三七总皂苷改善抑郁样行为小鼠生精功能实验研究

Experimental study of Panax notoginseng saponins on improving spermatogenic function in mice with depression⁃like behavior

摘要

目的 探讨三七总皂苷（Panax notoginseng saponin， PNS）改善抑郁样行为小鼠的生精功能及可能机制。 方法 40只C57BL/6J雄性小鼠随机分成对照组（Control组）和模型组，模型组小鼠于右后爪足底注射完全弗氏佐剂（Complete Freund's Adjuvant，CFA）诱导抑郁样行为模型；抑郁样行为小鼠模型建立后再分为模型组（CFA‑D组）和药物干预组（CFA‑D+PNS组）；旷场实验检测小鼠活动情况，喷糖实验和强迫游泳实验检测小鼠抑郁样行为；检测小鼠睾丸和附睾重量、睾丸系数、附睾系数及精子计数检测小鼠生殖器官及精子数量等；H&E染色观察小鼠睾丸生精细胞形态变化、精子涂片计数精子畸形率；通过ELISA检测小鼠血清睾酮（T）、黄体生成素（LH）、促性腺激素释放激素（GnRH）、卵泡刺激素（FSH）变化情况。 结果 与Control组相比，模型组小鼠旷场内框活动时间（P<0.001）和活动距离（P<0.001）显著降低、舔背时间减少（P<0.001）、强迫游泳不动时间延长（P<0.01），小鼠睾丸重量（P<0.001）、附睾重量（P<0.01）、睾丸系数（P<0.001）、附睾系数（P<0.001）及精子计数（P<0.001）均降低，精子头（P<0.001）、颈（P<0.05）、尾（P<0.001）畸形率显著增高，睾丸生精上皮细胞排列松散且数量减少，同时，血清T（P<0.01）、FSH（P<0.001）、GnRH（P<0.001）、LH（P<0.001）表达明显减少；PNS干预后，小鼠内框活动时间（P<0.01）和活动距离（P<0.001）明显升高、舔背时间延长（P<0.001）、强迫游泳不动时间偏短（P<0.01），小鼠睾丸重量（P<0.001）、附睾重量（P<0.01）、睾丸系数（P<0.001）、附睾系数（P<0.05）及精子计数（P<0.01）明显升高，精子头（P<0.01）、颈（P<0.05）、尾（P<0.01）畸形率明显降低，睾丸生精上皮细胞排列紧密且数量增多，同时，血清T（P<0.05）、FSH（P<0.001）、GnRH（P<0.01）、LH（P<0.001）浓度增高。 结论 PNS明显改善抑郁样行为小鼠生殖器官萎缩、生精功能障碍；同时血清中T、LH、GnRH、FSH等浓度均升高，从而改善抑郁样行为小鼠的生精功能。

