加味薏苡附子败酱散对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜微循环障碍改善作用的研究

Effect of Modified Yiyi Fuzi Baijiang Powder on intestinal mucosal microcirculatory disturbance in rats with ulcerative colitis

摘要

目的 探讨加味薏苡附子败酱散对葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）模型大鼠肠黏膜微循环障碍的改善作用。 方法 60只SPF级大鼠随机分为空白组、模型组、美沙拉秦组及加味薏苡附子败酱散低、中、高剂量组，除空白组外各组大鼠予3% DSS造模，成功建立UC模型后，美沙拉秦组及各剂量中药组分别予相应药物灌胃，空白组、模型组予等量生理盐水灌胃。H&E染色观察各组结肠组织病理变化，血液流变仪检测血液流变学参数，ELISA检测大鼠血清P⁃选择素、TXB2和6⁃Keto⁃PGF1α含量，透射电镜观察肠黏膜微血管超微结构，MASSON染色观察微血管胶原纤维阳性面积比率，免疫组化法检测结肠组织VEGF表达、肠黏膜MVD。 结果 与空白组相比，模型组结肠病理损伤明显，血液流变学参数、P⁃选择素、TXB2、VEGF的水平及MVD明显升高（P<0.05），6⁃Keto⁃PGF1α水平明显降低（P<0.01），微血管损伤明显，微血管胶原纤维阳性面积比率明显升高（P<0.01）。与模型组相比，各给药组结肠病理损伤改善，血液流变学参数、P⁃选择素、TXB2、VEGF的水平及MVD降低（P<0.05），6⁃Keto⁃PGF1α水平明显升高（P<0.01），微血管损伤减轻，微血管胶原纤维阳性面积比率明显降低（P<0.01），中药组中以高剂量组疗效最为明显。 结论 加味薏苡附子败酱散可有效改善UC大鼠肠黏膜微循环障碍。

Abstract

Objective Explore the improvement effect of the Modified Yiyi Fuzi Baijiang Powder on intestinal mucosal microcirculatory disturbance in rats with ulcerative colitis （UC） induced by dextran sulfate sodium （DSS）. Methods A total of 60 SPF⁃grade rats were randomly divided into a blank group， model group， mesalazine group， and low， medium， and high⁃dose Modified Yiyi Fuzi Baijiang Powder groups. Except for the blank group， rats in all other groups were treated with 3% DSS to establish the UC model. Following successful model establishment， rats in the mesalazine group and each dose of the traditional Chinese medicine group received corresponding treatments via gavage， while rats in both the blank and model groups were given an equivalent amount of physiological saline as a control. H&E staining was used to observe the pathological changes of colon tissue in each group. A blood rheology instrument was used to measure hematological parameters. ELISA was employed to detect serum levels of P⁃selectin， TXB2， and 6⁃Keto⁃PGF1α in the rats. Transmission electron microscopy was utilized to examine the ultrastructure of intestinal microvessels， while Masson's trichrome staining assessed the ratio of microvascular collagen fiber⁃positive area. Immunohistochemical methods were used to detect the levels of VEGF in colonic tissue and to measure MVD in the intestinal mucosa. Result Compared to the blank group， the model group showed significant pathological damage to the colon， with significantly increased levels of blood rheological parameters， P⁃selectin， TXB2， VEGF， and MVD （P<0.05）. The expression level of 6⁃Keto⁃PGF1α was significantly decreased （P<0.01）， microvascular damage was significant， and the ratio of microvascular collagen fiber⁃positive area was significantly increased （P<0.01）. Compared to the model group， each treatment group showed improvement in colonic pathological damage， with decreased levels of blood rheological parameters， P⁃selectin， TXB2， VEGF， and MVD（P<0.05）. The expression level of 6⁃Keto⁃PGF1α was increased （P<0.01）， microvascular damage was alleviated， and the ratio of microvascular collagen fiber⁃positive area was significantly reduced （P<0.01）. Among the traditional Chinese medicine groups， the high⁃dose group demonstrated the most significant efficacy. Conclusion Modified Yiyi Fuzi Baijiang Powder can effectively improve intestinal mucosal microcirculatory disturbance in rats with UC.

