LncRNA APOBEC3B‑AS1对食管鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡影响

Effects of LncRNA APOBEC3B‑AS1 on proliferation, migration, invasion, and apoptosis of esophageal squamous carcinoma cells

摘要

目的 研究长链非编码RNA（long non‑coding RNA，LncRNA）APOBEC3B‑AS1对食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）细胞系EC109和KYSE150增殖、凋亡、侵袭及迁移等生物学特性的影响，并探讨其潜在的作用机制。 方法 在ESCC细胞系EC109、KYSE150中转染沉默APOBEC3B‑AS1的慢病毒，并使用qRT‑PCR检测其表达。采用CCK‑8、EdU实验观察基因沉默前、后细胞增殖能力的变化；流式细胞技术检测细胞凋亡、周期变化；Transwell实验观察细胞迁移及侵袭能力的变化；选择慢病毒稳转ESCC细胞株送转录组测序；Western blot检测细胞内N‑cadherin、E‑cadherin、Vimentin蛋白表达及下游信号通路相关蛋白的表达；在转染沉默APOBEC3B‑AS1的慢病毒的EC109、KYSE150细胞系中加入广谱PI3K信号通路抑制剂LY294002；采用CCK‑8实验观察加入信号通路抑制剂前、后细胞增殖能力的变化；Transwell实验观察细胞迁移及侵袭能力的变化；流式细胞技术检测细胞凋亡的变化。 结果 APOBEC3B‑AS1促进ESCC细胞增殖、侵袭、迁移，抑制细胞凋亡（P<0.05）。下调APOBEC3B‑AS1并加入PI3K/AKT信号通路抑制剂后，ESCC细胞增殖能力明显降低（P<0.05），细胞迁移、侵袭能力降低（P<0.01）；细胞凋亡进一步增加（P<0.05）。APOBEC3B‑AS1可能通过PI3K/AKT通路来推动肿瘤的发生与进展。 结论 LncRNA APOBEC3B‑AS1促进ESCC细胞的增殖、侵袭和迁移，抑制细胞凋亡，并推测其通过PI3K/AKT信号通路在ESCC细胞中发挥重要作用。

Abstract

Objective To investigate the effects of long chain non‑coding RNA （LncRNA） APOBEC3B‑AS1 on the biological characteristics of esophageal squamous cell carcinoma （ESCC） cell lines EC109 and KYSE150， such as proliferation， apoptosis， invasion， and migration， and to explore its potential mechanism of action. Methods Lentivirus silencing APOBEC3B‑AS1 was transfected in ESCC cell lines EC109 and KYSE150， and the expression was detected by qRT‑PCR. CCK‑8 and EdU assays were applied to observe the changes in cell proliferation ability before and after gene silencing； flow cytometry was used to detect apoptosis and cycle changes； Transwell assay was used to observe the changes in cell migration and invasive abilities； lentiviral‑stabilized ESCC cell lines were selected and sent to transcriptome sequencing； Western blot was used to detect intracellular expressions of N‑cadherin， E‑cadherin， Vimentin， and downstream signaling pathway related proteins. LY294002， a broad‑spectrum PI3K signaling pathway inhibitor， was added to the lentiviral transfected EC109 and KYSE150 cell lines silenced with APOBEC3B‑AS1； CCK‑8 assay was applied to observe the changes in cell proliferation ability before and after the addition of the signaling pathway inhibitor； Transwell assay was used to observe the changes in cell migration and invasion abilities， and flow cytometry was used to detect the changes in cell apoptosis. Results APOBEC3B‑AS1 promoted cell proliferation， invasion， migration， and inhibited apoptosis in ESCC cells （P<0.05）. After the down‑regulation of APOBEC3B‑AS1 and addition of PI3K/AKT signaling pathway inhibitors， ESCC cell proliferation ability was significantly reduced （P<0.05）； cell migration and invasion abilities were reduced （P<0.01）， and apoptosis was further increased （P<0.05）. APOBEC3B‑AS1 may drive tumorigenesis and progression through the PI3K/AKT pathway. Conclusion LncRNA APOBEC3B‑AS1 promotes the proliferation， invasion， and migration of ESCC cells and inhibits apoptosis， and is hypothesized to play an important role in ESCC cells through the PI3K/AKT signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

