明显上调的变化阈值，小于1/1.5作为明显下调的变化阈值，分别筛选严重生长受限胎儿对比正常胎儿、小于胎龄胎儿对比正常胎儿、严重生长受限胎儿对比小于胎龄胎儿的差异表达蛋白，对差异蛋白进行功能、通路富集分析及蛋白质⁃蛋白质相互作用网络。以正常胎儿、小于胎龄胎儿、严重生长受限胎儿的顺序，进行蛋白表达模式聚类分析，并对聚类蛋白进行功能、通路富集分析。（2）基于质谱的靶向蛋白质组定量技术（PRM）验证15例羊水（包括严重生长受限胎儿、小于胎龄胎儿、正常胎儿各5例，18例中3例样本量不足）的17种差异蛋白。（3）用酶联免疫吸附法（ELISA）检测10例严重生长受限胎儿及10例正常胎儿羊水中铁死亡通路关键蛋白TFRC和GPX4浓度并比较差异（部分样本量不足以进行后续实验，新纳入11例研究病例，包括4例严重生长受限胎儿和7例正常胎儿）。 结果 （1）通过特异性肽段解析的蛋白总数为3 047，可定量比较的蛋白数为2 957。将严重胎儿生长受限，小于胎龄胎儿2组病例组及正常对照组两两比较，严重胎儿生长受限组对比正常对照组鉴定到235个差异蛋白（包括137个上调蛋白和98个下调蛋白），小于胎龄胎儿组对比正常对照组鉴定到197个差异蛋白（包括111个上调蛋白和86个下调蛋白），严重胎儿生长受限组对比小于胎龄胎儿组鉴定到140个差异蛋白（68个上调蛋白和72个下调蛋白）。（2）基于质谱的靶向蛋白质组定量技术 （parallel reaction monitoring，PRM）验证17种显著差异蛋白，其中TPP1、PRL、CRP、EDN3、LAMA2、ERP29、PDIA3、IGFBPL1、CHRD、CTNNBIP1、ALPL、CTSL、ACE、CEL、AHSP共15个蛋白在病例组与对照组的比较中表达趋势与定量结果完全一致。（3）酶联免疫法检测10例严重生长受限胎儿及10例正常胎儿羊水的TFRC、GPX4浓度并比较差异，TFRC在严重生长受限胎儿组明显上调，GPX4在两组间差异无统计学意义。 结论 对生长受限胎儿的羊水用基于质谱的4D⁃Label⁃free Quantification（4D⁃LFQ）定量蛋白质组学进行研究，严重生长受限胎儿组对比正常组共鉴定到差异蛋白235个（137个上调，98个下调），小于胎龄胎儿组对比正常胎儿共鉴定到197个差异蛋白（111个上调，86个下调）。经基于质谱的靶向蛋白质组定量技术（PRM）验证显著差异蛋白，ELISA验证铁死亡通路相关蛋白，蛋白TPP1、PRL、CRP、EDN3、LAMA2、ERP29、PDIA3、IGFBPL1、CHRD、CTNNBIP1、ALPL、CTSL、ACE、CEL、AHSP、TFRC有望成为胎儿生长受限的生物标志物。

Abstract

Objective To screen differentially expressed proteins in the amniotic fluid of growth restricted fetuses and to screen biomarkers for the diagnosis of growth restricted fetuses by proteomics. Methods Proteomic analysis and verification of amniotic fluid was performed in 29 cases of third trimester pregnancy. （1） Eighteen amniotic fluid samples （including 8 fetuses with severe growth restriction， 5 fetuses small for gestational age and 5 normal fetuses ） identified proteins and quantified them by mass spectrometry based 4D⁃Label⁃free Quantification（4D⁃LFQ） quantitative proteomics technology. When P<0.05， the change of differential expression level was more than 1.5 and less than 1/1.5 as the significantly up⁃regulated and down⁃regulated change threshold， respectively. The differentially expressed proteins of severe Fetal Growth Restriction compared to normal fetuses， Small for Gestational Age compared to normal pregnancy fetuses， and severe Fetal Growth Restriction compared to Small for Gestational Age were screened， respectively. Function， pathway enrichment analysis and protein⁃protein interaction network were performed for the differentially expressed proteins. In order of normal fetus， Small for Gestational Age and severe Fetal Growth Restriction， the protein expression pattern cluster analysis was performed， and the clustering protein function and pathway enrichment analysis was performed. （2） Mass spectrometry⁃based targeted proteomic quantification （PRM） was used to verify 17 differentially expressed proteins in amniotic fluid of 15 cases （including 5 severe Fetal Growth Restriction， 5 Small for Gestational Age fetuses and 5 normal fetuses each， because the sample sizes of the rest 3 cases were insufficient）. （3） The concentrations of Ferroptosis pathway key proteins TFRC and GPX4 in amniotic fluid of 10 severe Fetal Growth Restriction and 10 normal fetuses were detected by enzyme⁃linked immunoassay and the differences were compared （some sample sizes were insufficient for the subsequent experiments， 11 new research cases were included， including 4 fetuses with severe growth restriction and 7 normal fetuses）. Results （1） The total number of proteins analyzed by specific peptides was 3 047， and the number of proteins that could be quantitatively compared was 2 957. Two cases groups of severe Fetal Growth Restriction and Small for Gestational Age were compared to the normal control group. 235 differentially expressed proteins （including 137 up⁃regulated proteins and 98 down⁃regulated proteins） were identified in the severe Fetal Growth Restriction group compared with the normal control group. There were 197 differentially expressed proteins （including 111 up⁃regulated proteins and 86 down⁃regulated proteins） in the Small for Gestational Age group compared with the normal group， and 140 differentially expressed proteins （68 up⁃regulated proteins and 72 down⁃regulated proteins） in the severe Fetal Growth Restriction group compared to the Small for Gestational Age group. （2） Mass spectrometry⁃based targeted proteomic quantification （parallel reaction monitoring， PRM） to verify 17 significantly differentially expressed proteins. Among them， the expression trend of 15 proteins including TPP1， PRL， CRP， EDN3， LAMA2， ERP29， PDIA3， IGFBPL1， CHRD， CTNNBIP1， ALPL， CTSL， ACE， CEL and AHSP were completely consistent with the quantitative results in the comparison between case group and control group. （3） The concentrations of TFRC and GPX4 in amniotic fluid of 10 severely growth restricted fetuses and 10 normal fetuses were detected by ELISA and compared. TFRC was significantly up⁃regulated in severely growth restricted fetuses， and there was no significant difference in GPX4 between the two groups. Conclusion The amniotic fluid of growth restricted fetuses was studied with mass spectrometry based 4D⁃Label⁃free Quantification（4D⁃LFQ） quantitative proteomics. Compared to the normal group， 235 differentially expressed proteins （137 up⁃regulated and 98 down⁃regulated） and 197 differentially expressed proteins （111 up⁃regulated and 86 down⁃regulated） were identified in severe Fetal Growth Restriction group and Small for Gestational Age group， respectively. Verified by mass spectrometry⁃based targeted proteomic quantification （PRM） with the significantly differentially expressed proteins， and by ELISA with the proteins associated with the Ferroptosis pathway， proteins TPP1， PRL， CRP， EDN3， LAMA2， ERP29， PDIA3， IGFBPL1， CHRD， CTNNBIP1， ALPL， CTSL， ACE， CEL， AHSP， TFRC are expected to be biomarkers of Fetal Growth Restriction.