Abstract

Objective To explore the effect of Panax notoginseng saponin （PNS） on spermatogenesis in mice with depression-like behavior and its possible mechanism. Methods A total of 40 male C57BL/6J mice were randomly divided into the Control group and the model group （Complete Freund's Adjuvant， CFA）. The depression‑like behavior model was induced by injecting CFA into the sole of the right hind paw of mice in the model group. After the establishment of depression‑like behavior model， the mice were divided into the model group （CFA‑D group） and the drug intervention group （CFA‑D+PNS group）. Open field experiment was used to detect the activity of mice， sugar spray experiment and forced swimming experiment were used to detect depression‑like behavior of mice. Testes and epididymis weight， testes coefficient， epididymis coefficient， and sperm count were detected to check reproductive organs and sperm count of mice. Morphological changes of testicular spermatogenic cells and sperm deformities were observed by H&E staining. The changes of serum testosterone （T）， luteinizing hormone （LH）， gonadotropin releasing hormone （GnRH）， and follicle stimulating hormone （FSH） were detected by ELISA assay. Results Compared to the Control group， the activity time （P<0.001） and activity distance （P<0.001） in the model group were significantly reduced， the back licking time was reduced （P<0.001）， and the immobile time of forced swimming was prolonged （P<0.01）. Testicular weight （P<0.001）， epididymal weight （P<0.01）， testicular coefficient （P<0.001）， epididymal coefficient （P<0.001） and sperm count （P<0.001） were all decreased， and the malform rates of sperm head （P<0.001）， neck （P<0.05） and tail （P<0.001） were significantly increased. The number of spermatogenic epithelial cells decreased and the expression of T （P<0.01）， FSH （P<0.001）， GnRH （P<0.001）， LH （P<0.001） in serum decreased significantly. After PNS intervention， the inner frame activity time （P<0.01） and activity distance （P<0.001） were significantly increased， the back licking time was extended （P<0.001）， and the immobile time of forced swimming was shorter （P<0.01）. Testicular weight （P<0.001）， epididymal weight （P<0.01）， testicular coefficient （P<0.001）， epididymal coefficient （P<0.05）， and sperm count （P<0.01） were significantly increased， and the malform rates of sperm head （P<0.01）， neck （P<0.05）， and tail （P<0.01） were significantly decreased. The spermatogenic epithelial cells were closely arranged and increased in number. Meanwhile， serum T （P<0.05）， FSH （P<0.001）， GnRH （P<0.01）， LH （P<0.001） were increased. Conclusion PNS can significantly improve reproductive organ atrophy and spermatogenic dysfunction in depression-like mice. At the same time， the concentrations of T， LH， GnRH， and FSH in serum were increased， thus improving spermatogenic function of depression-like behavior mice.

Graphical abstract

关键词

三七总皂苷 / 抑郁样行为 / 生精功能

Key words

Panax notoginseng saponin / Depression-like behavior / Spermatogenic function

男性不育已经成为备受全球关注的重要的公共健康问题，精子生成障碍是男性生殖功能障碍的重要表现，也是影响男性健康和生活质量的重要因素^［1］。研究表明，过去几十年中，男性精子的数量、活力和形态等均出现了显著下降，甚至自2000年以来呈断崖式下降^［2］。精子生成障碍已成为我国成年男性生殖健康的主要威胁。

男性不育症的发生是一个多因素多阶段的过程，生精功能障碍与遗传、内分泌及环境因素相关。随着现代生活节奏加快，焦虑抑郁等精神心理因素对生殖功能的潜在影响渐显。大量临床和实验研究表明，男性生殖功能障碍与抑郁密切相关，两者相互影响又相互作用^［3］。抑郁症和生殖功能障碍可通过神经内分泌系统的紊乱、氧化应激反应和炎症介质的释放等途径相互影响^［4］。研究表明，抑郁症患者下丘脑‑垂体‑性腺（HPG）轴功能可能受到抑制，导致睾酮水平降低，进而影响生殖功能^［5］。

国内外大量流行病学研究显示，患有抑郁症的男性发生性功能障碍的风险显著增加，同时，抑郁症状的改善可显著改善生殖功能^［6，7］。在慢性应激诱导抑郁的动物模型中，雄性大鼠表现出显著的性欲减退、睾酮水平下降和精子质量下降等^［8］。在临床治疗中，抗抑郁药物是抑郁症管理的主要手段，但这些药物本身常对男性生殖功能产生负面影响^［9］。例如，选择性5‑羟色胺再摄取抑制剂和5‑羟色胺‑去甲肾上腺素再摄取抑制剂等常用抗抑郁药，与性欲减退、勃起功能障碍和射精延迟等副作用相关^［10］。

中国男性精子数量逐年下降，不育症增势明显，不育症病因复杂，传统诊疗效果有限，也促成了多学科与中西医融合的诊疗需求。有研究显示，三七总皂苷（Panax notoginseng saponin， PNS）联合淫羊藿总黄酮对大鼠生殖功能衰退具有显著影响，并可能具有促进生精功能的作用^［11］。本课题组前期研究发现，传统中药三七的主要有效成分PNS在改善完全弗氏佐剂（Complete Freund's Adjuvant，CFA）致小鼠慢性疼痛及抑郁样行为具有明显改善作用，但其是否能改善小鼠生精功能及作用机制还有待探讨^{［12，13］}。