Graphical abstract

关键词

溃疡性结肠炎 / 加味薏苡附子败酱散 / 肠黏膜 / 微循环障碍

Key words

Ulcerative colitis / Modified Yiyi Fuzi Baijiang Powder / Intestinal mucosa / Microcirculatory disturbance

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性非特异性的肠道疾病，特点是结直肠黏膜表现出连续、弥漫性的炎症改变^［1］，其病程迁延难愈，且易反复发作，给患者的身心健康带来沉重负担。UC的发病机制尚不明确，目前治疗以控制炎症、促进肠黏膜愈合、减少复发为主，临床上难以实现彻底治愈。肠黏膜微循环障碍被认为是UC缠绵难愈的重要因素之一，主要表现为血液黏度增高、微血栓形成、血流减慢等^［2］。肠黏膜微循环障碍不仅加剧组织的缺氧损伤，导致组织坏死和溃疡形成，更作为一种反馈机制，促进炎症介质的释放和炎症反应的级联放大，从而加重UC^［3，4］。因此，改善肠黏膜微循环障碍被认为是一种潜在治疗UC的方法。

笔者所在课题组负责人认为UC患者肠黏膜充血、水肿、糜烂等病理特征，与中医理论中的“肠痈”具有相似性，遂借鉴《金匮要略》中“薏苡附子败酱散”治疗UC。前期研究表明：薏苡附子败酱散可以通过调节肠道菌群结构，干预肠黏膜氧化应激，改善紧密连接；调节炎性因子水平，改善肠黏膜屏障的损伤，促进肠黏膜修复等治疗UC^［5⁃9］。随着对UC病机研究的不断深入，发现UC湿热之邪久蕴肠腑，影响气血运行，最终导致肠络瘀阻，致使UC难以治愈。课题组负责人认为该病机符合吴门医派络病理论的学术思想，因此在前期运用薏苡附子败酱散治疗UC的研究基础上，加入木香、当归、白术3味药物，组成加味薏苡附子败酱散，以兼顾UC肠络瘀阻的病机。微循环障碍是络脉瘀阻的重要表现之一，改善微循环有助于疏通络脉^［10］。近年文献表明，加味薏苡附子败酱散中的多味药物在改善机体微循环方面具有积极作用^{［11⁃14］}。然而，目前尚不清楚加味薏苡附子败酱散对于UC肠黏膜微循环障碍的改善作用。因此，本研究旨在通过比较药物干预后的血液流变学、血清P⁃选择素、血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）和6⁃酮前列腺素F1α（6⁃keto⁃prostaglandin F1α，6⁃Keto⁃PGF1α）表达变化，以及评估肠黏膜微血管超微结构、微血管内胶原纤维阳性面积比率、结肠组织血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肠黏膜微血管密度（microvessel density，MVD）等参数，明确加味薏苡附子败酱散对UC大鼠肠黏膜微循环障碍的改善作用，以期为临床治疗UC提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物

60只SPF级雄性SD大鼠，体质量（200±20） g，购自上海必凯科翼生物科技公司，许可证号：SCXK（沪）2023⁃0009。给予大鼠充足饲料及饮水，饲养环境清洁，温度23 ℃左右，湿度为60%~80%。实验操作严格依照苏州市中医医院实验动物伦理委员会的相关规范执行，动物实验伦理审查编号：2023伦研批062。

1.2 药物

加味薏苡附子败酱散（薏苡仁30 g，附子6 g，败酱草15 g，煨木香6 g，当归10 g，炒白术10 g）中所有中药饮片购自苏州市春晖堂药业有限公司，由苏州市中医医院药剂科提供。生产批号如下：薏苡仁（批号：230323）、附子（批号：231202）、败酱草（批号：230927）、煨木香（批号：230820）、当归（批号：230919）、炒白术（批号：231205）；美沙拉秦缓释颗粒购自上海爱的发制药有限公司（规格：0.5 g/袋，批号：H20143164）。葡聚糖硫酸钠（DSS，美国MP公司，批号：Q4299）。加味薏苡附子败酱散的配制参考“人体/动物体表面积计算法”进行换算^［15］。加味薏苡附子败酱散低、中、高剂量组分别配制0.396、0.792、1.584 g‧mL^⁃1‧d^⁃1浓度的药液，存于4 ℃冰箱备用。按照同样方法计算美沙拉秦药液浓度为0.041 g‧mL^⁃1‧d^⁃1，现配现用。DSS定溶于100 mL蒸馏水中配制成3% DSS溶液，现配现用。

