HSP90/MLKL/PGAM5/DRP1通路调控线粒体动力学抗VaD的作用研究

Study on the regulatory role of the HSP90/MLKL/PGAM5/DRP1 pathway in mitochondrial dynamics against vascular dementia

摘要

目的 探讨HSP90/MLKL/PGAM5/DRP1通路通过调节线粒体动力学平衡在血管性痴呆（vascular dementia， VaD）中的神经保护机制。 方法 采用随机数字表法将SD大鼠分组为假手术对照组、模型组及HSP90抑制剂干预组，每组9只。通过Morris水迷宫定位航行实验系统评估大鼠空间学习记忆能力，结合H&E染色技术观察海马CA1区神经元形态学改变，应用ELISA法检测血清肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis factor⁃alpha，TNF⁃α）、白细胞介素⁃10（interleukin⁃10，IL⁃10）水平。Western blot检测海马组织HSP90/MLKL/PGAM5/DRP1通路相关蛋白、ATP合酶α亚基（ATP5A）、融合蛋白1（MFN1）、融合蛋白2（MFN2）表达。免疫组化检测p⁃MLKL阳性表达。 结果 与假手术组相比，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数明显降减少，海马组织呈现明显神经元损伤；血清TNF⁃α水平升高，IL⁃10水平降低（P<0.05）；海马组织HSP90、PGAM5蛋白水平、p⁃MLKL/MLKL比值、p⁃DRP1（ser616）/DRP1比值增加，ATP5A、MFN1、MFN2蛋白水平下降；同时p⁃MLKL阳性细胞数明显增加（P<0.05）。经HSP90抑制剂干预后，上述指标能明显逆转（P<0.05），海马组织病理损伤减轻，学习记忆能力明显改善。 结论 通过抑制HSP90/MLKL/PGAM5/DRP1信号通路，可减少VaD大鼠线粒体过度分裂，维持线粒体动力学平衡，抑制神经炎症并改善认知功能，为VaD治疗提供新靶点。

Abstract

Objective To explore the neuroprotective mechanism of the HSP90/MLKL/PGAM5/DRP1 pathway in vascular dementia （VaD） by regulating the balance of mitochondrial dynamics. Methods SD rats were randomly divided into sham operation control group， model group and HSP90 inhibitor intervention group by random number table method， with 9 rats in each group. The spatial learning and memory ability of rats was evaluated by the Morris water maze positioning navigation test system. The morphological changes of neurons in the hippocampal CA1 area were observed by combining H&E staining technology. Serum Tumor Necrosis Factor⁃ α （TNF⁃α） was applied by ELISA. The levels of TNF⁃α and Interleukin⁃10（IL⁃10）.Western blot was used to detect the expressions of proteins related to the HSP90/MLKL/PGAM5/DRP1 pathway， ATP synthase α subunit （ATP5A）， fusion protein 1 （MFN1）， and fusion protein2（MFN2） in hippocampal tissues. Immunohistochemistry was used to detect the positive expression of p⁃MLKL. Results Compared to the sham operation group， the escape latency of rats in the model group was significantly prolonged， the number of crossing platforms was significantly reduced， and obvious neuronal damage was shown in the hippocampal tissue. The level of serum TNF⁃α increased and the level of IL⁃10 decreased （P<0.05）； The protein levels of HSP90 and PGAM5， the ratio of p⁃MLKL/MLKL， and the ratio of p⁃DRP1（ser616）/DRP1 in hippocampal tissue increased， while the protein levels of ATP5A， MFN1， and MFN2 decreased. Meanwhile， the number of P⁃MLKL positive cells increased significantly （P<0.05）. After intervention with HSP90 inhibitors， all the above indicators could be significantly reversed （P<0.05）， the pathological damage of hippocampal tissue was alleviated， and the learning and memory abilities were significantly improved. Conclusion By inhibiting the HSP90/MLKL/PGAM5/DRP1 signaling pathway， it can reduce mitochondrial hyperdivision in VaD rats， maintain mitochondrial dynamic balance， inhibit neuroinflammation and improve cognitive function， providing a new target for the treatment of VaD.