Graphical abstract

关键词

胎儿生长受限 / 蛋白组学 / 羊水 / 生物标志物

Key words

Fetal Growth Restriction / Proteomics / Amniotic fluid / Biomarker

胎儿生长受限（fetal growth restriction，FGR）是指受母体、胎儿、胎盘等病理因素影响，胎儿生长未达到其应有的遗传潜能，多表现为胎儿超声估测体重或腹围低于相应胎龄第10百分位^［1］，是死产、早产和神经发育受损的主要原因，全球发病率估计约为20.5%^［2，3］。FGR与妊娠不良结局密切相关，包括死产、早产、新生儿死亡率增加以及成人疾病和神经发育障碍的风险增加^［4⁃6］，准确识别和管理FGR对于降低围产期死亡率至关重要。目前的临床困境是即使正确识别了FGR，也只能用有限的监测方法监测胎儿宫内缺氧情况，平衡胎死宫内的风险和早产导致的胎儿远期不良预后的风险，通过提前终止妊娠的代价来减少死胎、死产的发生^［7，8］。导致FGR的因素通常涉及母体、胎儿及胎盘脐带等3个方面，但具体分子机制不详^［9］。近年来，蛋白质组学技术为揭示FGR病理机制提供了新思路，现有研究已采用不同生物样本开展探索：Liu等^［10］使用FGR大鼠脑组织进行蛋白组学研究，Conrad等^［11］使用FGR胎儿脐带血进行蛋白组学研究，Gęca等^［12］使用FGR胎儿胎盘进行蛋白组学研究，但目前尚无基于质谱的蛋白质组学技术在FGR中研究羊水的报道。本研究是创新使用该技术进行FGR胎儿羊水的研究。本研究的目的是通过基于质谱的蛋白组学技术，分析筛选出孕晚期FGR羊水中的差异表达蛋白，旨在为FGR发病的分子机制提供新思路。

1 资料与方法

1.1 实验设计与研究对象

本研究采用病例对照研究方法，根据实验操作规程的样本要求，收集海南医科大学第一附属医院胎儿医学科2022年7月~2023年10月于晚孕期（孕周≥28周）行羊膜腔穿刺术的羊水样本共29例，其中严重胎儿生长受限（FGR⁃S）12例、小于胎龄胎儿（SGA）5例及染色体、超声结构、胎儿生长趋势无异常的正常胎儿的羊水12例（因产前筛查高风险指征行羊水穿刺）。2022年7月~2023年4月收集18例羊水样本（包括8例严重生长受限胎儿、5例小于胎龄胎儿及5例正常胎儿），通过基于质谱的Label⁃free Quantification （LFQ）定量蛋白质组学技术鉴定蛋白并进行定量，3组两两比较差异表达蛋白，对差异表达蛋白进行功能、通路富集分析及蛋白质⁃蛋白质相互作用网络分析；以FGR的严重程度进行了聚类蛋白分析，并将聚类蛋白进行功能、通路富集分析；采用基于质谱的靶向蛋白质组定量技术（parallel reaction monitoring，PRM）验证15例羊水样本（包括严重生长受限胎儿、小于胎龄胎儿、正常胎儿各5例，18例中3例样本量不足）的17种差异表达蛋白的变化趋势；因部分样本量不足以继续实验，于2023年5~10月追加11例样本（4例严重生长受限胎儿、7例正常胎儿），采用酶联免疫吸附实验（enzyme⁃linked immunosorbent assays，ELISA）检测10例严重生长受限胎儿（原有FGR⁃S 6例，新纳入4例）及10例正常胎儿（原有CON 3例，新纳入7例）羊水中铁死亡通路相关蛋白转铁蛋白受体（TFRC）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）浓度并比较差异，见图1。本研究遵循《赫尔辛基宣言》原则，经海南医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准［批准文号：2022（科研L）第（48）号］，并获得了每位参与研究患者的书面知情同意。

根据中国《胎儿生长受限专家共识（2019版）》的诊断标准^［1］，超声估测胎儿体重（estimated fetal weight， EFW）或胎儿腹围小于相应胎龄的第10百分位的胎儿，诊断为SGA。超声估测EFW或胎儿腹围小于相应胎龄的第3百分位，或者超声估测EFW或胎儿腹围小于相应胎龄的第10百分位、并伴有脐动脉血流异常（搏动指数>第95百分位、舒张末期血流缺失/反向）的胎儿，诊断为严重胎儿生长受限。纳入标准：胎儿无超声提示的结构异常、产前诊断结果提示遗传学正常、无母体合并症以及妊娠并发症的小于胎龄胎儿和严重胎儿生长受限。排除标准：超声提示胎儿合并有结构异常、产前诊断结果提示遗传学异常、伴有母体合并症或妊娠并发症。退出标准：中途退出研究、研究者认为不合适再继续参加研究者。在本研究中，由具有产前诊断资质的超声科医生进行超声估测胎儿体重以及胎儿结构异常的筛查。超声估测胎儿体重是通过3次标准超声测量平面测得的胎儿生物测量参数（包括双顶径、头围、腹围和股骨长）的均值，采用Hadlock公式计算得出EFW^［13］，参考中国人群不同孕周的胎儿估测体重参考标准^［14］。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂与仪器

