姜黄素、槲皮素、百里香醌对种植体周围炎中主要致病菌的抗菌效果评价及其作用机制的初步探究

Evaluation of the antibacterial effects of curcumin, quercetin, and thymoquinone against major pathogens in peri‑implantitis and preliminary investigation of their mechanisms of action

摘要

目的 评估姜黄素（curcumin，CU）、槲皮素（quercetin，QU）及百里香醌（thymoquinone，TQ）单独和联合使用对种植体周围炎主要致病菌［牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）和伴放线菌团聚杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans，A. actinomycetemcomitans）］生物表型的抑制效果及相关抑制机制。 方法 通过微量稀释法测定CU、QU、TQ单独和联合使用时的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度，联合药敏实验测定部分抑菌浓度指数并绘制两种细菌生长曲线；使用酸碱度测定、玻壁法验证药物对细菌的抑制产酸水平、抗黏附能力；以微量稀释法测定药物对细菌的最低生物膜形成抑制浓度、最低清除已形成生物膜浓度；结合扫描电子显微镜观察以上最佳药物对细菌的破坏作用，通过液相色谱‑质谱联用测定最佳药物对细菌的代谢物差异，初步探索其对细菌的作用机制。 结果 CU、QU、TQ单独和联合使用均对P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans表现出明显的抑制作用，其中仅CU+TQ对P. gingivalis的抑制呈协同作用，其余对两种菌的抑制呈相加作用；联合用药缩短了P. gingivalis和A. actinomycetemcomitans进入平台期时间，抑制效果存在浓度依赖性；联合用药抑制P. gingivalis和A. actinomycetemcomitans产酸作用（P<0.05），降低了其黏附率（P<0.05）；与单独用药相比，CU、QU、TQ联合用药对抑制P. gingivalis和A. actino‑ mycetemcomitans的单菌种生物膜的形成及生物膜清除的浓度低；联合药物中CU+TQ对致病菌抑制作用最佳，且CU+TQ破坏了细菌细胞膜完整性；CU+TQ对P. gingivalis处理后的差异代谢物有184个（P<0.05），CU+TQ对A. actinomycetemcomitans处理后的代谢物有150个（P<0.05），主要为脂质及类脂分子、有机酸及其衍生物等，代谢通路主要为次生代谢物的生物合成、氨基酸代谢及脂质代谢等。 结论 CU、QU、TQ对种植体周围炎主要致病菌P. gingivalis和A. actinomycetemcomitans的生长活性、产酸能力、黏附能力、生物膜形成等生物表型有明显的抑制作用，且CU+TQ作用最强，并且通过破坏P. gingivalis和A. actinomy‑ cetemcomitans的细胞膜、代谢过程及能量的改变对其起到抑制作用。

Abstract

Objective To evaluate the inhibitory effects and related inhibitory mechanisms of curcumin （CU）， quercetin （QU）， and thymoquinone （TQ） used alone and in combination on the biological phenotypes of the main pathogens， Porphyromonas gingivalis （P. gingivalis） and Aggregatibacter actinomycetemcomitans （A. actinomycetemcomitans）， of peri‑implantitis. Methods The minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of CU， QU， and TQ used alone and in combination were determined by the micro‑dilution method. The fractional inhibitory concentration index was determined by the combined drug susceptibility test， and the growth curves of the two bacteria were plotted. The inhibitory effect of the drugs on the acid production level and anti‑adhesion ability of the bacteria were verified by pH measurement and the glass wall method. The minimum biofilm formation inhibitory concentration and the minimum concentration for eradicating the formed biofilm of the drugs on the bacteria were determined by the micro‑dilution method. The damage of the above optimal drugs to the bacteria was observed by scanning electron microscopy. The differences in metabolites of the bacteria treated with the optimal drugs were determined by liquid chromatography‑tandem mass spectrometry to preliminarily explore their mechanisms of action on the bacteria. Results CU， QU， and TQ used alone and in combination all showed significant inhibitory effects on P. gingivalis and A. actinomycetemcomitans. Among them， only CU+TQ showed a synergistic inhibitory effect on P. gingivalis， and the inhibitory effects of the others on the two bacteria were additive. The combined use of drugs shortened the time for P. gingivalis and A. actinomycetemcomitans to enter the stationary phase， and the inhibitory effect was concentration‑dependent. The combined use of drugs inhibited the acid production of P. gingivalis and A. actinomycetemcomitans （P<0.05） and reduced their adhesion rates （P<0.05）. Compared to using the drugs alone， the combined use of CU， QU， and TQ had a lower concentration for inhibiting the formation and eradication of the single‑species biofilms of P. gingivalis and A. actinomycetemcomitans. Among the combined drugs， CU+TQ had the best inhibitory effect on the pathogenic bacteria， and CU+TQ damaged the integrity of the bacterial cell membrane. There were 184 differential metabolites （P<0.05） in P. gingivalis after treatment with CU+TQ， and 150 metabolites （P<0.05） in A. actinomycetemcomitans after treatment with CU+TQ， which were mainly lipids and lipid‑like molecules， organic acids， and their derivatives. The metabolic pathways were mainly the biosynthesis of secondary metabolites， amino acid metabolism， and lipid metabolism. Conclusion CU， QU， and TQ all have significant inhibitory effects on the biological phenotypes such as the growth activity， acid production ability， adhesion ability， and biofilm formation of the main pathogens P. gingivalis and A. actinomycetemcomitans of peri‑implantitis， and CU+TQ has the strongest effect. Moreover， the inhibitory effect is achieve by damaging P. gingivalis and A. actinomycetemcomitans cell membranes， and altering their metabolic processes and energy.