1.3 试剂与仪器

电镜固定液（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：G1102）；812包埋剂（SPI公司，批号：90529⁃77⁃4）；Masson 染液套装（Servicebio公司，批号：G1006）；CD31抗体（Servicebio公司，批号：GB11063⁃2）；VEGF抗体（Servicebio公司，批号：GB15165）；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（Servicebio公司，批号：GB23303）；大鼠6⁃Keto⁃PGF1α ELISA试剂盒（上海邦奕生物，批号：202406）；大鼠血栓素TXB2 ELISA试剂盒（上海邦奕生物，批号：202405）；大鼠P⁃选择素ELISA试剂盒（上海邦奕生物，批号：202406）；4%多聚甲醛固定液（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：G1101）；便隐血试剂（珠海贝索生物技术有限公司，批号：B240201）。

透射电子显微镜（HITACHI公司，型号：HT7800）；病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016）；超薄切片机（Leica公司，型号：Leica UC7）；光学显微镜（日本尼康，型号：E100）；包埋机（武汉俊杰电子有限公司，型号：JB⁃P5）；全自动血液流变仪（北京利普生，型号：LBY⁃N7500）

1.4 造模、分组及给药

大鼠适应性喂养后随机分为空白组、模型组、美沙拉秦组、加味薏苡附子败酱散低剂量组（简称“中药低剂量组”）、加味薏苡附子败酱散中剂量组（简称“中药中剂量组”）、加味薏苡附子败酱散高剂量组（简称“中药高剂量组”），每组10只。除空白组外，其余各组大鼠连续7 d自由饮用3% DSS溶液制备UC大鼠模型^［16］。第8天开始给药干预，美沙拉秦组每日予美沙拉秦溶液2 mL灌胃1次，各中药组每日予相对应的中药2 mL灌胃1次，空白组及模型组每日予2 mL生理盐水灌胃1次，连续7 d。末次给药后禁食不禁水24 h，将各组大鼠麻醉后腹主动脉取血并处死。其中一部分血清样本用于血液流变学检测，剩余血清样本静置后离心取上清液进行ELISA检测；沿大鼠腹部正中线剪开，取出肠管，处理后进行病理学组织学观察和黏膜微血管超微结构观察等。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 一般情况评价、疾病活动指数评分及H&E染色观察结肠组织病理学变化

（1）一般情况评价：监测大鼠每日精神状态、饮食、排便、体质量等情况，并依据大鼠疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分标准进行评分^［17］（表1）。（2）H&E染色后观察结肠组织病理学变化：结肠组织置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋、切片、苏木素⁃伊红染色，镜下观察结肠组织。

1.5.2 血液流变学检测

各组大鼠腹主动脉取血约5 mL置于肝素钠抗凝管，应用全自动血液流变仪测定全血黏度后将血液样本离心10 min后测定血浆黏度。

1.5.3 ELISA检测大鼠血清P⁃选择素、TXB2、6⁃Keto⁃PGF1α含量

各组大鼠腹主动脉取血，离心后取上清液，按照ELISA试剂盒操作流程对样本P⁃选择素、TXB2及6⁃Keto⁃PGF1α进行检测。

1.5.4 大鼠肠黏膜微血管超微结构观察

将约1 mm³大小新鲜结肠组织置于2.5%戊二醛中固定后漂洗；1%锇酸固定2 h；逐级脱水；丙酮：812包埋剂=1∶1渗透后纯812包埋剂包埋；包埋板放于60 ℃烤箱聚合48 h；使用超薄切片机进行60~80 nm超薄切片，150目方华膜铜网捞片；染色后于透射电镜下观察肠黏膜微血管超微结构，并采集图像。