食管鳞癌 / APOBEC3B‑AS1 / 细胞增殖及凋亡 / 细胞迁移及侵袭

Key words

Esophageal squamous cell carcinoma / APOBEC3B‑AS1 / Cell proliferation and apoptosis / Cell migration and invasion

食管癌是全球新发病例排名第11、死亡病例数排名第7的恶性肿瘤疾病^［1］。食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是食管癌中在我国较为常见的一种病理组织分型^［2］。ESCC在中国的西北地区较为高发，该疾病的预后较差，同时食管癌的侵袭性较高，多数患者在确诊时已经到疾病中晚期，不同类型的食管癌的治疗方案基本相似。ESCC主要起源于上、中段食管鳞状上皮。ESCC疾病的危险因素主要为吸烟和饮酒，其他危险因素有腌制蔬菜、加工肉类食品、过热饮食习惯、新鲜水果摄入不足、口腔卫生差、低BMI等^［3］。

长链非编码RNA（long non‑coding RNA，LncRNA）是指一种长度大于200个核苷酸的转录产物^［4］。近年来的研究表明，LncRNA在调控基因表达方面具有重要作用，可通过表观遗传、转录及转录后蛋白质修饰等多个层次参与人体的病理生理过程^［5］。因此，研究LncRNA对于ESCC患者的预后监测和药物靶向治疗具有重要意义。

本课题组通过基因芯片技术对ESCC及其癌旁组织中差异表达的基因进行筛选，发现ESCC患者的组织中存在多种LncRNA和mRNA异常表达，其中LncRNA APOBEC3B‑AS1在ESCC中高表达样本中差异倍数为3.8倍^［6］。目前LncRNA APOBEC3B‑AS1在ESCC中的相关作用尚不明确，本研究通过在ESCC细胞系EC109、KYSE150中下调LncRNA APOBEC3B‑AS1，研究ESCC增殖、侵袭、迁移、凋亡等细胞表型的变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验使用了由石河子大学医学院新疆地方与民族高发病重点实验室保存的人ESCC细胞系EC109、KYSE150、TE‑1；BI血清、DMEM基础培养基购于美国Gibco公司；RNA提取试剂Trizol、反转录试剂盒购于美国赛默飞公司；qRT‑PCR试剂盒购于CWBIO公司；胰蛋白酶购于中国Solarbio公司；PCR相关的引物购于上海生工生物工程股份有限公司。慢病毒转染试剂购于上海吉玛生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel胶购于美国Corning公司；CCK‑8试剂、EdU试剂购于APExBIO公司；Western blot抗体E‑Cadherin、N‑Cadherin、Vimentin购于武汉博士德生物工程有限公司；GAPDH抗体、二抗山羊抗兔IgG抗体、山羊抗小鼠IgG抗体购于北京中杉金桥公司；PI3K/P‑PI3K抗体购于艾比玛特Abmart公司；AKT/P‑AKT抗体购于Cell Signaling Technology公司。

1.2 研究方法

在细胞培养过程中，使用含10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素的DMEM培养基，温度37 ℃、5% CO₂和95%湿度。当细胞密度达80%时进行换液和传代。使用上海吉玛生物科技有限公司的APOBEC3B‑AS1沉默慢病毒转染细胞，按照手册接种细胞，待融合度达40%~60%时加入病毒液，继续培养并观察状态。5~6 d后监测荧光表达，慢生长细胞可适当延长培养时间。

沉默序列为sh‑APOBEC3B‑AS1（5'‑GAGATCACAGTGTAGGGAAAT‑3'），对照组为sh‑NC（5'‑TTCTCCGAACGTGTCACGT‑3'），空组为Control。转染后添加2 ng/mL嘌呤霉素筛选，逐代获得稳定表达细胞株。最终用Trizol提取RNA，逆转录合成cDNA，通过qRT‑PCR检测APOBEC3B‑AS1表达，以β‑actin作为内参，使用相对定量2^-ΔΔct方法分析表达水平。