Graphical abstract

关键词

姜黄素 / 槲皮素 / 百里香醌 / 种植体周围炎 / 生物表型 / 代谢

Key words

Curcumin / Quercetin / Thymoquinone / Peri‑implantitis / Biophenotype / Metabolism

种植体周围炎是种植失败的常见原因之一，患病率高达19.53%^［1］。在种植体植入口内后，致病菌易黏附于其表面并形成生物膜，这是导致种植体植入术后感染的主要原因^［2］，其中牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）在种植体周围炎患者中的检出率较高^［3］，伴放线菌团聚杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans，A. actinomycetemcomitans）在种植体周围炎中发挥重要作用^［4］。因种植体表面结构粗糙，使得种植体周围袋深处的细菌生物膜难以清除，常需联合抗生素进行治疗。有报告指出种植体周围炎受试者中有71.7%在体外表现出细菌病原体对一种或多种抗生素耐药^［5］。常用于辅助治疗的抗生素多有不良的副作用和局限性^［6］，如耐药性、肝肾毒性、前庭毒性、胃肠道反应等^［7］，因此新药的发现或配伍是药物治疗种植体周围炎的新型及迫切选择，相对安全的天然产物或传统中草药植物是常用抗菌剂有力的替代品。

姜黄素（curcumin，CU）、槲皮素（quercetin，QU）、百里香醌（thymoquinone，TQ）被报道具有抗口腔生物膜及抗菌活性。CU是一种源自咖喱香料的亲脂性多酚^［8］，具有抗炎、抗菌、抗氧化等性能，用于牙龈下冲洗时可改善牙龈健康^［9］，对P. gingivalis表现出抗生物膜和抗菌活性^［10］，联合蓝光利用光动力灭活A. actinomycetemcomitans^［9］。QU是一种膳食类黄酮，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗过敏等活性。QU可引起细菌膜的破坏，导致细菌表面和内部结构的破坏从而发挥抗菌活性^［11］。TQ是从黑种草种子分离的挥发性油中的主要生物活性成分^［12］，具有抗氧化、抗炎、抗癌以及抗菌特性^［13］，其中对P. gingivalis^［14］及A. actinomycetemcomitans^［15］具有强效的抗菌特性。在药物联用方面，TQ和四环素联用可以降低抗生素耐药现象^［16］，QU和CU在体外联合使用对耐甲西林金黄色葡萄球菌表现出协同抗菌作用^［17］，但是此三种药物的联合使用在种植体周围炎的主要致病菌的抗菌作用有待进一步研究。因此，本研究拟从体外抗菌实验对CU、QU及TQ三种药物单独或联合使用时对种植体周围炎优势菌的表型作用进行评价，比较出疗效最优的药物或药物组合，并研究其对种植体周围炎主要致病菌的抗菌机制，以期为治疗种植体周围炎的抗菌药物提供新的选择，并为进一步开发治疗种植体周围炎的复合药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