实验所需试剂主要包括：蛋白酶抑制剂Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ（Merck Millipore）、胰蛋白酶（Promega）、磷酸化酶抑制剂（Millipore）、碘乙酰胺（Sigma⁃Aldrich）、二硫苏糖醇（Sigma⁃Aldrich）、BCA试剂盒（碧云天）、Pierce Top 14 Abundant Protein Depletion Spin Columns（Thermo scientific）等。

实验设备涉及：Mini⁃PROTEAN^® 伯乐垂直电泳槽（美国伯乐实验室）、PowerPac™ Basic Power Supply（Bio⁃Rad Laboratories）、High intensity ultrasonic processor （Scientz）、Centrifuge （Dynamica Scientific Ltd.）、Shaker （Qilinbeier）、Microplate Reader （Bio⁃Rad Laboratories）、Orbitrap Exploris 480 （ThermoFisher Scientific）、300 Extend C₁₈ column（小） （Agilent）、BETASIL C₁₈ column（大） （ThermoFisher Scientific）、色谱柱（赛默飞世而科技公司）、Amicon Ultr （Merck Millipore）、Acclaim™ PepMap™ 100 C18 （赛默飞世而科技公司）。

1.2.2 样本制备与液相色谱⁃质谱联用分析

常规消毒后，22G穿刺针行羊膜腔穿刺术，注射器抽取羊水，初始2 mL丢弃，取5 mL羊水，常温1 500 g离心5 min，取上清液放置于冻存管内，迅速放入-80 ℃冰箱冻存备用。蛋白提取：取出样本，加入50 μmol/L PR‑619、3 μmol/L TSA、1%磷酸酶抑制剂、50 mmol/L NAM， 离心参数设定为12 000 r/min×10 min（4 ℃），上清液转至新离心管中，丢弃底层细胞碎片，使用Pierce™Top 14丰度蛋白耗尽旋转柱试剂盒，按照说明进行高丰度蛋白的消除。使用BCA试剂盒精确测量蛋白质浓度。胰蛋白酶酶解：等量蛋白进行酶解，用裂解液将体积调整一致，加入二硫苏糖醇（DTT），最终浓度为5 mmol/L、56 ℃ 还原30 min，室温孵育15 min，将烷基化好的样本转移至超过滤管，室温12 000 r/min离心20 min，8 mol/L尿素置换3次，再用置换buffer置换尿素3次，以1∶50的比例（蛋白酶∶蛋白，m/m）加入胰蛋白酶，酶解过夜。室温12 000 r/min离心10 min回收肽段，再用ddH₂O回收肽段1次，合并2次肽段溶液备用。液相色谱⁃质谱联用分析：肽段用液相色谱流动相A相溶解后使用EASY⁃nLC 1200系统进行分离。流动相A（0.1%甲酸+2%乙腈）/流动相B（0.1%甲酸+90%乙腈），梯度洗脱：0~68 min 4%~20%B，68~82 min 20%~32%B，82~86 min 32%~80%B，86~90 min 80%B，流速500 nL/min。 Orbitrap Exploris 480质谱采用离子源（2.3 kV） ，FAIMS补偿电压（CV）设置为-70 V，-45 V，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级扫描 400~1 200 m/z，扫描分辨率60 000；二级扫描固定起点为110 m/z，分辨率30 000，TurboTMT设置为off。

1.2.3 生物学信息分析

蛋白注释：基于EggNOG数据库对鉴定蛋白实施功能分类注释分析，通过Pfam数据库结合PfamScan工具完成蛋白结构域注释，利用KEGG数据库进行通路注释及亚细胞定位预测。对鉴定到的蛋白基于COG和KOG数据库构建同源基因簇的系统发育树并进行功能注释。蛋白质功能富集：对鉴定到的蛋白进行GO注释，结果分类为3大类别：生物过程、细胞组分和分子功能。针对鉴定的差异表达的蛋白基于KEGG数据库进行通路富集分析。以正常胎儿、小于胎龄儿、严重生长受限胎儿的顺序，进行蛋白表达模式聚类分析，并对聚类蛋白进行功能、通路富集分析。

1.2.4 PRM验证

根据样本质量情况选择15例样本进行PRM验证，因实验技术要求，保证实验成功率，选取蛋白强度较高的蛋白共20个。

蛋白提取及胰蛋白酶酶解同1.2.2。液相色谱⁃质谱联用分析：肽段用液相色谱流动相A相溶解后使用EASY⁃nLC 1200系统进行分离。流动相A（0.1%甲酸+2%乙腈）/流动相B（0.1%甲酸+90%乙腈），梯度洗脱：0~40 min 6%~20%B，40~52 min 20%~28%B，56~60 min 80%B，流速500 nL/min。 Q Exactive HF⁃X质谱采用NSI离子源（2.1 kV） 肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级扫描 350~995 m/z，扫描分辨率120 000；二级扫描分辨率30 000，数据采集模式使用数据非依赖型扫描（DIA）程序，HCD碰撞池的碎裂能量设置为28%。一级质谱自动增益控制（AGC）设置为3e6，最大离子注入时间（Maximum IT）设置为50 ms；二级质谱自动增益控制（AGC）设置为2e5，最大离子注入时间（Maximum IT）设置为220 ms，隔离窗口（Isolation window）设置为1.4 m/z。二级质谱数据使用Maxquant （v1.6.15.0）进行检索，数据使用Skyline 21.2进行处理。