1.5.5 Masson染色法评估大鼠肠黏膜微血管内胶原纤维阳性面积

各组大鼠结肠样本在4%多聚甲醛中进行固定处理，石蜡包埋、脱水。切片按顺序依次放入二甲苯Ⅰ处理20 min，二甲苯Ⅱ处理20 min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ分别处理5 min，75%乙醇中处理5 min，用自来水进行冲洗。随后，将切片浸泡在Masson A液中过夜，用自来水冲洗。将切片放入Masson B和Masson C液1∶1的混合染料溶液中浸染1 min，并再次用清水冲洗。用1%的盐酸酒精进行分化，再次水洗。切片置入Masson D液中浸泡6 min，用自来水漂洗后，放入Masson E液中染色1 min。稍微晾干后，放入Masson F液中，染色2 s到30 s。切片最终用1%冰醋酸进行漂洗、分化，依次通过两缸无水乙醇进行脱水处理。透明封片后，进行显微镜下的镜检观察和图像采集分析。染色结果：胶原纤维呈蓝色；肌纤维、纤维素和红细胞呈红色。

1.5.6 免疫组化法检测大鼠结肠组织VEGF蛋白表达、肠黏膜MVD

各组大鼠结肠组织于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋、脱水，加入3% H₂O₂阻断内源性氧化酶，在组化圈内滴加3% BSA进行血清封闭30 min，滴加VEGF一抗（1∶200）、CD31一抗（1∶600），孵育、洗涤后加入HRP标记的二抗（山羊抗兔IgG），DAB显色、苏木素复染，脱水封片后于显微镜下观察并拍照。MVD计算方式：CD31显出的阳性表达为棕黄色，先在低倍光镜下扫查切片，寻找3个血管高密度区，然后在200倍视野下计数CD31染色呈阳性的血管数，计数3个视野下微血管数目平均值作为肠黏膜MVD值。

1.6 统计学处理

采用SPSS 26.0软件进行数据分析，所有计量资料采用\overline{x}\pm s表示，对于符合正态分布的数据，采用单因素方差分析，组间两两比较用t检验，给药前后比较采用配对t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况及DAI评分

实验期间，空白组大鼠保持正常生理状态。造模期间各造模组大鼠饮食饮水减少，体重减轻，精神萎靡，出现腹泻、便血。开始给药后，模型组上述症状有轻度自发缓解趋势，各给药组大鼠症状改善明显优于模型组。实验结束时，与模型组相比，各给药组DAI评分明显降低（P<0.01）；与给药前相比，各给药组DAI评分明显降低（P<0.01）。见表2。

2.2 H&E染色后结肠组织病理学观察

空白组结肠组织形态结构完整，黏膜层连续，隐窝排列整齐，固有层及肌层结构清晰，未见明显炎性细胞浸润；模型组结肠黏膜上皮缺损、腺体结构紊乱、隐窝结构破坏，固有层可见大量炎性细胞浸润；各给药组结肠病理表现较模型组有不同程度改善，黏膜损伤程度减轻，炎性细胞浸润减少，隐窝结构部分修复。见图1。

2.3 大鼠血液流变学变化

与空白组相比，模型组在不同切变率（低、中、高）下的全血黏度和血浆黏度出现了明显升高（P<0.01）。与模型组相比，美沙拉秦组、中药中剂量组及高剂量组在不同切变率（低、中、高）下的全血黏度和血浆黏度明显降低（P<0.01），中药低剂量组在低、中切变率下的全血黏度和血浆黏度明显降低（P<0.05，P<0.01），高切变率下的全血黏度变化无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.4 大鼠血清P⁃选择素、TXB2、6⁃Keto⁃PGF1α含量变化