男性生殖功能障碍和抑郁症是影响男性生理和心理健康的两大主要问题^［14］。二者不仅可独立存在，且常相互关联，形成一种相互作用相互影响的复杂关系。因此，本课题组利用慢性疼痛所致抑郁模型小鼠探讨抑郁对雄性小鼠生精功能的影响，同时选取PNS加以干预并探究其对抑郁样行为小鼠生精功能的作用和影响，以期为阐明疼痛抑郁与男性生殖障碍的关系和寻求临床传统中药治疗方案提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性７周龄C57BL/6J小鼠40只，体重（21±2） g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司［合格证号SYXK（湘）2017‑0013］，在温度（21±2） ℃，湿度（55%±5%），光照周期12 h /12 h，自由摄食与饮水的条件下使小鼠适应1周后再进行实验。动物实验根据国际医学科学组织理事会概述的国际生物医学研究动物实验指南准则进行，实验方案经海南医学院动物伦理委员会审批通过，编号：HYLL‑2023‑138。

1.2 抑郁样行为小鼠模型筛选、分组及给药干预

将实验动物按照随机数表法分为对照组（Control组）和模型组（CFA组），参照前期实验方法，CFA组小鼠右后爪足底皮下进行单次注射30 μL CFA （1 g/L），Control组小鼠注射等体积生理盐水；CFA建模14 d后，通过旷场实验、喷糖实验、强迫游泳实验检测小鼠抑郁样行为。筛选CFA组具有明显抑郁样行为的小鼠，再将其随机分为模型组组（CFA‑D）和药物干预组（CFA‑D+PNS）。

1.3 旷场实验^［15］

由纯白色隔板包围五面（长×宽×高=40 cm×40 cm×40 cm）组成的旷场内等分为25个方格，中间9格为中央格，周圈16格为周围格。将小鼠轻轻放于旷场中央格区域，摄像记录5 min小鼠在旷场内的活动情况。在更换小鼠之前，清理小鼠残留尿液及粪便并在用喷壶喷洒75%酒精且擦拭干净，以消除小鼠气味以及分泌物对实验的影响。记录并分析小鼠穿过中央格的活动距离和活动时间作为抑郁样行为的评价指标；小鼠在旷场中的活动总距离评价其活动度。

1.4 喷糖实验^［16］

小鼠置于旷场中，在其背部均匀喷洒10%蔗糖溶液，摄像记录5 min内小鼠行为。测试完毕后，统计5 min内小鼠舔咬背部的累计时间（舔背时间），以此反映小鼠的快感缺失症状和毛发梳理行为。

1.5 强迫游泳实验^［15］

强迫游泳装置为一开口圆柱形玻璃容器（高×直径=40 cm×20 cm）。实验时，以23~25 ℃水置入玻璃箱中，直至距箱底25 cm处，将小鼠轻放于装置中，然后摄像记录6 min内小鼠活动情况。小鼠漂浮于水面且四肢不动或者仅进行轻微划动使其头部保持在水的表面上方的时间记为有效不动时间。以后4 min小鼠的不动时间作为其抑郁样行为的评价指标。

1.6 H&E染色^［17］

取材固定：麻醉小鼠后，每组小鼠取一侧睾丸及附睾置于4%多聚甲醛中固定48 h。然后将睾丸组织对半切开，放在组织包埋盒中，做好标记，置于500 mL烧杯中，自来水冲洗4 h洗去残留4%多聚甲醛。组织块在500 mL烧杯中依次经过70%酒精浸泡过夜，80%酒精浸泡2 h，85%酒精浸泡1.5 h，最后将装有组织块的包埋盒置于脱水机自动脱水。根据组织块的大小，选择适当大小的包埋盒。首先在包埋盒中倒入熔化的石蜡，然后将脱水后的组织块按照切片要求调整好位置后放入包埋盒中，组织块尽量放在中间。将包埋盖盖好，然后持续将熔化的石蜡滴入，等到石蜡冷却凝固以后，便可取下包埋盒。包埋好的组织块经修整后可用于切片，也可保存在-20 ℃冰箱备用。

