范可尼贫血互补群D2基因在人胸膜间皮瘤中的表达及临床意义

Expression and clinical significance of fanconi anemia complementation group D2 (FANCD2) in human pleural mesothelioma (PM)

摘要

目的 探讨范可尼贫血互补群D2（fanconi anemia complementation group D2，FANCD2）基因在胸膜间皮瘤（pleural mesothelioma，PM）中的表达水平及敲低FANCD2基因对PM细胞NCI-H2052增殖和迁移的影响。 方法 应用癌症基因组图谱（the cancer genome atlas， TCGA）数据库下载PM基因表达数据、临床病理数据与生存状态数据；使用R语言、Perl软件等程序包作FANCD2在PM中的差异分析、临床病理相关性分析、COX单因素和多因素分析、免疫浸润分析及基因富集分析。采用qRT-PCR和WB检测间皮瘤细胞中 FANCD2的表达水平。通过CCK-8、克隆形成实验、划痕实验及细胞周期检测评估敲低FANCD2对PM细胞NCI-H2052增殖与迁移能力的影响。 结果 生信分析和体外细胞学实验结果表明，与正常对照组织和人正常间皮细胞Met-5A相比，不同类型的PM组织和PM细胞中FANCD2基因明显高表达（P<0.001）；FANCD2表达量与PM肿瘤分期具有明显相关性（P<0.05）；FANCD2基因高表达与PM患者预后不良正相关（P<0.001）；FANCD2基因高表达与PM中M2巨噬细胞等浸润水平正相关（P<0.05），并在细胞周期、卵母细胞减数分裂、细胞衰老等通路明显富集。在PM细胞NCI-H2052中通过siRNA敲低FANCD2基因表达能导致细胞周期G1/S期阻滞，并明显抑制PM细胞增殖和迁移。 结论 FANCD2在PM组织中高表达，是判断PM预后的良好指标之一，敲低FANCD2基因表达能导致细胞周期G1/S期阻滞，并明显抑制PM细胞增殖和迁移。

Abstract

Objective To explore the expression level of the fanconi anemia complementation group D2 （FANCD2） gene in pleural mesothelioma（PM） and the effect of knockdown of the FANCD2 gene on the proliferation and migration of PM cells NCI-H2052. Methods The cancer genome atlas （TCGA） database was used to download PM gene expression data， clinicopathological data and survival status data. R language， Perl software and other software packages were used for FANCD2 differential analysis， clinicopathological correlation analysis， COX univariate and multivariate analysis， immune infiltration analysis and gene enrichment analysis. qRT-PCR and WB were used to detect the expression of FANCD2 in mesothelioma cells. The effects of knockdown of FANCD2 on the proliferation and migration abilities of pleural mesothelioma cells were evaluated through CCK-8 assay， colony formation assay， scratch assay and detection of cell cycle changes. Results The results of bioinformatics analysis and in vitro cytology experiments showed that compared to normal control tissues and human normal mesothelial cells Met-5A， FANCD2 gene was significantly higher in different types of PM tissues and PM cells （P<0.001）； The expression level of FANCD2 was significantly correlated with the tumor stage of PM （P<0.05）. High expression of the FANCD2 gene was positively correlated with poor prognosis in patients with PM （P<0.001）； The high expression of FANCD2 was positively correlated with the infiltration level of M2 macrophages in PM （P<0.05）， and was significantly enriched in pathways such as the cell cycle， oocyte meiosis， and cell senescence. Knockdown of FANCD2 gene expression by siRNA in PM cell NCI-H2052 can lead to G1/S phase arrest of the cell cycle and significantly inhibit PM cell proliferation and migration. Conclusion The high expression of FANCD2 in PM tissues is one of the good indicators for judging the prognosis of PM， and knocking down FANCD2 gene expression can lead to G1/S phase arrest of the cell cycle and significantly inhibit PM cell proliferation and migration.