QU、CU、TQ购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；盐酸米诺环素购于瀚晖制药有限公司；厌氧产气袋购于日本三菱瓦斯化学株式会社；革兰氏染色液试剂盒、结晶紫等试剂购于北京索莱宝科技有限公司；P. gingivalis（bio‑53046，引种于ATCCBAA‑308）购于智立中特（武汉）生物科技有限公司；A. actinomycetemcomitans（BNCC337071，引种于ATCC700685）购于商城北纳创联生物科技有限公司；脑心浸出液液体培养基（brain heart infusion broth，BHI）、氯化血红素、维生素K₁、琼脂粉、脱纤维羊血、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购于青岛海博生物技术有限公司；乙腈、甲醇等试剂购于赛默飞世尔科技公司。

1.2 培养基配制

称量3.85 g BHI，加入100 mL纯水，加热溶解后121 ℃高压灭菌20 min。液体培养基：冷却至55 ℃，加入0.1 mL氯化血红素、0.1 mL维生素K₁及2% FBS（体积分数）；固体培养基：另入加0.9 g琼脂，灭菌后冷却至55 ℃，加入0.1 mL氯化血红素、0.1 mL维生素K₁及5 mL无菌羊血，混匀后倾注平板备用。

1.3 CU、QU、TQ药液、菌液的制备

CU、QU、TQ溶于含1% DMSO的BHI液体培养基，经0.22 μm过滤，4 ℃保存；20 mg盐酸米诺环素溶于10 mL BHI培养基，制成2%溶液避光冷藏。挑取单菌落于BHI液体培养基，37 ℃厌氧培养 48 h，酶标仪调菌浓度至10⁷ CFU/mL备用。

1.4 最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）、最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）的测定

采用二倍稀释法制备药液梯度（CU：30 mmol/L→0.234 mmol/L；QU：160 mmol/L→5 mmol/L；TQ：67 mmol/L→2.094 mmol/L），与等体积菌液（10⁵ CFU/mL）接种于96孔板，37 ℃厌氧培养48 h，以ΔA≤0.05确定MIC。取20 μL高于MIC浓度的培养物涂布血琼脂平板，培养48 h后菌落数<5个的最低浓度为MBC，重复3次。

1.5 联合药敏试验

基于单药MIC，采用棋盘法进行两两组合（CU：0.469~30 mmol/L，QU：2.5~160 mmol/L，TQ：4.188~67 mmol/L），每孔加50 μL药物稀释液与100 μL菌液（10⁵ CFU/mL），设阴/阳性对照。厌氧培养48 h后测OD值，记录各自的MIC_甲药联合和MIC_乙药联合，通过计算FIC指数（fractional inhibitory concentration index，FICI）评价药物的效应模式。FICI的计算与判读标准：FICI=MIC_甲药联合/MIC_甲药单用+MIC_乙药联合/MIC_乙药单用。当FICI≤0.5，两者为协同作用；当0.5<FICI≤1，两者为相加作用；当1<FICI<4，两者为无关作用；当FICI≥4，两者为拮抗作用^［18］。实验重复3次。

1.6 药物对主要致病菌生长曲线测定

在96孔板中加入2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC单药及联合用药药液100 μL，接种10⁷ CFU/mL菌液100 μL，于1、2、3、4、6、8、10、12、16、20、24、32、40、48 h测595 nm吸光度，每组2复孔，重复3次。

1.7 药物对主要致病菌产酸能力的检测

将菌液与药液等以1∶1（V/V）体积混合，厌氧培养48 h，离心后收集上清，测定各个组培养前后pH值，计算ΔpH＝初始pH-终末pH，重复3次。

1.8 药物对主要致病菌黏附能力的影响

菌液与药液等以1∶1（V/V）体积接种于试管内，倾斜30°固定，标记为管1，厌氧培养48 h后将管1培养物倒入试管中，标记为管2。吸取3 mL PBS加入管1中，缓慢转移至试管中，标记为管3。将管2、管3内的培养物离心取上清液。最后吸取3 mL PBS分别加入管1、管2、管3中，酶标仪测试管1、管2、管3的OD值，分别记为A₁，A₂，A₃。计算黏附抑制率=1-A₁/（A₁+A₂+A₃）。实验重复3次，取均值。