Graphical abstract

关键词

血管性痴呆 / HSP90/MLKL/PGAM5/DRP1通路 / 线粒体动力学

Key words

Vascular dementia / HSP90/MLKL/PGAM5/DRP1 pathway / Mitochondrial dynamics

血管性痴呆（vascular dementia， VaD）是一种由脑血管病变引起的认知功能障碍综合征，其核心病理机制涉及慢性脑低灌注、氧化应激及线粒体功能障碍等^［1，2］。伴随我国社会老龄化进程加速，其患病率明显攀升，已成为重大公共卫生挑战。据2020年的统计数据，我国60岁及以上人群中约有1 507万痴呆症患者，其中VaD病例约392万^［3］，给家庭和社会带来沉重负担。因此探索VaD有效治疗靶点具有重要意义。

近年研究发现，线粒体动力学失衡在VaD进展中发挥关键作用。线粒体通过融合和分裂2种方式维持其形态与功能，其中线粒体过度分裂可导致线粒体碎片化、能量代谢障碍及神经元凋亡，进一步加剧认知损伤^［4］。动力相关蛋白1（dynamin⁃related protein 1，Drp1）作为线粒体分裂的核心调控分子，其活性受磷酸化修饰调控，而磷酸甘油酸变位酶5（phosphoglycerate mutase 5，PGAM5）作为线粒体自噬与坏死性凋亡的关键调控因子，能够促进Drp1向受损线粒体的募集，进而促进线粒体分裂^［5，6］。但其上游机制尚不明确，有研究显示，热休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）的表达增高可影响混合谱系激酶结构域类似物（mixed lineage kinase domain⁃like protein，MLKL）的激活，并通过PGAM介导的线粒体分裂促进活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，进而推动细胞^［7］。这提示HSP90/MLKL/PGAM5/DRP1通路线粒体分裂过程中可能发挥重要作用。然而，HSP90/MLKL/PGAM5/DRP1通路在VaD中的具体作用机制尚未明确，尤其是该通路如何介导线粒体分裂影响VaD进程缺乏系统性研究。

基于此，本研究聚焦于HSP90/MLKL/PGAM5/DRP1通路在VaD中线粒体分裂的调控机制，旨在阐明其通过维持线粒体动力学平衡改善VaD病理的潜在作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

27只SPF级SD雄性大鼠，7周龄，体质量（280±20）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司［SCXK（湘）2019⁃0004］。实验于广西中医药大学SPF级屏障系统（使用许可证号：SYXK桂2024⁃0004）内开展，维持恒温环境（24 ℃±1 ℃）及12 h昼夜节律，全程执行标准化饲养管理，各项条件符合国家实验动物环境标准要求。实验方案经广西中医药大学动物实验伦理委员会审批通过（伦理号：DW20220212⁃062⁃08），所有操作严格遵循实验动物福利伦理规范。

1.2 主要药品及实验试剂

实验所用苏木精、伊红染液（珠海贝索生物技术有限公司，批号：BA⁃4041、BA⁃4024）；RIPA裂解液（北京索莱宝科技有限公司，批号：R0020）；HSP90抗体购自（美国CST，货号：#4877）；p⁃DRP1（Ser616）抗体（biodragon，货号：BD⁃PP1318）；p⁃MLKL（ser345）抗体（杭州华安生物技术有限公司，货号：ET1705⁃51）、MLKL抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号：A21894），PGAM5、ATP合酶α亚基（ATP5A）、DRP1、线粒体融合蛋白1（MFN1）、线粒体融合蛋白2（MFN2）、GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、抗鼠IgG二抗（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：68116⁃1⁃Ig、66037⁃1⁃Ig、12957⁃1⁃AP、66776⁃1⁃Ig、67487⁃1⁃Ig、60004⁃1⁃Ig、SA00001⁃2、SA00001⁃1）。HSP90抑制剂（17AAG）购自美国MCE（货号：HY⁃10211）。肿瘤坏死因子⁃α（TNF⁃α）、白细胞介素⁃10（IL⁃10）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（江苏酶免实业有限公司，货号：MM⁃0180R2，MM⁃0195R2）。