1.2.5 ELISA测量比较TFRC、GPX4含量

使用Human Transferrin Receptor Simple Step ELISA^® Kit （Abcam）、Human Glutathione Peroxidase 4 Simple Step ELISA^® Kit （Abcam）测量FGR⁃S 组（n=10，原FGR⁃S 6例，新纳入4例，）与CON组（n=10，原CON3例，新纳入7例）羊水上清中蛋白TFRC、GPX4的含量。按试剂盒说明测量样本TFRC、GPX4浓度，重复2次。

1.3 统计学处理

采用 SPSS 26.0 统计分析系统完成数据处理，数据以\overline{x}\pm s表示。3组间临床特征数据同时符合正态分布及方差齐性要求，采用单因素方差分析。组间蛋白比较使用t检验。差异蛋白聚类分析采用Fisher's exact test方法计算的富集显著性P值。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征结果

经纳入与排除标准筛选后，分为病例组（共2组：FGR⁃S组12例和SGA组5例）和对照组（CON组12例），母胎临床特征包括孕妇年龄、采样孕周、估测胎儿体重相当于同孕周胎儿体重中位数倍数（EFW Mom）、有无脐动脉血流异常、羊穿指征。见表1。3组间孕妇年龄、羊穿孕龄无明显差异（P>0.05），而估测胎儿体重Mom值有明显差异（P<0.001），呈递减变化，见图2。3组胎儿脐动脉血流无异常。病例组以严重胎儿生长受限及小于胎龄胎儿为羊穿指征，12例对照组羊穿指征分别为：2例高龄孕妇，2例羊水过多，8例超声软指标阳性（1例胎儿双肾盂分离、1例胎儿持续性右脐静脉、2例胎儿侧脑室轻度增宽、1例胎儿肠管回声增强并胆囊未显示、1例胎儿脉络丛囊肿、2例胎儿永存左上腔静脉）。

2.2 差异蛋白筛选

3组两两比较，分别产生137、68、111个差异上调蛋白和 98、72、86个差异下调蛋白，见图3。

2.3 差异蛋白富集分析

对FGR⁃S/CON组235个差异蛋白、FGR⁃S/SGA组140个差异蛋白、SGA/CON组197个差异蛋白分别进行GO和KEGG富集分析，GO富集分析包括细胞组分、分子功能、生物过程3个类别；蛋白显著性富集参考⁃log10（P）值，值越大代表在该条目中富集越显著。

2.3.1 FGR⁃S/CON组差异蛋白GO、KEGG富集分析

FGR⁃S/CON组235个差异蛋白GO富集在5项细胞组分、20项分子功能和20项生物过程。5项细胞组分是转录调控复合体、顶端质膜尿道上皮斑、精子个体化复合物、弹性纤维、细胞体纤维；20项分子功能是丝氨酸型外肽酶活性、胰岛素样生长因子Ⅱ结合、胰岛素样生长因子Ⅰ结合、外肽酶活性、丝氨酸型羧肽酶活性、胰岛素样生长因子结合、甲状腺激素受体结合、负极定向微管马达活性、动力蛋白轻中间链结合、肿瘤坏死因子活化受体活性、死亡受体活性、三肽肽酶活性、纤连蛋白结合、转移酶活性和转移氮基团、氨酰转移酶活性、羧肽酶活性、转录顺式调控区结合、蛋白甲基转移酶活性、动力蛋白轻链结合、胆碱结合；20项生物过程是B细胞增殖调节、B细胞活化调节、谷氨酸代谢过程、髓样白细胞分化调节、铁离子跨膜运输、核苷酸降解代谢过程、阴性调节髓样白细胞分化、阴性调节白细胞分化、肽酰谷氨酰修饰、宿主对外α唾液酸酶活性的阴性调节、宿主对共生体催化活性的阴性调节、宿主对病毒分子功能的调节、宿主对病毒糖蛋白代谢过程的调节、宿主对病毒催化活性的调节、早期内涵体到高尔基体的转运、B细胞活化的正调节、肽激素分泌、单核细胞分化调节、糖蛋白代谢过程的阴性调节、宿主对病毒过程的阴性调节。KEGG通路主要富集在神经活性配体⁃受体相互作用、肾素⁃血管紧张素系统、细胞因子与细胞因子受体间相互作用、肾素分泌、肠道产生IgA的免疫网络。

2.3.2 SGA/CON组差异蛋白GO、KEGG富集分析

SGA/CON组197个差异蛋白GO富集在20项细胞组分、20项分子功能和20项生物过程。20项细胞组分分别是离心异染色质、细胞质核糖体、核糖体亚基、有丝分裂纺锤体中部带、染色体着丝粒区域、连环蛋白复合物、细胞质大核糖体亚基、黏附筋膜、大核糖体亚基、核糖体、血红蛋白复合物、核小体、DNA包装复合物、纺锤体中部带、Z线、A带、染色体区域、细胞桥粒、肌细胞突出膜、珠蛋白⁃血红蛋白复合物；20项分子功能分别是胰岛素样生长因子结合、连接酶调节活性、胰岛素样生长因子Ⅱ结合、胰岛素样生长因子I结合、转化生长因子β受体结合、α⁃连环蛋白结合、核小体DNA结合、核糖体的结构组分、丝氨酸型羧肽酶活性、钙依赖性半胱氨酸型内肽酶活性、巨肌蛋白结合、丝氨酸型外肽酶活性、染色质DNA结合、钠离子结合、氧载体活性、血红蛋白α亚单位结合、碳氮裂解酶活性、脲酶活性、结构分子活性、长链脂肪酸结合；20项生物过程分别是信号传导途径、骨骼肌组织再生的正调节、侧芽蔓延的正调节、上皮芽的形态发生、角质细胞分化、有丝分裂姐妹染色单体分离的正调节、染色体组织的负调节、基因表达的负调节、组蛋白H3⁃K4甲基化的负调节、非编码RNA的降解过程、细胞桥粒的组装、细胞桥粒的组织、组蛋白甲基化的负调节、乳腺芽的形态发生、脱氧核苷酸单磷酸代谢过程、蛋白质⁃DNA复合物的组装、染色质组织的负调节、有丝分裂姐妹染色单体分离的调节、神经管形成、脂肪酸β氧化。KEGG通路主要富集在核糖体、TGF⁃β信号通路、慢性髓性白血病。