1.3 细胞增殖实验

在细胞增殖的实验中，首先将需要检测的细胞接种于96孔板，密度为8 000个细胞/孔，并在适宜的培养基中培养24 h。EdU实验：添加EdU并在37 ℃孵育2 h后，用4%多聚甲醛固定细胞，随后用0.5% Triton X‑100处理以使细胞膜通透，再与点击化学反应剂反应以检测EdU，形成荧光染色产物，并用Hoechst 33342对细胞核进行染色，最后通过荧光显微镜观察EdU标记的细胞。而在CCK‑8检测中，将细胞接种于96孔板，密度为10 000个细胞/孔，并在适宜的培养基中培养以维持细胞活力。在处理液中，混合10% CCK‑8与DMEM培养基，去除孔中培养基后加入处理液，使细胞充分接触，之后在37 ℃孵育2 h。最后，使用酶标仪或分光光度计在450 nm波长下测定各组细胞处理液的吸光度（OD值）。

1.4 细胞迁移、侵袭实验

在Transwell迁移实验中，使用孔径为0.8 μm的小室，室内加入细胞悬液，并在配套的24孔板内加入600 μL含20% FBS的培养基，小室小心放入孔内以避免气泡产生。经过24~48 h后，拿出Transwell小室，去除孔内培养液，用PBS洗涤2次，然后用4%多聚甲醛固定30 min，适度风干后，染色0.1%结晶紫30 min，轻轻擦去未迁移的细胞，再用PBS洗涤2次，待风干后在100×显微镜下随机记录5个视野的细胞数量。对于Transwell侵袭实验，先在小室底膜的上室面铺设稀释1∶8的Matrigel，以使其在37 ℃下聚合成凝胶，接着加入50 μL含10 g/L BSA的无血清培养液在37 ℃下水化，其他操作方法与细胞迁移实验相同。

1.5 细胞凋亡、细胞周期实验

在流式细胞仪检测细胞凋亡实验中，首先在6孔板中培养细胞至60%~70%汇合，PBS洗涤后，用胰酶消化，收集单细胞悬液并离心1 000 r/min 5 min，弃上清后用PBS重悬计数。取5×10⁴~10×10⁴细胞，离心1 000 r/min 5 min，弃上清，加入195 μL的Annexin V‑FITC结合液轻悬，添加5 μL的Annexin V‑FITC，在室温避光孵育10 min。再次离心1 000 r/min 6 min后去上清，加入190 μL的Annexin V‑FITC结合液重悬，加入10 μL碘化丙啶染色液，混匀后在冰浴中避光孵育，最后进行流式细胞仪检测。对于细胞周期检测，从样本中取1×10⁷个细胞于1 mL培养基重悬，离心1 000 r/min 5 min后，弃上清，加入300 μL PBS重悬。再加入700 μL无水乙醇，-20 ℃冰箱固定超过24 h。取样品在4 ℃以下离心1 000 r/min 5 min，弃上清，使用1 mL预冷PBS洗涤2次。最后用0.5 mL PI/Rnase染色缓冲液重悬细胞，于室温孵育15 min，并使用流式细胞仪测定细胞DNA含量，确定各细胞周期比例。

1.6 Western blot检测上皮‑间质细胞转化（epithelial‑mesenchymal transition， EMT）相关蛋白表达

收集T25瓶内90%~100%细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白，并利用BCA法测定蛋白浓度。采用SDS‑PAGE进行蛋白电泳，并在400 mA的恒流条件下将蛋白转印至PVDF膜上。将PVDF膜放入5% BSA的TBST封闭液中，封闭0.5 h后，加入一抗，于4 ℃下孵育过夜。洗膜后，再添加二抗，于37 ℃下孵育1 h。再洗膜后加入发光液，并使用ImageJ软件测定蛋白条带的积分光密度值，检测EMT相关蛋白（如E‑cadherin、N‑cadherin、Vimentin及PI3K/P‑PI3K、AKT/P‑AKT）表达，以GAPDH作为内参。

1.7 转录组测序

选取经慢病毒成功转染后的稳定转染细胞株，采用Trizol试剂提取细胞总RNA，参照RNA试剂盒说明书送至多莱泌生物科技公司进行转录组测序。

1.8 PI3K信号通路抑制剂使用

LY294002是一种广泛使用的PI3K抑制剂，常用于研究细胞生长、增殖、凋亡、迁移等与PI3K/AKT通路相关的生物学过程。通过查阅文献［7］及预实验结果确定该药物的使用浓度为20 μmol/L，药物刺激时间为24 h。