1.3 仪器

XR⁃XM101型Morris水迷宫（上海欣软公司）、BX43型光学显微镜、UC90型成像系统（日本Olympus公司）、电泳仪（DYY⁃4C）及凝胶成像系统（北京六一公司）等。

1.4 方法

1.4.1 造模、分组与给药

根据文献及课题组前期研究，采用双侧颈总动脉永久性结扎法（2VO）建立VaD大鼠模型。大鼠经异氟烷麻醉后，经颈部正中入路显微分离双侧颈总动脉并行结扎。假手术组仅进行血管分离操作。以水迷宫定位航行试验筛选造模成功的大鼠^［8］。将造模成功的大鼠分为模型组及HSP90抑制组，并设置假手术组，每组9只。HSP90抑制组大鼠接受腹腔注射给药，根据文献设置剂量为30 mg·kg^⁃1·d^⁃1［9］，药物干预持续7 d。

1.4.2 水迷宫实验

药物干预结束后，运用Morris水迷宫实验评估大鼠空间认知功能。实验每只大鼠连续进行5 d，将水迷宫划分为4个象限，平台置于第2象限，注水没过平台约3 cm。前4天进行定位航行实验，分别将大鼠从4个象限放入，大鼠找到平台则停止实验，记录大鼠的逃避潜伏期，若大鼠60 s内未找到平台，则引导它们至平台并停留1 min后取出。实验第5日实施空间探索测试，采集第5天的实验数据。第6天进行空间探索测试，移除隐藏平台并测定各组60 s内穿越原平台区域次数。

1.4.3 标本制备

水迷宫实验测试完成后，大鼠经20%乌拉坦麻醉后处死。各组随机取6只大鼠，分离海马组织于-80 ℃冻存，用于Western blot检测蛋白表达。另取各组3只大鼠，经心脏灌注固定后取脑组织，采用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，保存于4 ℃环境备用，后续进行苏木精⁃伊红染色及免疫组化检测。

1.4.4 H&E染色

取“1.4.3”项制备石蜡切片（5 μm），依次行二甲苯脱蜡及梯度乙醇水化处理，经H&E染色后，采用光学显微成像系统观测并采集大脑皮层组织病理形态图像。

1.4.5 ELISA检测大鼠血清中TNF⁃α、IL⁃10水平

严格参照ELISA试剂盒操作流程，应用酶标仪在450 nm波长条件下逐孔检测样本吸光值，依据标准曲线对大鼠血清中TNF⁃α、IL⁃10水平进行定量测定。

1.4.6 大鼠海马组织中通路相关蛋白表达检测

取各组大鼠海马组织适量，提取蛋白，蛋白浓度经定量及变性处理后配制上样样本，依次进行SDS⁃PAGE分离、PVDF膜转印及封闭处理。加入GAPDH、HSP90、p⁃MLKL、MLKL、p⁃DRP1（ser616）、PGAM5、DRP1、ATP5A、MFN1、MFN2一抗（稀释比例分别为1∶7 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶500、1∶1 000、1∶5 000、1∶2 000、1∶5 000、1∶2 000、1∶5 000），样品经4 ℃过夜孵育后，加入二抗工作液（稀释比：1∶7 000）室温孵育1.5 h，经TBST漂洗后行化学发光显影并采集图像，采用ImageJ软件对蛋白条带进行灰度值定量分析。

1.4.7 免疫组化检测海马组织中p⁃MLKL阳性表达

脑组织切片烘干，二甲苯脱蜡，乙醇洗脱，抗原修复，封闭，加p⁃MLKL一抗及对应二抗孵育；DAB显色，复染，流水返蓝，封片，显微镜下观察、拍照并进行分析。采用ImageJ软件测量组织区域的积分光密度和有效组织区域总面积，阳性表达量=积分光密度/组织总面积，对组间阳性表达量进行统计学分析。

1.5 统计学处理

采用SPSS 25.0统计软件进行统计学分析。计量数据以\overline{x}\pm s表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD法多重比较，方差不齐选用Games⁃Howell法，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 VaD大鼠学习及空间记忆能力检测