2.3.3 FGR⁃S/SGA组差异蛋白富集分析

FGR⁃S/SGA组140个差异蛋白富集GO在20项细胞组分、14项分子功能和20项生物过程。20项细胞组分是细胞间连接、细胞连接、锚定连接、紧密连接、角化鞘、GAIT 复合物、顶端质膜尿道板、突触、细胞桥粒、斑点紧密连接、顶端连接复合物、突触裂缝、有丝分裂纺锤中区、层黏连三聚体、高尔基体中部囊、双细胞紧密连接、侧面质膜、层黏连一聚体、顶侧质膜、球状突出；14项分子功能是蛋白磷酸酶抑制剂活性、磷酸酶抑制剂活性、甘露寡糖1，3⁃1，6⁃α⁃甘露苷酶活性、钙黏蛋白结合、核苷三磷酸酶调节剂活性、β⁃连环蛋白结合、蛋白磷酸酶调节剂活性、NADPH 结合、水解酶活性和水解N⁃糖基化合物、磷酸酶调节剂活性、结构分子活性、蛋白酶激活剂活性、甘露寡糖甘露苷酶活性、酶激活剂活性；20项生物过程分别是磷脂酶A2活性的调节、细胞对肿瘤坏死因子的反应、细胞桥粒的组装、GTP酶活性的正调控、磷脂酶活性的调节、TNFSF11介导的信号传导途径、氨基酸运输的负调控、经典Wnt信号通路的正调控、有丝分裂细胞周期G1/S转变的调节、蛋白定位到细胞皮质、磷脂酶活性的负调控、长链脂肪酸进入细胞、嘌呤核苷酸生物合成过程、磷蛋白磷酸酶活性的负调控、紧密连接的组织、Wnt信号通路的正调控、细胞周期过程的负调控、长链脂肪酸运输、细胞周期G1/S期转变的调节、有丝分裂细胞周期相转变的正调控。KEGG通路富集分析显示主要富集在病毒性心肌炎、糖尿病心肌病、氮代谢、N⁃Glycan生物合成。

2.4 差异蛋白互作网络分析

为了能清晰展示蛋白与蛋白之间的互作关系，筛选出前50个互作关系最紧密的蛋白绘制蛋白互作网络，见图4。

2.5 差异蛋白聚类分析

2.5.1 聚类分析

以CON、SGA、FGR⁃S（即正常⁃轻度⁃重度）的顺序进行两两比较筛选后剩余263个蛋白用于表达模式聚类分析，包括KEGG通路、GO功能、蛋白结构域富集分析。cluster4和cluster6分别呈现出疾病程度递增和递减的趋势，见图5。

2.5.2 聚类蛋白功能富集分析

将以上聚类的差异表达蛋白进行KEGG通路富集分析显示，聚类蛋白cluster4和cluster6递变的蛋白主要映射到以下信号通路：铁死亡、脂肪和蛋白质消化与吸收、蛋白质输出、肾素分泌、肾素⁃血管紧张素系统、Wnt信号通路等，见图6。这些蛋白主要富集在32个GO功能分类中，9个属于生物学过程：细胞趋化作用、白细胞趋化、炎症反应、髓样白细胞迁移、粒细胞趋化性、粒细胞迁移、细胞外基质组织、胶原蛋白代谢过程、细胞组分分解、细胞外基质分解；11个属于细胞组分：基于肌动蛋白的细胞凸起、细胞器的结合膜、分泌颗粒、细胞外区域与空间、内质网膜、内质网亚室、运动纤毛、内体腔、弹性纤维、顶体小泡、轴突生长锥。12个属于分子功能：GTP酶活性、水解酶活性、氨基肽酶活性、氨酰基转移酶活性、纤维蛋白原结合、蛋白聚糖结合、细胞外基质结构组分、整合素结合、丝氨酸水解酶活性、离子结合、金属肽酶活性、相同蛋白结合。蛋白结构域富集显示，这些聚类蛋白主要分布于RAS家族、凝血因子Xa抑制位点、C1q结构域、肌酸酐酶/脯氨酸酶N末端结构域、类似于补体C1r的EGF样结构、免疫球蛋白结构域等。差异蛋白富集递变的cluster4和cluster6部分聚类蛋白及其涉及的通路，见表2。

将以上通路及“fetal growth restriction”作为检索词，在Pubmed中检索发现，FGR在通路“Ferroptosis”的研究较多。查询cluster4和cluster6中这两个通路及上下游通路中的相关蛋白如下：

TFRC（transferrin receptor），转铁蛋白受体，三价铁离子（Fe³⁺）与转铁蛋白（Tf）结合形成Tf⁃2Fe³⁺复合物通过同源二聚体跨膜蛋白TFRC在合胞体滋养层表面的微绒毛质膜（MVM）上进行内吞作用^［15］。FGR⁃S组TFRC较对照组明显上调（比值1.54，P=0.008）

GPX4（Glutathione peroxidase 4），谷胱甘肽过氧化物酶4，是一种必需的抗氧化剂过氧化物酶，通过防止膜脂过氧化，在保护细胞免受氧化损伤中起关键作用，防止细胞铁死亡（Ferroptosis），铁死亡是一种铁依赖性由脂质活性氧的积累引起的非凋亡的程序性细胞死^{［16⁃18］}。FGR⁃S组GPX4较对照组明显下调（比值0.41，P=0.001）。

GCLC（Glutamate⁃cysteine ligase catalytic subunit），谷氨酸⁃半胱氨酸连接酶催化亚基，催化L⁃谷氨酸和L⁃半胱氨酸的ATP依赖性连接，并参与谷胱甘肽（glutathione，GSH）生物合成的第一步和限速步骤。FGR⁃S组GCLC较对照组明显下调（比值0.44，P=0.04）。