与空白组相比，模型组P⁃选择素、TXB2、TXB2/6⁃Keto⁃PGF1α比值明显升高（P<0.01），6⁃Keto⁃PGF1α含量明显降低（P<0.01）。与模型组相比，各给药组P⁃选择素、TXB2、TXB2/6⁃Keto⁃PGF1α比值明显降低（P<0.01），6⁃Keto⁃PGF1α含量明显升高（P<0.01）。见表4。

2.5 大鼠肠黏膜微血管超微结构观察

6组微血管损伤程度可见一定程度差异。空白组基底膜完整，紧密连接未见异常，内皮细胞结构完整。模型组损伤最为明显，基底膜完整、轻微皱缩，内皮细胞破损、崩解，紧密连接未见，细胞器空泡变。中药低剂量组血管损伤次之，基底膜完整、轻微皱缩，血管腔塌陷，紧密连接致密区弥散、细胞间隙尚可，内皮细胞个别线粒体空泡变。美沙拉秦组、中药中剂量组损伤较轻，基底膜完整、尚可，紧密连接未见或损伤，内皮细胞细胞器肿胀、扩张。中药高剂量组血管损伤相对最轻，基底膜完整、尚可，紧密连接结构较短，内皮细胞未见水肿、结构尚可。见图2。

2.6 大鼠肠黏膜微血管胶原纤维阳性面积比率检测

在空白组中，观察到胶原纤维染色较少；而在模型组中，视野内胶原纤维明显增多；各给药组的胶原纤维染色较模型组有所减少。与空白组相比，模型组肠黏膜微血管内胶原纤维阳性面积比率明显升高（P<0.01）。与模型组相比，各给药组肠黏膜微血管内胶原纤维阳性面积比率明显降低（P<0.01）。见图3及表5。

2.7 大鼠结肠组织VEGF蛋白表达变化及肠黏膜MVD检测

与空白组相比，模型组结肠VEGF蛋白表达明显升高（P<0.05）。与模型组相比，各给药组结肠VEGF蛋白表达明显降低（P<0.05，P<0.01）。与空白组相比，模型组MVD明显增加（P<0.01）。与模型组相比，各给药组MVD明显降低（P<0.05，P<0.01）。见图4、5及表6。

3 讨论

在传统医学中未明确记载与UC完全对应的疾病名称，但有与其症状相对应的描述，目前学界认为UC属于“痢疾”、“肠澼”、“滞下”等范畴^［18］。本病属本虚标实，发病基础在于脾气虚弱，脾气虚则运化失职、湿浊内生，郁久化热，灼伤肠络，气血壅滞成瘀，治疗上应以健脾益气、化湿祛邪为主，兼顾调气和血。加味薏苡附子败酱散由薏苡仁、败酱草、附子、木香、当归、白术组成，方中薏苡仁、败酱草甘淡苦寒相合，清利湿热而不伤中阳；附子辛热温阳以助脾运；木香、当归合用，行气和血，应“调气则后重自除，行血则便脓自愈”之义；白术味苦甘性温，长于补气健脾以复运化之职，《本草经疏》言其为“安脾胃之神品”。全方共奏健脾益气固其本、清化湿热祛其标、调气和血畅其络之功，标本同治，使脾气得复，湿邪得化，湿热得清，气血调和。

由微动脉、毛细血管和微静脉构成的微循环系统，不仅参与人体器官和组织的代谢活动，还维持其正常的生理功能^［19］。肠道作为高度血管化的器官，黏膜中蕴含着密集的微循环网络。肠道正常的营养吸收、分泌和免疫调节功能都有赖于良好的肠黏膜微循环^［20］。当致病因素作用于微循环系统时，微血流和微血管会发生功能性或结构性异常，造成血液灌注受阻，进而导致器官和组织的功能失调，甚至可能引发组织变性和坏死^［21］。UC患者存在血液高凝状态和肠黏膜灌注不足，引起肠黏膜微循环障碍，肠黏膜屏障功能受损。肠黏膜屏障功能受损使得外源性抗原对肠道免疫系统的刺激增加，从而促进UC的发生^［2］。