水迷宫实验结果显示：与假手术组大鼠相比，模型组逃避潜伏期时间较长（P<0.05）。与模型组相比，HSP90抑制组大鼠逃避潜伏期明显减少（P<0.05），表明其对VaD大鼠的学习能力缺陷具有明显保护作用；同时本研究评估了大鼠的空间记忆能力，与假手术组相比，模型组大鼠准确穿越次数明显降低；与模型组比较，HSP90抑制组大鼠平台穿越次数升高。以上结果表明HSP90抑制对VaD大鼠学习记忆能力具有改善作用，见表1。

2.2 VaD大鼠海马组织病理学改变

H&E染色结果显示：假手术组大鼠海马结构整齐，CA1区锥体细胞层排列规整，核膜结构完整，染色均匀，未观察到明显细胞凋亡及炎性浸润。与假手术组相比，模型组大鼠海马组织损伤严重，CA1区锥体细胞排列较紊乱，细胞呈现广泛坏死。细胞排列紊乱、染色不均，细胞之间间隙较大；大量神经元凋亡，固缩，深染。相较模型组，HSP90抑制组海马组织损伤程度明显减轻，CA1区锥体细胞排列较为整齐，细胞核形态完整，仅见少量神经元固缩深染。见图1。

2.3 VaD大鼠海马组织TNF⁃α、IL⁃10水平

相比假手术组，模型组大鼠血清中的促炎因子TNF⁃α水平明显升高（P<0.05），抗炎因子IL⁃10水平明显降低（P<0.05）。与模型组比较，HSP90抑制组大鼠血清中的TNF⁃α水平下调，而IL⁃10水平明显升高（P<0.05），见图2。

2.4 VaD大鼠海马组织HSP90/PGAM5/MLKL/DRP1通路相关蛋白水平

与假手术组比较，模型组大鼠海马组织中HSP90、PGAM5蛋白表水平以及p⁃MLKL/MLKL、p⁃DRP1（ser616）/DRP1比值明显升高，ATP合酶核心组分ATP5A、MFN1及MFN2表达水平明显降低（P<0.05）；与模型组相比，HSP90抑制组大鼠海马组织中HSP90、PGAM5蛋白表达水平及p⁃MLKL/MLKL、p⁃DRP1（ser616）/DRP1比值明显下降（P<0.05）；同时，ATP5A、MFN1、MFN2表达水平明显上调（P<0.05），见图3。

2.5 各组VaD大鼠p⁃MLKL阳性表达

与假手术组相比，模型组p⁃MLKL阳性表达明显增加（P<0.05），相较于模型组，HSP90抑制组p⁃MLKL阳性表达明显降低（P<0.05），见图4。

3 讨论

VaD是老年人群中常见的脑血管性疾病，以进行性认知功能障碍为主要临床特征。本研究通过双侧颈总动脉闭塞法构建VaD大鼠模型，行为学检测显示：与假手术组相比，模型组大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期明显延长，平台穿越次数减少，提示其空间学习与记忆功能受损。组织病理学分析进一步证实，模型组海马CA1区神经元呈现典型退行性改变，包括细胞排列紊乱、间隙增宽及核固缩比例升高，上述行为学与组织病理学特征共同验证了VaD模型的成功构建。近年研究发现线粒体功能障碍与VaD病理进程密切相关，其可能通过能量代谢失衡和氧化应激加剧神经元损伤，这为阐释VaD的分子机制提供了新视角。

线粒体作为能量代谢的核心细胞器，其通过氧化磷酸化途径合成三磷酸腺苷（ATP），对维持脑组织正常生理活动具有重要作用^［10］。在慢性脑低灌注病理状态下，线粒体功能障碍主要表现为ATP生物合成能力下降、ROS积累和线粒体动力学紊乱^［11］，与神经元损伤及认知功能减退存在直接因果关系^［12］。线粒体动力学与功能之间的复杂相互作用日益受到重视，该调控体系包含融合与分裂2个拮抗过程。线粒体融合是指线粒体之间的合并，由外膜蛋白MFN1、MFN2和内膜蛋白OPA1介导，促进线粒体间的物理连接，增强线粒体的功能和稳定性。线粒体分裂则主要由DRP1调控，是指线粒体分裂成较小单位，帮助清除受损线粒体并维持适当的线粒体数量^{［13，14］}。研究表明，脑内线粒体动态平衡失调可通过多途径参与认知障碍相关疾病的病理进程^{［15⁃17］}。基于此，通过药物干预恢复线粒体分裂⁃融合的动态平衡，已成为改善线粒体能量代谢、抑制氧化应激反应及保护神经元结构完整性的潜在治疗策略。