Graphical abstract

关键词

胸膜间皮瘤 / 范可尼贫血互补群D2 / 预后 / 生物信息学

Key words

Pleural mesothelioma / Fanconi anemia complementation group D2 / Prognosis / Bioinformatics

胸膜间皮瘤（pleural mesothelioma，PM）是位于胸膜腔的罕见难治性间皮细胞肿瘤^［1］。依据组织分型可将PM分为上皮型、双相型以及肉瘤型，其中上皮型约占PM病例的80%，且预后较好^［2］。PM的诊断依靠临床表现、影像学表现以及病理学报告，胸膜腔穿刺是其确诊的金标准^［3］。PM最常见的临床表现是继发胸膜腔积液之后的进行性呼吸困难，由于较难与其他肺部疾病进行鉴别诊断，PM患者常常处于晚期^［4］。PM对于包括手术切除、顺铂+培美曲塞化疗、放疗在内的联合治疗方案疗效不佳，中位生存时间为9~12个月，5年生存率约为5%^［5］。

在PM患者中常见抑癌基因和表观修饰的改变，其中BRCA1 相关蛋白 1 （BRCA1 associated protein 1，BAP1）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子 2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子 2B （cyclin dependent kinase inhibitor 2B，CDKN2B）、神经纤维瘤病2型（neurofibromin 2，NF2）、甲硫腺苷磷酸化酶（methylthioadenosine phosphorylase，MTAP）、肿瘤蛋白 p53 （tumor protein p53，TP53）等基因的突变率大于10% ^［6，7］；另外，有36%的PM患者携带有包括共济失调毛细血管扩张突变基因（ataxia telangiectasia mutated， ATM）、BAP1、CDKN2A、范可尼贫血互补群D2（fanconi anemia complementation group D2，FANCD2）等基因在内的致病性突变^［8］。范可尼贫血（fanconi anemia， FA）是一种包括骨髓异常、高发癌症、先天性障碍在内的罕见人类基因疾病，FA信号通路是DNA复制和损伤修复网络的重要一环^［9，10］；而FA信号通路的中心环节是FANCD2-FA互补组Ⅰ（FA complementation group Ⅰ， FANCI）基质复合体的泛素化^［11］。FANCD2基因位于染色体3p25.3，包含45个外显子，以FANCD2为中心的FA通路缺陷不仅导致基因组不稳定，而且会诱导肿瘤发生。近年来，多项证据表明，FANCD2基因在乙型肝炎相关肝细胞癌中过表达 ^［12］，且明显促进肺腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力 ^［13］，在髓母细胞瘤（medu lloblastoma， MB）中恶性声波刺猬亚型（SHH-MB）^［14］、子宫内膜癌（endometrial carcinoma， EC）^［15］、骨肉瘤（osteosarcoma， OS）^［16］ 等肿瘤细胞中高度表达。然而，FANCD2在PM中的表达及临床意义目前尚不明确，本研究利用生物信息学分析了FANCD2基因在PM中的表达情况，通过体外实验验证了敲低FANCD2基因对PM细胞增殖和迁移的影响，为PM的临床诊断和药物开发提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 肿瘤公共数据库数据分析

利用TIMER（https：//cistrome. shinyapps. io/ timer/）数据库分析FANCD2 mRNA在各种恶性肿瘤中的表达水平，通过ucsc xena网站（https：//xena.ucsc.edu/）下载间皮瘤数据集（TCGA-MESO.htseq_fpkm.tsv.gz）、肺腺癌数据集（TCGA-LUAD.htseq_fpkm.tsv.gz）以及肺鳞癌数据集（TCGA-LUSC.htseq_fpkm.tsv.gz），及通过GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/geo/）下载间皮瘤数据集。使用Perl软件（5.40.2.1）提取表达矩阵并将Ensemble ID转换基因ID，在R软件（4.3.1版）使用limma和ggpubr程序包提取表达数据中的FANCD2基因表达量并分组比较正常与肿瘤样本的FANCD2基因表达水平，绘制表达差异散点图（表1）。