2.6 验证结果

2.6.1 PRM验证

根据样本量情况（3例样本量不足），进行15例样本PRM的验证，因实验技术要求，保证实验成功率，选取蛋白强度较高的蛋白共20个，验证成功17个，其中有14个蛋白在各比较组间的表达趋势与定量结果保持一致，见表3， PRM验证大部分蛋白在各组间的表达趋势与定量结果保持一致，仅有3个蛋白在FGR⁃S/CON、SGA/CON组的趋势与定量结果趋势不完全一致。

2.6.2 ELISA验证铁死亡通路的关键蛋白（TFRC、GPX4）

ELISA检测FGR⁃S组10例与CON组10例TFRC、GPX4的浓度，TFRC在FGR⁃S组明显上调，而GPX4 2组差异无统计学意义（P>0.05），见表4、图7。

3 讨论

本研究对孕晚期FGR⁃S组、SGA组与CON组的羊水样本，分别筛选FGR⁃S对比正常样本、小于SGA对比正常样本，FGR⁃S对比SGA的差异表达蛋白，并对差异蛋白进行功能、通路富集分析及蛋白质⁃蛋白质相互作用网络。

将FGR⁃S、SGA 2组病例组及对照组CON两两比较，即FGR⁃S/CON、FGR⁃S/SGA、SGA/CON， FGR⁃S/CON组差异蛋白主要功能为神经活性配体⁃受体相互作用、肾素⁃血管紧张素系统、细胞因子与细胞因子受体间相互作用、肾素分泌、肠道产生IgA的免疫网络等。SGA/CON组差异蛋白主要功能包括核糖体、TGF⁃β信号通路等。FGR⁃S/SGA组差异蛋白主要功能包括病毒性心肌炎、糖尿病心肌病、氮代谢、N⁃Glycan生物合成等。

以正常对照组、小于胎龄胎儿、严重胎儿生长受限的顺序，即正常到疾病轻度再到疾病重度的顺序，进行聚类蛋白分析，并将聚类蛋白进行功能、通路富集分析。cluster 4和cluster 6分别呈现出由对照组到疾病程度较轻的SGA，再到最严重的FGR⁃S的递增和递减的趋势，涉及的分子通道包括：铁死亡、谷胱甘肽代谢、脂肪的消化与吸收、蛋白质的消化与吸收、氨基糖和核苷酸糖的代谢、凋亡、精氨酸和脯氨酸代谢、c型凝集素受体信号通路、肾素分泌、肾素⁃血管紧张素系统、Wnt信号通路等。

将强度高（该技术的要求）的差异明显、可能与FGR发生机制相关的20种蛋白质进行PRM验证，成功验证17种蛋白质，其中15种在FGR⁃S/CON、SGA/CON两个比较组的差异趋势与定量结果比较的趋势完全一致。这15种蛋白质在疾病FGR中的研究将分述如下：

（1）三肽蛋白酶1（Tripeptidyl peptidase 1，TPP1）。Bertrand等^［19］2024年研究揭示了与端粒生物学紊乱相关的TPP1端粒因子TEL区域的新突变，可能与胎儿生长受限有关。Pirzada等^［20］2019年研究探讨了TRF2和TPP1调节在胎儿发育中的作用，提出不适当的POT1⁃TPP1结合可能会通过在发育中的胚胎中诱导细胞衰老，从而影响胎儿发育。Kocak等^［21］2014年讨论了TPP1蛋白TEL区域的一个基因突变如何导致Hoyeraal⁃Hreidarsson综合征，该病通常与胎儿生长延迟有关。

（2）泌乳素（Prolactin，PRL）。Phillips等^［22］2001年的研究表明，在羊中，胎盘生长的限制对生长受限胎儿的泌乳素轴有影响，显示了胎盘生长限制对胎儿泌乳素及其受体mRNA表达的差异性影响。Ain等^［23］2005年研究发现地塞米松诱导的胎儿生长限制影响了胎盘泌乳素家族、胰岛素样生长因子⁃Ⅱ以及Akt信号通路，进一步揭示了泌乳素在胎儿生长受限中的作用。Savirón⁃Cornudella等^［24］2022年讨论了泌乳素（PRL）和生长激素（GH）及其与胎儿生长受限的关联，强调了泌乳素在胎儿生长调节中的重要性。

（3） C反应蛋白（C⁃reactive protein，CRP）。Nikbakht等^［25］2020年进行前瞻性队列研究指出，早孕期母体血清中的CRP水平可以预测胎儿生长受限和早产。Sauder等^［26］2019年研究分析了尼泊尔农村地区的孕妇，探讨了妊娠期间母体炎症与胎儿生长受限之间的关系。Erkenekli等^［27］2015年研究发现，FGR的孕妇血浆中的新蝶呤和CRP水平更高。

（4）内皮素3（Endothelin 3，EDN3）。内皮素是内皮细胞产生的血管收缩肽，是内皮素家族的成员。Westerberg等^［28］2024年研究观察到子痫前期妊娠妇女胎儿脐静脉中EDN3水平的变化，EDN3在胎儿发育过程中扮演重要角色，这项研究提示EDN3可能与胎儿生长受限有关联。

（5）层黏连蛋白α2亚基（Laminin subunit alpha 2，LAMA2）。层黏连蛋白是一种细胞外蛋白，是基底膜的主要成分之一。目前关于蛋白“LAMA2”在FGR研究的信息非常有限。没有直接的研究结果表明LAMA2与FGR之间有直接关联。LAMA2主要与先天性肌肉营养不良症（Congenital Muscular Dystrophy）相关，这种疾病影响肌肉功能和结构。Pan等^［29］2020年的研究提到LAMA2作为基底膜的主要组成部分，在胚胎发育期间介导细胞附着和迁移至组织中，但这项研究更多地集中于其在胎膜炎症和早产中的作用，而不是直接涉及FGR。