线粒体分裂核心调控因子DRP1的活性受磷酸化修饰动态调控。研究发现，DRP1蛋白的磷酸化主要发生于Ser616和Ser637两个位点。其中，Ser616位点的磷酸化可激活线粒体分裂过程，促进DRP1向线粒体外膜的转位；而Ser637位点的磷酸化则通过钙依赖性磷酸酶介导的去磷酸化作用，抑制线粒体分裂^{［17，18］}。研究显示，磷酸酶PGAM5通过介导DRP1 Ser637位点去磷酸化，促进DRP1线粒体转位并激活其GTP酶活性，最终引发线粒体过度分裂及功能紊乱^［19］。HSP90作为ATP依赖性分子伴侣，不仅通过钙调磷酸酶通路调控Drp1磷酸化，还与坏死性凋亡关键效应分子MLKL形成复合物以维持其稳定性^{［19，20］}。MLKL的寡聚化及膜转位依赖HSP90介导的构象调节，抑制HSP90则可降低MLKL磷酸化水平并阻断其与PGAM5的级联反应^［7］。该分子级联通过PGAM5/Drp1通路促进线粒体碎片化，进而触发细胞坏死及炎症反应^［7，21］。HSP90抑制剂可通过降低错误折叠蛋白积累改善突触可塑性，提示其在中枢神经系统疾病中的潜在治疗价值^［22］。因此，抑制HSP90/MLKL/PGAM5/DRP1通路可能对调节线粒体分裂、改善线粒体动力学具有重要意义，但其在VaD中的功能意义仍需验证。

本研究揭示调控HSP90/MLKL/PGAM5/DRP1通路改善线粒体动力学失衡，进而缓解VaD病理进程。Western blot检测显示，模型组海马组织HSP90表达明显升高，与Thirstrup等^［23］报道的抑制HSP90可促进错误折叠蛋白的降解，从而改善记忆障碍相吻合。此外，与假手术组相比，模型组PGAM5蛋白、p⁃MLKL/MLKL比值及p⁃DRP1（ser616）/DRP1比值明显上调，而线粒体融合蛋白MFN1、MFN2表达明显降低，这与Feng等^［18］报道的PGAM5/DRP1信号轴异常激活特征一致。HSP90不仅通过钙调磷酸酶调控DRP1磷酸化，还可与MLKL形成复合物维持其稳定性^{［20，24］}，这为本研究发现的HSP90双重调控机制提供了分子基础。免疫组化结果证实p⁃MLKL表达变化与蛋白检测结果一致。实验结果进一步显示，模型组ELISA检测发现促炎因子TNF⁃α水平升高而抗炎因子IL⁃10减少。Su等^［25］研究证实线粒体过度分裂可通过促进线粒体活性氧及NLRP3炎症小体的激活，加剧炎症反应，这为本研究观察到的炎症因子失衡现象提供了机制解释。上述结果调控HSP90/MLKL/PGAM5/DRP1通路调节线粒体分裂，维持线粒体动力学平衡，发挥神经保护效应。

综上所述，本研究从程序性坏死与线粒体稳态失衡的交互作用切入，证实通过抑制HSP90/MLKL/PGAM5/DRP1通路减轻VaD神经损伤，为多靶点干预VaD提供了新的实验依据。本研究尚存在不足之处，首先样本量小，缺乏临床研究数据，其次未针对HSP90/MLKL/PGAM5/DRP1进行干预实验以进一步明确其在VaD的信号转导机制，这也是下一步研究的重点。

作者贡献度说明：

朱小敏、符钰岚：构思设计实验并执行、文章撰写；卓桂锋、黄颖睿：数据收集处理分析；劳祎林、袁炳茂：数据核查；陈炜、吴林：文章修改审查。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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