1.9 最低生物膜形成抑制浓度（minimal biofilm inhibitory concentration，MBIC）、最低清除已形成生物膜浓度（minimum biofilm reduction concentration，MBRC）的测定

200 μL药液与20 μL菌液（10⁷ CFU/mL）接种于96孔板，厌氧培养48 h，PBS洗涤，甲醇固定15 min，弃固定液后室温干燥，结晶紫染色5 min，充分漂洗后室温干燥，乙醇溶解30 min，测定吸光度值。抑制率=（1-A595_实验组/A595_{阴性对照组}），计算MBIC^{［19，20］}。20 μL菌液（10⁷ CFU/mL）与200 μL BHI液体培养基接种于96孔板，厌氧培养48 h形成生物膜，PBS洗涤后加入200 μL药液继续培养48 h。洗涤、固定、染色、检测方法同上。抑制率同上计算MBRC^［20］。实验重复3次。

1.10 药物对主要致病细菌细胞膜的破坏作用

基于以上实验结果，选用浓度为2MIC的CU+TQ对10⁷ CFU/mL菌悬液等体积处理，厌氧培养48 h，离心，2.5%戊二醛固定24 h，后除固定液PBS漂洗3次，1%四氧化锇二次固定2 h，再次漂洗。梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%）脱水15 min，无水乙醇强化脱水20 min，放置于100%乙醇里。临界点干燥，喷铂后在扫描电子显微镜下观察细胞形态。

1.11 液相色谱‑质谱联用分析

2MIC的CU+TQ对10⁷ CFU/mL菌悬液等体积处理，厌氧培养48 h，离心取上清，液氮速冻后-80°C保持。24 h后迅速解冻取100 μL上清加入300 μL甲醇，震荡30 min，4 ℃离心取200 μL上清上机。实验组PG（CU+TQ+P. gingivalis）、AA（CU+TQ+A. actinomycetemcomitans）与对照组UT‑1（P. gingivalis）、UT‑2（A. actinomycetemcomitans）各3个重复，质谱下机的原始数据导入到Progenesis QI经峰对齐、基线校正、去噪等预处理后，以P<0.05，FC≥1.5筛选显著差异代谢物，KEGG富集分析并可视化。

1.12 统计学处理

使用Graphpad Prism 9.5.0软件进行数据处理及统计学分析。对各组数据行正态分布检验，若符合正态分布，再对各组数据行方差齐性检验，若方差齐选用ANOVA检验；若方差不齐，则采用Brown‑ Forsythe检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MIC及MBC的测定结果

实验结果表明，CU、QU、TQ对P. gingivalis和A. actinomycetemcomitans均存在一定的抑制作用。两种药物联合使用时的MIC及MBC均小于单药使用，见表1、2。

2.2 CU、QU、TQ联合药敏测试结果

CU+QU、CU+TQ对P. gingivalis的抑制具有协同作用，QU+TQ对P. gingivalis的抑制具有相加作用；CU+QU、CU+TQ、QU+TQ对A. actinomycetemcomitans的抑制具有相加作用，见图1A~F。

2.3 CU、QU、TQ对两种主要致病细菌生长曲线的影响

其生长曲线显示，P. gingivalis于第4小时进入平台期，浓度为MIC的CU、QU及TQ的生长曲线进入平台期的时间延长至第8、6、6小时，且浓度低于MIC曲线水平。其生长抑制曲线显示，A. actinomycetemcomitans于第10小时进入平台期，浓度为MIC的CU、QU及TQ的进入平台期的时间缩短至第3、6、3小时。大于MIC浓度及药物联合时的细菌均无明显生长曲线形态，且细菌在生长对数期的抑制作用最为明显。三种药物对P. gingivalis和A. actinomycetemcomitans的抑制作用随浓度的增加而增大，呈现浓度依赖性，且细菌进入衰亡期的时间明显提前，衰亡速度明显加快，见图2A~F。

2.4 CU、QU、TQ对两种主要致病细菌产酸的影响

CU、QU、TQ及联合用药时可抑制P. gingivalis及A. actinomycetemcomitans的产酸能力（P<0.05）；联合使用药物对抑制P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans的产酸的能力优于单独使用药物（P<0.05），联合用药组与除CU组外的单独用药组差异具有统计学意义（P<0.05），见图3A、B。