1.2 FANCD2基因表达与临床病理相关性的研究

通过ucsc xena网站下载间皮瘤临床病理数据集（TCGA-MESO.GDC_phenotype.tsv.gz）。根据样本ID合并基因表达数据和临床病理数据，对合并数据进行赋值处理，并根据FANCD2基因表达量（mininum： 0.997 9，medium： 2.621 0， maximum： 4.714 2）中位值将PM患者样本分为高表达组和低表达组，筛查和注释数据后做相关统计学分析。在R软件中使用epicalc和cdgsr程序包分析FANCD2基因表达量与PM患者年龄、性别、Stage分期、M分期、N分期、T分期、组织分型的单因素和多因素的相关性。

1.3 FANCD2基因与PM患者预后相关研究

进入GEPIA官网（http：//gepia.cancer-pku.cn/），在单基因分析模块输入FANCD2基因，选择生存曲线作图，保持95%置信区间，选择MESO数据库并单击plot作图。

1.4 FANCD2基因与肿瘤微环境（tumor microenvironment， TME）和免疫细胞浸润相关性分析

使用“estimateScore”算法计算所有MESO样本的Stromal Score、 Immune Score 和 ESTIMATE Score，并用小提琴图展示FANCD2基因与间皮瘤肿瘤微环境的相关性。基于 TCGA 数据库分析FANCD2与多种肿瘤浸润免疫细胞的相关性。筛选有统计学意义的免疫细胞类型并输出为可视化图表。此外，本研究还在TCGA数据库间皮瘤样本中分析FANCD2与多种免疫检查点基因表达的相关性。

1.5 FANCD2基因富集 （gene set enrichment analysis， GSEA）分析

为了分析PM中与FANCD2表达相关的信号通路，利用基因本体（GO）、京都基因和基因组百科全书（KEGG）等知名分类系统进行富集分析^{［17，18］}，同时使用TCGA-PM数据集进行GSEA分析，以反映FANCD2在PM中的功能。将TCGA数据库PM样本按照FANCD2基因mRNA表达量的中位数分为高表达组和低表达组，并对两组进行差异分析，根据处理后基因的logFC值从大到小排序，序列上部是上调的差异基因，序列下部是下调的差异基因，进行GSEA分析。计算基因集的富集分数（enrichment score， ES），对基因集的ES值显著性检验，估计ES的显著性。最后进行多重假设检验，根据基因集的大小对ES标准化，得到标准化后富集分数（normalized enrichment score， NES），随后用NES计算假阳性率，从而得到显著富集的基因集。并基于TCGA下载的间皮瘤数据使用R软件（4.2.2版）的“pheatmap”包筛选出PM中与FANCD2相关程度高的一些基因，使用R软件（4.2.2版）的“color‐space”、“stringi”、“ggplot2”、“citclize”、“RColor‐Brewer”、“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”及“enrich‐plot”包对共表达基因进行GO功能富集和KEGG信号通路富集分析。

1.6 细胞培养

正常人胸膜间皮细胞系MeT-5A购自上海青旗生物技术发展有限公司，人PM细胞系MTSO-211H、NCI-H28、NCI-H2052和NCI-H2452购自中国科学院上海细胞库。MeT-5A细胞使用含有厄尔平衡盐溶液（BSS），0.75 mmol/L的L-谷氨酰胺和1.25 g/L的碳酸氢钠的培养基199（Nissui公司，Janpan）培养，并补充3.3 nmol/L的表皮生长因子、400 nmol/L氢化可的松、870 nmol/L胰岛素、20 mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液（HEPES）和10%（v/v）胎牛血清（FBS）。MTSO-211H、NCI-H28、NCI-H2052和NCI-H2452细胞使用含谷氨酰胺RPMI 1640培养基（香港EVACell公司）添加10% FBS及1%双抗（链霉素/青霉素）培养，放置于37 ℃、5% CO₂无菌恒温培养箱中进行常规培养。所有细胞系通过短串联重复序列（short tandem repeat，STR）分析进行鉴定，并使用TransDetect荧光素酶支原体检测试剂盒检查有无支原体的污染。