1.9 统计学处理

使用SPSS 26.0软件进行数据分析，GraphPadPrism 9.0软件绘制统计图表。符合正态分布且具备方差齐性的计量资料以\overline{x}\pm s表示，两组间的比较采用独立样本t检验；3组间的比较采用单因素方差分析。不满足正态分布条件或方差不齐的数据采用非参数检验或秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 qRT‑PCR检测ESCC细胞系LncRNA APOBEC3B‑AS1表达情况及转染效率

在对ESCC细胞系TE‑1、EC109、KYSE150的分析中，检测发现EC109和KYSE150细胞系中LncRNA APOBEC3B‑AS1的表达水平高于TE‑1细胞系（P<0.05），见图1A。

为进一步探讨APOBEC3B‑AS1的功能，本研究对EC109和KYSE150细胞系进行了APOBEC3B‑AS1及其相应空载体（APOBEC3B‑AS1 NC）慢病毒转染，并采用qRT‑PCR评估转染后的表达水平。慢病毒转染实验的结果表明，在转染sh‑APOBEC3B‑AS1的细胞组（包含3个沉默位点APOBEC3B‑AS1‑1、APOBEC3B‑AS1‑2、APOBEC3B‑AS1‑3）中，APOBEC3B‑AS1‑3组的表达量明显低于sh‑NC组（P<0.05），见图1B、C。后续实验组选择sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组。结果表明APOBEC3B‑AS1在TE‑1、EC109、KYSE150细胞系中被成功下调，且差异具有统计学意义。

2.2 沉默APOBEC3B‑AS1对ESCC细胞增殖的影响

EdU的实验结果显示，在转染沉默APOBEC3B‑AS1的慢病毒之后，KYSE150细胞系sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组细胞增殖率明显低于Control组和sh‑NC组（P<0.001）。此外，EC109细胞系sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组细胞增殖率同样低于sh‑NC组和Control组（P<0.000 1）。以上结果表明，在沉默APOBEC3B‑AS1后，ESCC细胞增殖能力受到明显抑制，见图2A、B。

CCK‑8实验结果显示，转染沉默APOBEC3B‑AS1的慢病毒后，KYSE150细胞系sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组OD值明显低于sh‑NC组（P<0.05），表明细胞增殖活性降低；同样，EC109细胞系sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组OD值明显低于sh‑NC组（P<0.05），表明细胞增殖活性降低，见图2C。以上结果表明，沉默APOBEC3B‑AS1对ESCC细胞增殖具有明显的抑制作用。

2.3 沉默APOBEC3B‑AS1对ESCC细胞迁移、侵袭的影响

Transwell迁移实验结果表明，沉默ESCC细胞系EC109和KYSE150中的APOBEC3B‑AS1后，KYSE150和EC109的Control组及sh‑NC组的细胞迁移数量明显高于sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组（P<0.000 1），见图2D、E。

Transwell侵袭实验同样显示，沉默APOBEC3B‑AS1后，KYSE150和EC109的Control组和sh‑NC组的细胞侵袭数量明显高于sh‑APOBEC3B‑ AS1‑3组（P<0.000 1），见图2F、G。

2.4 沉默APOBEC3B‑AS1对ESCC细胞凋亡的影响

流式细胞术结果显示，在沉默APOBEC3B‑AS1后，KYSE150和EC109细胞系的细胞凋亡率明显增加，见图3A。在KYSE150细胞系中，Control组和sh‑NC组的细胞凋亡率明显低于sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组（P<0.000 1），见图3B。EC109细胞系的结果也显示，Control组和sh‑NC组的细胞凋亡率明显低于sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组（P<0.000 1），见图3B。以上结果表明，沉默APOBEC3B‑AS1可以明显增强ESCC细胞的凋亡。

2.5 沉默APOBEC3B‑AS1对ESCC细胞周期的影响

通过流式细胞术检测细胞周期变化，发现沉默APOBEC3B‑AS1后，KYSE150和EC109细胞系的S期细胞比例明显下降，同时G1期和G2期细胞比例明显增加（图3C、D）。在KYSE150细胞系中，sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组的S期细胞比例明显低于Control组和sh‑NC组（P<0.000 1）；在EC109细胞系中，sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组同样显示S期细胞比例明显降低（P<0.001），见图3E。以上结果表明，沉默APOBEC3B‑AS1可导致ESCC细胞不同细胞周期比例发生明显变化。