组织切片染色：取出冷冻的组织块，石蜡切片机连续切片，厚度4 μm，45 ℃恒温水浴捞片，将载玻片置于65 ℃烤片机中烘干3 h，防止脱片。依次将组织块切片放入二甲苯Ⅰ（15 min）、二甲苯Ⅱ（15 min）、100%乙醇Ⅰ（2 min）、100%乙醇Ⅱ（2 min）、95%乙醇Ⅰ（2 min）、90%乙醇Ⅰ（2 min）；自来水浸泡10 min；将切片置入含有苏木素染料的染色缸中，浸泡5 min；流水冲洗2次，1 min/次；将切片放于含1 %盐酸的乙醇中返15 s；流水冲洗8 min，可在显微镜下观察染色，若染色效果不理想，可重复步骤；苏木素染色，流水冲洗，返蓝，流水冲洗；将切片放入伊红染液中浸泡4 min；依次经过90%、95%、100%、100%乙醇进行梯度脱水；在二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ染色缸内各浸泡10 min；取出切片，滴加适量中性树脂，盖玻片封片。显微镜观察并拍照，镜下可见睾丸生精上皮细胞的细胞核呈蓝色染色，细胞质和肌纤维则呈粉红色或浅红色染色。

1.7 ELISA检测^［18］

小鼠麻醉后开腹、经心脏取血1 mL，室温静置30 min后2 000 r/min离心5 min取血清，遵照ELISA（BY‑JZF0053、BY‑EM220244、BY‑JZF1658、BY ‑JZF1604；博研生物）试剂盒说明，每孔加入50 μL血清进行检测，显色后通过通过酶标仪（MB‑530型，深圳汇松科技公司）检测吸光度，并计算血清睾酮（T）、黄体生成素（LH）、促性腺激素释放激素（GnRH）、卵泡刺激素（FSH）含量。

1.8 统计学处理

使用Graphpad Prism9.5统计学软件进行数据分析。采用t检验和多重t检验进行数据分析，数据以均值±标准差（\overline{x}\pm s）分析研究所有数据，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 建立抑郁样行为小鼠模型

通过CFA建立小鼠模型，通过旷场试验、喷糖实验、强迫游泳实验检测小鼠的活动情况和抑郁样行为。旷场结果显示：与Control组小鼠相比，CFA模型组小鼠在旷场中运动总距离（P=0.306）并无明显变化（图1B），但在旷场中央区域运动距离（P<0.001）和运动时间（P<0.001）显著降低（图1C、D）。喷糖实验与强迫游泳实验结果显示：与Control组相比，CFA模型组小鼠舔背时间减少（P<0.001，图1E），强迫游泳不动时间增多（P<0.001，图1F）。综合以上结果表明，CFA可诱导小鼠出现抑郁样行为。

2.2 PNS改善小鼠抑郁样行为

模型小鼠腹腔注射PNS进行14 d药物干预，行为学结果显示：与CFA组相比，PNS干预组小鼠在旷场中央区域运动距离（P<0.001）和运动时间（P<0.001）明显升高（图2C、D）。喷糖实验与强迫游泳实验结果显示：与CFA组相比，PNS干预组小鼠舔背时间增多（P<0.001，图2E），强迫游泳不动时间降低（P<0.001，图2F）。综合以上结果表明，PNS可明显改善小鼠抑郁样行为。

2.3 PNS改善小鼠睾丸及附睾萎缩并使精子数量增加

对各组小鼠睾丸重量、附睾重量、睾丸系数、附睾系数及精子数量进行了检测统计，结果显示：与Control组相比，模型组小鼠睾丸重量、睾丸系数（P<0.001），附睾重量（P<0.01）、附睾系数（P<0.001）均明显降低，精子数量（P<0.001）显著减少（图3A~E），而PNS干预后，小鼠睾丸重量、睾丸系数（P<0.001），附睾重量（P<0.01）、附睾系数（P<0.05）大小均升高，精子数量（P<0.01）明显增多（图3A~E），提示抑郁样行为小鼠出现生殖器官萎缩及精子生成减少，而PNS干预则显著改善了小鼠生殖器官萎缩情况，并使得精子数量增加，表明PNS可显著改善小鼠的生殖功能。