1.7 稳转细胞构建

SiControl、si-FANCD2-1和si-FANCD2-2沉默慢病毒载体由山东维真生物公司合成。将5×10⁴ 个NCI-H2052细胞铺入6孔板中，待细胞贴壁后加入慢病毒载体和助染剂polybrebe。孵育48 h后镜下观察细胞荧光状态，待稳定转染后使用嘌呤霉素筛选细胞，去除未成功转染的细胞，进而构建稳转细胞系。

1.8 实时定量PCR （real-time quantitative PCR， RT-qPCR）

RNAsimple总RNA提取试剂盒（购自TIANGE-DP 230410）分别提取MeT-5A细胞株和不同PM细胞株的mRNA，按照HiScript Ⅱ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）说明书进行逆转录反应获取cDNA。使用Servicebio 2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix以MeT-5A细胞和不同PM细胞的cDNA为模板在实时荧光PCR分析仪（艾普拜生物科技有限公司）进行qRT-PCR完成扩增。以上操作按说明书进行。FANCD2 基因引物序列正向引物：5′-ACATACCTCGACTCATTGTCAGT‐3′，反向引物：5′-TCGGAGGCTTGAAAGGACATC‐3′。β-actin基因正向引物：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC，反向引物：5′‐CTCCTTAATGTCACGCACGAT‐3′。扩增系统包括10 μL 2×Universal Blue SYSR Green qPCR Master Mix、正向和反向引物各0.4 μL、2 μL cDNA和7.2 μL ddH₂O。避光条件下加样。扩增条件为95 ℃预变性30 s、95 ℃变性 15 s、60 ℃退火30 s和72 ℃延伸1 min，以此为1个循环，循环40次。在35个PCR循环的终点进行解离曲线分析。采用2^{‐ΔΔ Ct}法进行相对定量。β-actin作为内参基因，每个样品设置3个复孔，实验独立重复3次，计算取其平均值。

1.9 Western blot检测

各组细胞接种到6孔板中，48 h后收集细胞，加入150 μL的预冷RIPA裂解液，冰上裂解30 min（期间每10 分钟涡旋混匀1次）使其充分裂解。4 ℃条件下12 000 r/min离心20 min，收集上清液。根据BCA蛋白定量试剂说明书在96孔板中制备蛋白浓度待测液，轻轻混匀于37 ℃孵育30 min后，利用酶标仪测量吸光度值，收集数据绘制标准曲线后，使用RIPA裂解液作为稀释液以统一所有蛋白样品浓度。将蛋白质样品100 ℃金属浴10 min变性后，即可进行SDS-PAGE电泳（80 V，40 min；120 V，90 min），转膜（使用PVDF膜）以及封闭（5%脱脂牛奶），在用TBST清洗3次（10 min/次）后添加一抗4 ℃摇床过夜（12~16 h）。第二天取出室温摇床孵育30 min，弃一抗，使用TBST清洗3次，加入二抗室温摇床孵育2 h，再次TBST清洗3次后即可滴加显影液利用化学发光成像系统进行显影并拍摄记录，通过ImageJ软件分析条带灰度值。实验独立重复3次，计算取其平均值。

1.10 CCK-8测定

使用Cell Counting Kit-8（CCK8）（日本Dojindo公司）试剂检测细胞增殖能力，并在24、48、96 h分别进行评估。实验独立重复3次，计算取其平均值。

1.11 克隆形成实验

将细胞以每孔1 000个细胞的浓度接种到6孔板中，每3 天用新鲜培养基更换1次培养基。培养12 d后，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，用0.5%结晶紫染色30 min，再用PBS洗涤并拍照，用ImageJ计算集落数。实验独立重复3次，计算取其平均值。