（6）内质网蛋白29（Endoplasmic reticulum protein 29，ERP29）。在内质网（ER）中通过参与蛋白质的折叠可能在分泌蛋白质的加工中起着重要作用。Wang等^［30］2024年研究探讨了ERP29在妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）中的作用，特别是ERP29对胎盘滋养层细胞过度凋亡的影响，这可能与胎儿生长受限有关。Zou等^［31］2020年研究发现ERP29通过调节上皮⁃间质转化（EMT）影响人类滋养外细胞HTR⁃8/SVneo的迁移和侵袭能力，可能对胎儿正常发育具有重要的作用。这些研究表明，ERP29在调节胎盘功能和胎儿生长过程中可能发挥关键作用，尤其是在胎盘滋养层细胞的凋亡和迁移能力方面。这些发现为进一步探索ERP29在胎儿生长限制中的潜在机制提供了重要线索。

（7）蛋白质二硫键异构酶家族A成员3（Protein disulfide isomerase family A member 3，PDIA3）。在探讨蛋白质PDIA3与胎儿生长受限（FGR）的关系方面，目前的研究较为有限。Gęca等^［32］2022年的研究表明，PDIA3在晚发性胎儿生长受限（late⁃onset FGR）的胎盘中的表达发生变化。这项研究通过比较正常妊娠与FGR妊娠的胎盘蛋白质组，探讨了PDIA3在FGR中的潜在作用。Mo等^［33］2020年在另一项研究中发现PDIA3通过MDM2/p53途径调节子痫前期中滋养层细胞的凋亡和增殖，虽然这项研究主要关注子痫前期，但它提供了PDIA3可能影响胎盘功能和胎儿生长的证据。这些研究表明，PDIA3可能通过影响滋养层细胞的生存和死亡在调节胎盘功能和影响胎儿生长方面发挥作用。然而，直接关于PDIA3与FGR的研究仍然较少，需要更多的研究来深入理解其在FGR中的具体作用和机制。

（8）类胰岛素生长因子结合蛋白1（Insulin like growth factor binding protein like 1，IGFBPL1）。目前，关于蛋白“IGFBPL1”在胎儿生长受限研究的信息非常有限。然而，与胎儿生长受限相关的研究通常涉及胰岛素样生长因子（IGF）系统，包括IGF⁃I、IGFBP⁃1等，这些因子在胎儿生长和发展中起着重要作用。考虑到IGFBPL1与IGF系统的潜在相关性，对IGF系统在FGR中的作用的研究可能为理解IGFBPL1在此过程中的角色提供间接证据，但具体到IGFBPL1的研究，目前尚需进一步的科学探索和论证。

（9）背侧化因子（Chordin，CHRD）。这是一个关键的发育蛋白，通过结合腹侧化TGF⁃beta样的骨形态发生蛋白并将其隔离在潜在的复合物中，来自侧化早期的脊椎动物胚胎组织。目前没有直接关于Chordin蛋白在FGR中的研究资料。关于CHRD的研究主要聚焦于Chordin与骨形态发生蛋白（BMP）的相互作用及其在胚胎发育中的角色，但未明确涉及到FGR的具体研究。Chordin作为BMP的抑制因子，在多个生物过程中扮演重要角色，包括胚胎发育和组织形成等，但其在FGR上的作用和机制仍需进一步的研究探索。

（10）β⁃连接蛋白相互作用蛋白1（Catenin beta interacting protein 1，CTNNBIP1）。未找到直接探讨蛋白CTNNBIP1在FGR研究的文献。CTNNBIP1作为β⁃catenin的抑制因子，在Wnt/β⁃catenin信号通路中发挥重要作用，影响细胞增殖、分化和胚胎发育。然而，其在胎儿生长限制中的具体角色和机制尚未被明确描述。

（11）碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase， biomineralization associated，ALPL）。未找到直接探讨蛋白ALPL在FGR研究的文献。ALPL是一种在多种组织中表达的酶，主要参与骨骼的矿化过程。

（12）组织蛋白酶L（Cathepsin L，CTSL）。Varanou等^［34］2006年研究强调了半胱氨酸蛋白酶家族（包括CTSL）在胎盘发育中的重要性。尽管该研究直接与FGR的联系并未明确提及，但胎盘的正常发育对于维持正常的胎儿生长至关重要，提示了CTSL在FGR中可能扮演的角色。Crocker等^［35］2004年研究探讨了CTSL在并发先兆子痫和FGR的妊娠中的胎盘细胞动力学的改变，虽然这一发现仅仅间接地与FGR相关，但提供了CTSL在胎盘功能和胎儿生长中可能发挥作用的线索。

（13）血管紧张素转化酶（Angiotensin I converting enzyme，ACE）。Delforce等^［36］2019年研究讨论了胎盘肾素⁃血管紧张素系统在人类FGR中的紊乱，强调了ACE在其中的作用，指出胎盘肾素⁃血管紧张素系统的紊乱可能是FGR发生的重要机制之一。Nakamura等^［37］2012年研究发现，母体ACE基因缺失等位基因与FGR有关联。研究指出，母体ACE基因的特定多态性可能影响胎儿的生长，与FGR的发生有关。Bharadwaj等^［38］2011年研究指出，ACE2的缺乏与孕期体重增加不足和FGR有关。这表明，ACE及其相关分子在调节胎儿生长和发育中可能起着重要的作用。以上研究揭示了ACE及其相关通路在FGR中可能的作用机制。

（14）碳酰酯脂肪酶（Carboxyl ester lipase，CEL），是一种糖蛋白，在食物脂质的完全消化和在肠道的吸收中发挥着至关重要的作用，同时也促进了脂溶性维生素的吸收。未找到直接探讨蛋白CEL在FGR研究的文献。CEL主要在胰腺中表达，并参与脂肪的消化和代谢，其在FGR中的作用可能并非研究的主要焦点。FGR的研究通常更多关注那些直接影响胎盘功能、胎儿血液供应或胎儿营养吸收的因子。

（15）α血红蛋白稳定蛋白（Alpha hemoglobin stabilizing protein，AHSP）。Emanuelli 等^［39］2008年研究探讨了AHSP在妊娠期HELLP综合征、胎儿生长受限和胎儿死亡中的作用。研究目的是调查AHSP在妊娠应激反应中的涉及情况，特别是它在胎儿生长受限中的潜在影响。该研究表明AHSP可能是通过在红细胞稳定性和抗应激反应中的作用在胎儿生长受限中发挥着重要作用。然而，关于AHSP直接在FGR中作用的详细机制和影响，仍需要进一步的研究来阐明。