血液流变学与血液成分的流动特性有关，而P⁃选择素、TXB2和6⁃Keto⁃PGF1α则是反映血液高凝状态的重要标志物。血液流变学异常增高通常会使血液处于高凝状态，导致血流流速减缓，微血管灌注不足，进而引发微循环障碍^［22］。在UC中，血小板生成的增加和功能的激活会导致血清中P⁃选择素的表达水平升高。P⁃选择素不仅通过活化血小板调节凝血功能，还能加剧黏膜炎症，促使血小板聚集，最终导致肠黏膜微循环的阻塞^［23］。同时，血小板活化产生并释放大量炎症介质，影响血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）与前列环素I2（prostaglandin I2，PGI2）之间的动态平衡，进一步加剧血液高凝状态。其中TXA2能够引起血管收缩并激活血小板聚集，从而促进血栓形成，PGI2具有促进血管舒张和抑制血小板聚集的功能，起到抗血栓作用^［24］。由于TXA2和PGI2的半衰期非常短，容易在短时间内降解和转化，因此通常通过检测它们的稳定代谢产物TXB2和6⁃Keto⁃PGF1α来评估其水平^［25］。本研究结果显示，加味薏苡附子败酱散能够明显降低UC大鼠血液流变学参数及血清中P⁃选择素含量，调节TXB2与6⁃Keto⁃PGF1α的失衡，从而改善肠黏膜微循环中的血液高凝状态，降低血栓形成的风险。

在高凝状态下，肠黏膜微循环的血流灌注量减少，进而造成肠黏膜微血管的损伤。在活动期UC患者的结肠镜检查中，可观察到明显的肠黏膜充血、水肿以及血管模糊等特征^［26］。这种微血管结构性损伤也是UC肠黏膜微循环障碍的一个重要因素。微血管损伤后，内皮下胶原纤维暴露，促进血小板与胶原纤维相互作用，诱导血小板活化和微血栓的形成，进而阻塞微血管^［27］。本实验结果显示，加味薏苡附子败酱散在一定程度上能够减轻UC大鼠肠黏膜微血管损伤，促进其修复，减少损伤导致的胶原纤维暴露，进而改善肠黏膜微循环障碍。

炎症区域的微血管结构发生改变，会促使炎性细胞进一步渗入，刺激内皮细胞增殖、促进血管生成。内皮细胞介导的血管生成是微循环障碍的关键因素^［28］。病理状态下，VEGF的过度表达会刺激血管通透性的增加并导致纤维蛋白原的渗出，促进病理性血管新生^［29］。病理性新生血管往往会呈现扭曲、萎缩、微血栓等异常特征，进一步加剧肠黏膜微循环障碍^［30］。MVD检测是一种常用于定量评估血管生成的重要参数，其参数水平与VGEF的表达相关^［31］。CD31是一种与血小板和内皮细胞相互作用的黏附分子，能有效地标识新生微血管的数量与密度^［32］。本实验结果表明，加味薏苡附子败酱散能够有效下调VEGF的表达，并在此基础上通过对UC大鼠肠黏膜MVD检测显示，本方能够明显减少UC大鼠肠黏膜MVD计数，抑制病理性微血管生成，从而改善肠黏膜微循环障碍。

综上，本研究发现加味薏苡附子败酱散可降低血液高凝状态，减少微血栓形成风险，修复肠黏膜微血管损伤，抑制病理性微血管生成，从而改善UC肠黏膜微循环障碍。此外，在本研究中，加味薏苡附子败酱散高剂量组在中药干预中疗效最为明显，提示其治疗效应与药物浓度相关，存在一定的浓度依赖性。

作者贡献度说明：

何志成：动物饲养、数据分析、文章撰写；陈江：实验设计及文章审校；李文晓：动物饲养、数据收集；张露蓉、梁国强：数据分析及文章修改；江星星、韦永娜、周琴：参与动物饲养。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

江苏省中医药学会攀登计划项目(PDJH2024035)

江苏省中医流派研究院开放课题(JSZYLP2024003)

苏州市应用基础研究（医疗卫生）科技创新项目(SYWD2024012)

苏州市科技发展计划（基础研究⁃医学应用基础研究）项目(SKYD2023040)