2.5 CU、QU、TQ对两种致病细菌黏附能力的影响

CU、QU、TQ及其联合使用可抑制P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans的黏附能力（P<0.05）；联合使用药物对P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans的黏附抑制作用优于单独使用药物（P<0.05）；与QU+TQ相比，CU+TQ对P. gingivalis的黏附抑制更好（P<0.05）；相较于QU+CU，TQ+CU/QU对A. actinomycetemcomitans的黏附抑制更好（P<0.05），见图4A、B。

2.6 CU、QU、TQ对两种主要致病细菌单菌种生物膜MBIC和MBRC的测定

CU、QU、TQ对P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans的抑制单菌种生物膜的形成、已形成生物膜清除均表现出一定能力，见表3、4。

2.7 药物对主要致病细菌细胞膜的破坏作用

通过以上实验，选取上述结果中对P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans抑制最强的CU+TQ（3.75 mmol/L+16.8 mmol/L）作用于细胞；通过扫描电子显微镜观察发现其对P. gingivalis和A. actinomycetemcomitans的细胞膜具有破坏作用，见图5A~D。

2.8 非靶向代谢物的分析与筛选

实验组和对照组的差异代谢物的分布区域明显不一致，为后续进行差异代谢物的筛选和分析提供基础，见图6A、B。

2.9 差异代谢物分析

以OPLS‑DA结果模型得到的VIP值（VIP>1.0）和统计检验中预设的P值（P<0.05）值进行差异代谢物筛选，以两组中FC值≥1.5和≤2/3为上调和下调代谢物，并对上调和下调的差异代谢物取交集（选取前7进行展示），见图7、8和表5~7。

2.10 KEGG富集分析

P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans的差异代谢物主要存在于代谢物和生物系统中，其中包含了其他次生代谢物的生物合成，脂质代谢及氨基酸代谢，见图9A、B；P. gingivalis代谢通路存在于次生代谢物的生物合成、吲哚生物碱生物合成、氨基酸代谢等，A. actinomycetemcomitans代谢通路存在于氨基酸的生物合成、蛋白质的消化和吸收等（选取前5进行展示），见表8、9。

3 讨论

近年来，随着口腔种植修复技术的广泛应用，种植体植入数量的持续增长，其并发症防控需求也不断增加，促使学术界对种植体周围组织炎症的治疗及反应的分子机制展开深入探讨^［21］。因常规的机械清创并不能完全消除细菌导致的的负荷^［22］，使用抗生素虽可增加细菌清除率，但过度使用是耐药菌^［23］出现的主要原因。因此选择天然化合物或传统中草药作为抗菌药物对抗致病菌。

有研究发现，CU与绿茶多酚的联合使用对P. gingivalis起协同抑制作用^［24］。本研究通过CU、QU、TQ单独及联合使用测定P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans的MIC和MBC，发现联合使用后的MIC、MBC值均降低，且CU+TQ对P. gingivalis的抑制起到协同作用，表明药物联合使用对种植体周围炎的致病菌加强了抑制。本研究绘制的P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans生长曲线表现出药物对其抑制的浓度依赖，与Augustina等^［25］对古拉米鱼鳞提取物与CU联合抑制P. gingivalis呈现一致效果。细菌通过代谢碳水化合物产生有机酸，降低局部微环境pH值，直接破坏种植体周围软组织从而促进炎症反应和牙周袋形成。Brown等^［26］研究发现A. actinomycetemcomitans能缓慢代谢碳源以促进其生长，本研究中药物的联合使用明显抑制了P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans的产酸作用。P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans也通过多黏附素协同作用和生物膜动态调控实现其在种植体周围黏膜组织的高效定植。Kumbar等^［10］研究出CU可以减少P. gingivalis的黏附，本研究与其结果一致，并发现CU+TQ对P. gingivalis的黏附抑制作用最强，对A. actinomycetemcomitans的抑制也是如此。游离菌的研究并不能完全说明药物对种植体周围炎细菌生物膜内的抑制效果，Liu等^［27］通过测定MBIC发现Decapeptide KSL抑制变异链球菌生物膜的形成，同样本研究测定了MBIC与MBRC，发现药物对P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans的生物膜均有清除作用，且药物联合时的浓度较其单独使用时低。