2.6 沉默APOBEC3B‑AS1对ESCC EMT相关蛋白表达的影响

通过Western blot实验检测EMT相关蛋白N‑cadherin、E‑cadherin和Vimentin的表达差异，见图4A。结果表明：在KYSE150细胞系中，Control组和sh‑NC组的N‑cadherin及Vimentin表达水平明显高于sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组（P<0.01）；Control组和sh‑NC组的E‑cadherin表达水平明显低于sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组（P<0.05），见图4B。在EC109细胞系中，Control组和sh‑NC组的N‑cadherin表达同样明显高于sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组（P<0.01），而E‑cadherin的表达水平明显低于sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组（P<0.01）。此外，Control组和sh‑NC组的Vimentin表达水平也明显高于sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组（P<0.05），见图4B。上述结果表明，沉默APOBEC3B‑AS1对ESCC细胞的EMT特征产生了明显影响。

2.7 沉默APOBEC3B‑AS1后转录组测序、KEGG富集分析结果及对PI3K/AKT信号通路关键蛋白表达的影响

转录组测序结果显示，沉默APOBEC3B‑AS1后sh‑APOBEC3B‑AS1组与sh‑NC组细胞系差异表达的基因有上调48个，下调为52个，见图5A~C。GO富集分析结果显示，差异表达基因主要参与细胞信号转导等生物过程，定位于细胞质等细胞组分，并与蛋白质结合等分子功能密切相关，见图5D。KEGG数据库富集分析得到前20相关信号通路，见图5E。

通过转录组测序结果的KEGG富集分析发现，许多差异基因富集于PI3K/AKT信号通路。为此，本研究采用Western blot实验分析了PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达，包括PI3K、P‑PI3K、AKT和P‑AKT，见图6A。在沉默APOBEC3B‑AS1的条件下，与sh‑NC组相比，KYSE150细胞系中sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组P‑PI3K、P‑AKT表达水平明显降低（P<0.05）；sh‑NC组和sh‑APOBEC3B‑ AS1‑3组中PI3K、AKT蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），见图6B。在EC109细胞系中，与sh‑NC组相比，sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组P‑PI3K、P‑AKT表达水平同样明显降低（P<0.05）；sh‑NC组和sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组中PI3K、AKT蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），见图6B。沉默APOBEC3B‑AS1后会对PI3K/AKT信号通路蛋白磷酸化水平产生影响。

2.8 沉默APOBEC3B‑AS1后应用PI3K/AKT信号通路抑制剂对ESCC细胞增殖的影响

通过CCK‑8实验评估PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002对ESCC细胞增殖的影响。结果显示，LY294002明显抑制细胞的增殖。在KYSE150细胞系中，sh‑APOBEC3B‑AS1‑3+LY294002组的细胞增殖率明显低于sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组及sh‑NC+LY294002组（P<0.000 1），见图7A。在EC109细胞系中，sh‑APOBEC3B‑AS1‑3+LY294002组的细胞增殖率也明显低于sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组及sh‑NC+LY294002组（P<0.000 1），见图7B。相对于单独沉默APOBEC3B‑AS1，联合使用LY294002进一步抑制了ESCC细胞增殖能力。

2.9 沉默APOBEC3B‑AS1后应用PI3K/AKT信号通路抑制剂对ESCC细胞迁移、侵袭的影响

Transwell迁移实验结果显示，使用PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002能抑制ESCC细胞的迁移，见图7C。在KYSE150细胞系中，sh‑APOBEC3B ‑AS1‑3+LY294002组的细胞迁移数量明显低于sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组及sh‑NC+LY294002组（P<0.000 1），见图7D。同样，在EC109细胞系中，sh‑APOBEC3B‑AS1‑3+LY294‑002组的细胞迁移数量也明显低于sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组和sh‑NC+LY294002组（P<0.000 1），见图7D。上述结果表明，沉默APOBEC3B‑AS1后应用LY294002与单独沉默APOBEC3B‑AS1相比，进一步抑制ESCC细胞的迁移能力。