2.4 PNS改善小鼠睾丸生精细胞形态并降低精子畸形率

上述结果显示，PNS可明显增多小鼠精子数量，其是否通过改善小鼠生精功能从而提高小鼠精子生成？通过H&E染色睾丸切片对睾丸生精上皮细胞形态进行观察，结果显示：与Control组相比，模型组小鼠睾丸生精上皮细胞数量明显减少，且排列稀疏；而PNS干预后，小鼠的睾丸生精上皮细胞数量增多，排列紧密（图4A）。对小鼠精子涂片染色及小鼠精子畸形率统计，结果显示：与Control组相比，模型组小鼠精子头（P<0.001）、颈（P<0.05）、尾（P<0.001）畸形精子数均显著增多（图4B、C）；PNS干预后，小鼠精子头（P<0.01）、颈（P<0.05）、尾（P<0.001）畸形精子数均明显减少（图4B、C）。以上结果揭示，PNS可改善小鼠睾丸生精上皮细胞形态功能，降低小鼠精子畸形率，从而改善小鼠生殖功能。

2.5 PNS上调小鼠血清T、FSH、GnRH、LH水平

为了探究PNS对抑郁样行为小鼠生殖功能改善作用的可能机制，对各组小鼠血清T、FSH、GnRH、LH等激素水平进行检测，ELISA结果显示：与Control组相比，模型组小鼠血清T（P<0.01）、FSH（P<0.001）、GnRH（P<0.001）、LH（P<0.001）激素水平明显降低，PNS干预后，小鼠血清T（P<0.05）、FSH（P<0.001）、GnRH（P<0.01）、LH（P<0.001）激素水平升高（图5）。以上结果表明，PNS可能是通过调控小鼠血清激素水平来改善小鼠生殖功能以及生精功能。

3 讨论

情绪压力对男性精子生成以及精子质量具有显著影响，抑郁症患者容易出现精子活力下降甚至性功能障碍等躯体问题^［19］。本课题组前期研究发现，在通过CFA建立慢性炎性痛小鼠模型时，小鼠出现明显抑郁样行为^［15］。本文通过建立抑郁样行为小鼠模型探究抑郁情绪对精子生成功能的影响，并以PNS干预，发现小鼠抑郁样行为得到改善同时其生殖功能及生精功能也得到改善。

长期生活在不良环境导致小鼠压力过高引发抑郁情绪可能会影响小鼠生殖器官发育及生精功能^［20］。本实验发现CFA诱导小鼠出现抑郁样行为，随之小鼠出现生殖器官不同程度萎缩和精子数量减少，小鼠呈现明显生殖功能障碍；PNS干预后，小鼠的生殖器官萎缩明显改善，精子数量也接近正常水平，生殖功能得到明显改善。因此可推测，抑郁样行为小鼠的生殖器官萎缩导致精子生成减少，而PNS可明显改善睾丸及附睾的萎缩，从而改善小鼠生精功能。

睾丸生精细胞和支持细胞联合构成了生精上皮，睾丸生精细胞是精子的来源，精子的产生必须依赖睾丸生精细胞的发育成熟和功能正常^{［21，22］}。睾丸支持细胞则在生精过程中为生精细胞提供营养和支持，同时参与构成血睾屏障和吞噬异常细胞，为精子的产生提供内环境的稳态^［23］。许多原因都会引起睾丸细胞的损伤，包括炎症反应、激素失调、氧化应激等均会引发睾丸细胞的程序性死亡和非程序性死亡，包括细胞凋亡、坏死、程序性坏死、自噬、焦亡、铁死亡等，从而导致睾丸功能出现异常，精子产生发生障碍^{［24，25］}。为阐明抑郁样行为小鼠出现生精功能障碍原因以及PNS改善小鼠生精功能的机制，进一步探查各组小鼠睾丸生精上皮细胞形态、数量变化情况。