检索聚类分析中递增或递减蛋白富集通路在疾病“Fetal Growth Restriction”中的研究，在Pubmed及Web of Science中检索发现，铁死亡通路（Ferroptosis Pathway）在FGR中的作用已成为近年来的研究热点。Yu等^［40］2024年研究通过建立1⁃NP暴露的孕鼠模型，实验证实了1⁃NP诱导胎儿生长限制、胎盘损伤及铁死亡的现象。Guo等^［41］2023年发现母体蛋白质缺乏损害胎盘的过氧化物酶体生物生成并导致胎儿生长限制后代的氧化应激和铁死亡。Sun等^［42］2024年通过使用双酚A（BPA）建立小鼠模型，研究进一步探讨了BPA暴露对胎儿生长、胎盘铁死亡及YAP/TAZ通路的影响。Zaugg等^［43］2022年在综述铁转运和铁死亡通路的新兴作用中提到：在流产胎儿的胎盘中发现第一孕期的HO1水平升高，以及第一和第二孕期的HO⁃1/FPN1比率增加，作者将这些发现与铁死亡联系起来，因为研究显示HO1过表达增强了由erastin（铁死亡诱导剂）引起的铁死亡，此外，有研究报道了自发性早产流产中GPX4表达减少，而长非编码RNA H19表达增加。在lncRNA H19沉默的人类滋养层细胞系中，GPX4的表达也减少，支持铁死亡可能在自发流产中发挥作用的假设。查询聚类分析中cluster4和cluster6中这两个通路及上下游通路中的相关蛋白，与铁死亡的相关蛋白有GPX4、GCLC和TFRC。

TFRC（Transferrin receptor），转铁蛋白受体，三价铁离子（Fe³⁺）与转铁蛋白（Tf）结合形成Tf⁃2Fe³⁺复合物通过同源二聚体跨膜蛋白转铁蛋白受体1（TFRC）在合胞体滋养层表面的微绒毛质膜（MVM）上进行内吞作用。TFRC在FGR⁃S组相较于对照组明显上调（比值1.54，P值0.008）。同时用酶联免疫法测量FGR⁃S组及对照组羊水TFRC浓度，证实了FGR⁃S组较对照组明显上调。

GPX4（Glutathione peroxidase 4），谷胱甘肽过氧化物酶4，是一种必需的抗氧化剂过氧化物酶，通过防止膜脂过氧化，在保护细胞免受氧化损伤中起关键作用，防止细胞铁死亡（Ferroptosis），铁死亡是一种铁依赖性由脂质活性氧的积累引起的非凋亡的程序性细胞死亡^{［16⁃18］}。该蛋白在从CON组至SGA组，再到FGR⁃S组的差异蛋白聚类分析中呈现递减趋势。在FGR⁃S组相较于对照组明显下调（比值0.41，P值0.001）。但酶联免疫法测量FGR⁃S组及对照组羊水GPX4的浓度，比较差异无统计学意义，可能由于样本中GPX4的浓度较低导致两种检测的结果不一致。

谷氨酸⁃半胱氨酸连接酶催化亚基（Glutamate⁃cysteine ligase catalytic subunit，GCLC），催化L⁃谷氨酸和L⁃半胱氨酸的ATP依赖性连接，并参与谷胱甘肽（glutathione，GSH）生物合成的第一步和限速步骤。该蛋白在FGR⁃S组与CON组的比较（FGR⁃S/CON）和SGA组与对照组比较（SGA/CON）中表现为明显下调（比值分别为0.44、0.38，P值分别为0.044、0.045）。

研究发现，基于质谱的4D⁃LFQ蛋白质组定量技术检测结果提示：FGR⁃S组的GPX4、GCLC相对于对照组明显下调，TFRC明显上调。GCLC的减少导致GSH生物合成减少，进而导致GPX4的生成减少，GPX4的功能为抑制磷脂过氧化和铁死亡，GPX4的减少提示FGR胎儿或胎盘铁死亡增多；TFRC与铁死亡正相关，在FGR⁃S组TFRC的表达上调，提示该组铁死亡通路上调。后续行TFRC及GPX4的ELISA检测，FGR⁃S组TFRC较正常对照组明显上调，而GPX4差异无统计学意义。

目前羊水蛋白质组学的研究较少，对FGR羊水进行蛋白质组学研究，蛋白质作为生理功能的直接执行者，更能直接反映与揭示疾病发生机制，为进一步探寻FGR发生机制提供新思路。

本研究样本量有限，在下一步的研究中可扩大样本量，并行铁死亡通路关键蛋白的验证以及细胞、动物实验层面的功能验证。

通过对生长受限胎儿的羊水用基于质谱的4D⁃Label⁃free Quantification （4D⁃LFQ）定量蛋白质组学进行研究，严重生长受限胎儿组对比正常组共鉴定到差异蛋白235个（137个上调，98个下调），小于胎龄胎儿组对比正常胎儿共鉴定到197个差异蛋白（111个上调，86个下调）。PRM验证显著差异蛋白，ELISA验证铁死亡通路相关蛋白，蛋白TPP1、PRL、CRP、EDN3、LAMA2、ERP29、PDIA3、IGFBPL1、CHRD、CTNNBIP1、ALPL、CTSL、ACE、CEL、AHSP、TFRC有望成为胎儿生长受限预测的生物标志物。

作者贡献度说明：

凌奕：设计实验，论文审校；陈甦：设计实验，完成实验、实验数据统计及撰写论文；卫焱星、揭秋玲：协助实验设计及实验指导；陈泽俊、许莹红、王婷、何桂林、王丽、刘春桃、陈月芬、王瑞霞、朱薪：临床病历收集；卫焱星：论文修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

海南省自然科学基金(822RC825)

国家自然科学基金(82471718)

广东省自然科学基金(2024A1515012754)

2023年大学生创新项目(X202311810081)