Transwell侵袭实验结果显示，通过沉默APOBEC3B‑AS1并结合PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002的处理，可以抑制ESCC细胞的侵袭，见图7E。在KYSE150细胞系中，sh‑APOBEC3B ‑AS1‑3+LY294002组的细胞侵袭数量明显低于sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组和sh‑NC+LY294002组（P<0.000 1），见图7F。在EC109细胞系中，sh‑ APOBEC3B AS1‑3+LY294002组的细胞侵袭数量明显低于sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组和sh‑NC+LY294002组（P<0.01），见图7F。上述结果表明，沉默APOBEC3B‑AS1后应用LY294002，与单独沉默APOBEC3B‑AS1相比，进一步抑制了ESCC细胞的侵袭能力。

2.10 沉默APOBEC3B‑AS1后应用PI3K/AKT信号通路抑制剂对ESCC细胞凋亡的影响

流式细胞术的结果显示，沉默APOBEC3B‑ AS1后联合使用PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002，能提高KYSE150和EC109细胞系的细胞凋亡率，见图7G。在KYSE150细胞系中，sh‑APOBEC3B‑AS1‑3+LY294002组的细胞凋亡率明显高于sh‑APOBEC3B‑AS1‑3组和sh‑NC+LY294002组（P<0.05），见图7H。在EC109细胞系中，同样观察到sh‑APOBEC3B‑AS1‑3+LY294002 组的细胞凋亡率明显高于sh‑NC+LY294002组和sh‑APOBEC3B‑AS1组（P<0.000 1），见图7G。上述结果表明，在沉默APOBEC3B‑AS1后应用LY29‑ 4002会进一步促进ESCC细胞的凋亡。

2.11 APOBEC3B‑AS1作用食管鳞癌细胞机制

通过沉默ESCC细胞系中的APOBEC3B‑AS1进行体外实验探讨APOBEC3B‑AS1对ESCC细胞系生物学行为的影响，结果表明APOBEC3B‑AS1可以促进ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭并抑制其凋亡，而沉默APOBEC3B‑AS1联合应用PI3K/AKT抑制剂后，ESCC细胞增殖、侵袭、迁移能力明显抑制，凋亡进一步增加（图8）。APOBEC3B‑AS1至少部分通过调控PI3K/AKT通路发挥作用，且可能与其他通路存在协同作用。

3 讨论

ESCC为消化道常见的肿瘤，且具有肿瘤的恶性程度高、预后差等特点，严重影响患者的生命健康。LncRNA在肿瘤疾病的研究中有着重要的研究意义，其能通过调控相关信号通路，影响肿瘤细胞的增殖、分化、转移和存活等生物学特征^［8］。有研究发现LncRNA SBF2‑AS1通过PI3K/AKT/MTOR信号通路调节乳腺癌细胞的增殖能力^［9］。LncRNA RHPN1‑AS1可通过miR‑7‑5p/EGFR/PI3K/AKT/mTOR信号通路影响前列腺癌细胞自噬和凋亡^［10］。LncRNA DLEU2通过PI3K/AKT信号通路影响胃癌细胞的迁移、侵袭能力^［11］。同时也有研究表明LncRNA在ESCC疾病诊断中具有较大的非侵入性诊断的潜力^［12］。例如LncRNA PTPRG ‑AS1通过结合miR‑599上调PDK1进一步影响ESCC细胞增殖、侵袭、迁移及糖酵解过程^［13］。LINC00680通过结合miR‑423‑5p促进PAK6的表达与ESCC的发展^［14］。本课题组前期的研究显示非编码RNA的异常表达与ESCC的增殖、侵袭、迁移、凋亡、细胞周期等生物学行为关系紧密^{［15‑17］}。