结果表明，抑郁样行为小鼠睾丸生精上皮细胞数量明显减少、分布松散、细胞形态异常等，PNS干预组小鼠睾丸生精上皮细胞数量增多、细胞排列较为紧密、细胞形态恢复正常。由此发现，抑郁样行为小鼠睾丸生精上皮细胞受损从而导致小鼠精子生成减少，而PNS可能通过此途径改善小鼠精子生成。精子涂片染色发现，模型组小鼠精子头、颈、尾畸形数量显著增多，而PNS干预后，小鼠精子头、颈、尾畸形数量明显减少，这表明PNS干预不仅促进小鼠精子生成，同时还降低了精子畸形发生的情况。PNS干预可明显改善小鼠生精功能，提高小鼠精子数量及质量。

HPG轴由下丘脑、垂体、性腺等组成。雄性小鼠下丘脑通过释放GnRH，刺激垂体前叶释放FSH和LH^［26］。FSH作用于睾丸以促进精子产生（精子发生），而LH刺激睾丸中的间质细胞细胞产生睾丸激素（T），T则在促进精子成熟、维持精子正常活力等方面具有重要作用^［27］。在前期研究发现，PNS在神经中枢系统中具有神经保护作用，可促进神经发生改善小鼠抑郁情绪，因此本课题组猜测PNS可作用于HPG轴调控激素水平从而改善抑郁样行为小鼠的生精功能^［28］。

为了探明PNS促进抑郁样行为小鼠精子生成及改善精子质量的原因，通过ELISA检测小鼠血清中生殖功能相关激素水平，主要包括血清睾酮、促性腺激素释放激素、黄体生成素、卵泡刺激素等。结果发现，模型组小鼠相关激素水平显著降低，而PNS干预后，小鼠激素水平回调正常水平。因此可推测，抑郁样行为可能导致相关脑区激素调控失衡，因此导致促性腺激素释放激素生成与释放减少，进而导致血清睾酮、黄体生成素、卵泡刺激素等生成减少，相关激素水平下降导致小鼠出现生殖器官萎缩、精子生成减少等。

下丘脑中GnRH神经元生成GnRH减少可导致精子生成减少、精子活力下降及精子畸形率增高等多种负面影响^［29］。抑郁、压力等负面情绪可导致脑区相关功能受到影响，这也可能是抑郁样行为小鼠出现生精功能障碍的重要原因。本实验结果提示了抑郁情绪与精子数量、质量之间的可能关系，表明抑郁可能是近年来男性精子数量、质量大幅降低的原因之一；同时，实验证实PNS可改善小鼠抑郁样行为同时对小鼠生精功能障碍具有明显改善作用，这将为探究男性生精功能障碍机制以及临床治疗的药物研发提供新思路。

本研究发现，PNS可明显改善抑郁样行为小鼠生精功能，其机制可能与促进小鼠相关激素包括促性腺激素释放激素、黄体生成素、卵泡刺激素、血清睾酮等分泌相关，由此改善小鼠生殖器官萎缩、生精上皮细胞受损、进而导致精子生成增多且畸形率降低，从而改善小鼠生殖功能障碍。但男性生殖功能障碍影响因素众多机制复杂，抑郁导致生精功能障碍的具体路径和时空模式，特别是下丘脑等脑区具体的神经核团、相关神经活性物质和纤维投射局部环路以及PNS在其中的作用靶点等还需要进一步研究，以便于深入明晰男性生殖障碍的发病机制和药物治疗具体靶点。

作者贡献度说明：

万力：选题与实验设计、实验操作、论文撰写；杨智伟：实验技术指导与论文修改；马瑞、郑瑶、覃欧翔宇、高静：动物饲养、实验辅助；何洁、刘国文：指导老师，实验方案审定，课题指导，论文审阅与修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

海南省自然科学基金资助项目(824MS065)

长寿与老年相关疾病教育部重点实验室资助项目(KLLAD202305)