本研究通过以上生物表型实验，比较出抑制P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans的最强药物联合，即CU+TQ，并发现其破坏了P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans的细胞膜。这与Tyagi等^［28］对CU破坏革兰氏阴性菌细胞膜的研究结果一致，与Fan等^［29］对TQ可以破坏福氏志贺氏菌细胞膜的研究结果相似。有研究发现，CU以氨基酸为途径抑制P. gingivalis的生长^［30］，本研究发现了类似结果，CU+TQ对P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans的差异代谢物主要存在于代谢物和生物系统中，包含了其他次生代谢物的生物合成，脂质代谢及氨基酸代谢。其中以色氨酸和瓜氨酸为主要成分。L‑瓜氨酸于尿素循环/NO中合成，其上调反映CU+TQ的处理使得两种细菌代谢过程中的氮代谢发生紊乱，从而导致中间产物的堆积；色氨酸参与犬尿氨酸通路，说明CU+TQ通过诱导氧化应激，两种细菌启动抗氧化响应从而起到杀菌的作用，但吲哚乳酸的上调可能会激活生物膜的形成或者群体感应^［31］，从而增强耐药性。另外其中O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸是甲硫氨酸生物合成的关键中间体^［32］，甲硫氨酸是细菌生长的必需氨基酸，O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸的下调直接会影响细菌的生长。十八烷二酸通过β‑氧化生成乙酰‑CoA，其下调显示抑制脂肪酸氧化，阻断能量供应^［33］。脂质及类脂分子如磷脂酰胆碱的上升，还可能是CU+TQ对细菌细胞膜的损伤的表现。本研究差异代谢物分析发现了12‑羟基十七碳三烯酸（12‑HHTrE）的下降，有研究显示脆弱拟杆菌及其代谢物12‑HHTrE可激活小胶质细胞并可诱导小鼠阿尔兹海默症的发生^［34］，在种植体周围炎的发生、发展过程中是否存在相同的作用机制还有待进一步探索。

P. gingivalis代谢通路存在于次生代谢物的生物合成、吲哚生物碱生物合成、氨基酸代谢等，其中以色氨酸的生物合成为主，L‑色氨酸生物合成需要赤藓糖‑4‑磷酸，而赤藓糖‑4‑磷酸通过磷酸戊糖途径和糖酵解途径形成，说明CU+TQ对P. gingivalis的代谢影响可能通过了这两种途径，这与Murai等^［30］研究结果类似；A. actinomycetemcomitans代谢通路存在于氨基酸的生物合成、蛋白质的消化和吸收等，这与P. gingivalis的研究结果相似，两者具有相同的生物合成途径，表明了CU+TQ可以通过相同的代谢途径对种植体周围炎的主要致病菌P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans起到抑制的作用。然而筛选出的差异代谢物富集所在通路的P值较高，表示差异无统计学意义，有可能是因为本实验使用的富集通路的数据库不足，大部分的差异代谢物在KEGG数据库中没有ID，导致大部分数据的缺失，还有可能因为重复样本量较少，导致代谢物的数据不足，从而影响对其作用通路的分析，后续可以通过加大样本含量、数据库的选择对其代谢产物的通路开展进一步探究。本研究还可以通过测定16s rRNA基因表达从而探究其基因分子水平的抑制通路及特点，并且通过种植体周围炎动物模型进行相关因子的验证。

综上所述，CU、QU、TQ对种植体周围炎主要致病菌P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans的生物表型均有抑制及破坏作用且CU+TQ的作用最强，其通过参与细菌内部分氨基酸的代谢过程和能量的生成来表现抑制作用。本研究未来还需通过体内实验证明其毒性和生物安全性等，通过蛋白及基因组学深层次探究CU联合TQ在种植体周围炎中的作用机制，从而达到精准治疗种植体周围炎的效果，减少种植体周围炎的发生率，提高牙种植术的成功率，并为患者提供更好的口腔健康护理。

作者贡献度说明：

钱艺：论文选题、实验设计、实验实施、论文撰写；王鼎、周娜：实验实施；唐牧、陈铎、刘钰昕：数据整理分析、绘图；周政、缑小蕊：实验设计指导、论文审阅。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

石河子大学第一附属医院青年基金项目(QN202213)

兵团指导性科技计划项目(2023ZD062)

“天山英才”医药卫生高层次人才培养计划资助项目(CZ001224)