本研究中同时在EC109、KYSE150细胞系中通过慢病毒转入APOBEC3B‑AS1沉默序列，运用qRT‑PCR检测转染后的APOBEC3B‑AS1表达水平，确定最适合的转染组进行后续研究。肿瘤细胞拥有无限增殖的特性，沉默APOBEC3B‑AS1后两细胞系的增殖能力与对照组相比明显受到抑制。CCK‑8及EdU实验结果一致。同时细胞周期实验结果显示沉默APOBEC3B‑AS1后S期明显减少，同细胞增殖实验结果相互验证。可能是由于LncRNA APOBEC3B‑AS1通过调控与细胞周期相关的基因表达，引起细胞周期调控蛋白的变化，从而促进细胞从G1期进入S期。迁移、侵袭实验的结果显示沉默APOBEC3B‑AS1后，肿瘤细胞的迁移、侵袭能力受到抑制。这一现象可能通过激活某些信号通路，如EMT相关通路来实现。EMT是一种生物学过程，指的是在某些生理或病理情况下，上皮细胞丧失其原有的上皮特征并获得间充质细胞的特征^［18］。这一过程与上皮性恶性肿瘤的形成、发展和扩散密切相关^［19］。N‑cadherin和E‑cadherin为EMT相关钙黏蛋白，Vimentin为间质细胞波形蛋白。这些蛋白的变化涉及细胞黏附分子和细胞骨架蛋白的重要调控，是EMT过程中的关键标志物。这些变化使得上皮细胞能转变为表型更具侵袭性的间质细胞，从而在许多生理和病理过程中发挥作用，如胚胎发育、伤口愈合和肿瘤转移等^［20］。在本研究中Western blot结果也显示沉默APOBEC3B‑AS1后可以发现ESCC细胞的EMT进程受到抑制，与侵袭、迁移实验结果相印证。细胞凋亡情况结果显示，沉默APOBEC3B‑AS1后，细胞凋亡率明显升高，进一步说明LncRNA APOBEC3B‑AS1高表达，对肿瘤细胞的凋亡过程中起到抑制作用。LncRNA不仅在促进细胞增殖及侵袭中发挥作用，还可能在调控细胞存活方面起到调节作用，影响肿瘤的进展。

在转录组测序结果的分析中可知差异表达的上、下调基因数共计100个，通过KEGG数据库进行富集分析的前20条相关的信号通路中发现Human papillomavirus infection、Lipoic acid metabolism、Glycolysis/Gluconeogenesis、PI3K/AKT signaling pathway、p53 signaling pathway、AMPK signaling pathway等信号通路中基因的富集程度明显。同时PI3K/AKT、p53信号通路为研究肿瘤疾病的明星信号通路^{［21，22］}。PI3K‑AKT信号通路在多种肿瘤类型中发挥着重要的调控作用，包括头颈鳞癌^［23］、口腔鳞状细胞癌^［24］等。该信号通路通过调节与细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡相关的分子，影响肿瘤细胞的生物学行为。根据转录组测序结果及KEGG富集分析，本研究进一步验证了PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。本研究发现APOBEC3B‑AS1可以促进ESCC细胞增殖、迁移、侵袭并抑制凋亡，并进一步提出该LncRNA可能通过PI3K/AKT信号通路调控这些生物学过程。为验证这一假设，本研究设计了包括4个实验组的研究：sh‑NC组、sh‑APOBEC3B‑AS1组、sh‑APOBEC3B‑AS1联合PI3K抑制剂处理组（sh‑APOBEC3B‑AS1+PI3K抑制剂组）及sh‑NC抑制剂对照组。实验结果显示，沉默APOBEC3B‑AS1的细胞在与PI3K抑制剂共同处理后，其增殖能力明显减弱，细胞的迁移和侵袭能力也明显降低，细胞凋亡率明显增加。

本研究发现APOBEC3B‑AS1促进ESCC细胞的增殖、侵袭和迁移，抑制细胞凋亡，并推测其通过PI3K/AKT信号通路在ESCC细胞中发挥重要作用。这些发现为APOBEC3B‑AS1在临床诊疗中作为诊断标志物和治疗靶点提供了一定的理论基础，可以通过开发基于APOBEC3B‑AS1的靶向疗法，如RNA干扰或反义寡核苷酸，来抑制肿瘤的生长和转移，也可以通过检测ESCC患者的血清或食管拉网组织样本中APOBEC3B‑AS1的表达水平，来评估其作为诊断或预后标志物的敏感性和特异性。然而，在未来还需要继续探索APOBEC3B‑AS1与相关信号通路和肿瘤微环境的相互关系，进行大规模的临床研究，以验证APOBEC3B‑AS1在ESCC诊断和预后中的价值，从而真正实现基础实验到临床应用的转化。随着对APOBEC3B‑AS1研究的不断深入，其有望成为ESCC精准治疗的新靶点。

作者贡献度说明：

冯振源：重要实验操作、实验数据分析、研究论文撰写；王鹏：部分实验操作、研究论文审校；向辉：实验操作指导；王精藓、王银涛：文献查阅、实验操作辅助；陈卫刚：实验关键问题的指导、研究论文的修改及定稿。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

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