1.12 划痕试验

将细胞接种到6孔板中，一旦细胞融合超过95%，使用移液管尖端在每个孔中制作3个伤口。在显微镜下于0 h和48 h拍摄随机选择的视野。细胞迁移率计算为0 h时细胞迁移面积与伤口面积的比值。实验独立重复3次，计算取其平均值。

1.13 细胞周期检测

将细胞接种到6孔板中，48 h后收集细胞，并在4 ℃下用70%乙醇固定过夜。在37 ℃下，用含有50 μg/mL碘化丙啶（PI，Beyotime，C1052）和100 μg/mL RNase A（Beyotime，ST576）PBS对固定细胞进行染色，使用Beckman A00-1-1102流式细胞仪分析PI荧光直方图上每个细胞周期的百分比。实验独立重复3次，计算取其平均值。

1.14 统计学处理

在线数据库分析采用数据库默认统计方法，采用R软件以及Graphpad Prism10.0处理数据，运用卡方检验及双向无序R×C表资料的Fisher确切概率法分析FANCD2基因表达水平与PM患者临床病理参数的相关性。预后分析采用Kaplan-Meier 生存分析和Log-rank检验进行生存分析、单因素及多因素COX回归分析。相关性分析采用Pearson 相关分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 FANCD2 mRNA在不同肿瘤中的表达

数据库分析发现，FANCD2的表达在膀胱癌（bladder cancer，BLCA）、宫颈鳞癌（cervical squamous cell carcinoma，CESC）、结肠癌（colon adenocarcinoma，COAD）、食管癌（esophageal carcinoma， ESCA）、头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC）、肝细胞肝癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）、胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD），前列腺癌（prostate adenocarcinoma，PRAD）、直肠腺癌（rectum adenocarcinoma，READ）、胃癌（stomach adenocarcinoma，STAD）等肿瘤组织中的表达水平较正常组织高（P<0.001）（图1A）。此外，在TCGA数据库中，以108例正常肺组织样本为对照，本研究发现在86例PM组织样本中FANCD2基因mRNA表达水平升高（图1B）。除此之外，在GEO数据库3个不同的数据集GSE12345、数据集GSE42977和数据集GSE51024分别验证了与正常间皮组织相比，FANCD2基因mRNA表达量同样明显升高（图1C~E）。

2.2 FANCD2 mRNA表达水平与PM患者临床病理参数的相关性

基于TCGA数据库数据分析，PM患者不同的临床病理特征在FANCD2高低表达组的分布情况见表2。其中，FANCD2表达与PM患者年龄、性别、组织分型等无明显相关性（P>0.05），而与肿瘤T分期有明显相关性（P<0.05）。

2.3 FANCD2基因mRNA表达与患者预后的关系

基于TCGA数据库数据进行生存分析，结果表明FANCD2高、低表达组的总生存期（overall survival， OS）差异具有统计学意义， FANCD2高表达组的总生存期低于低表达组（Logrank P=0.000 15， HR=2.6）（图2A）；同样，FANCD2高、低表达组的无疾病进展生存期（disease free survival， DFS）差异具有统计学意义（Logrank P =0.028， HR=1.9）（图2B）。由此可知，FANCD2基因高表达提示PM患者预后不良。单因素、多因素COX分析进一步证实，肿瘤组织类型和FANCD2基因表达水平是与PM预后相关的独立危险因素（P<0.05）（表3）。

2.4 FANCD2 mRNA表达与PM免疫特征关系的分析

从TME分析可得，相较于FANCD2低表达组，在高表达组中的基质细胞评分升高，而免疫细胞评分差异无统计学意义（P>0.05）（图3A）。FANCD2基因与免疫细胞浸润相关性见图3B，免疫细胞浸润分析结果显示，FANCD2和M2巨噬细胞、M1巨噬细胞、M0巨噬细胞等多种免疫细胞的浸润呈正相关，但与活化NK细胞、活化树突状细胞、浆细胞等免疫细胞的浸润呈负相关。其中，FANCD2基因在间皮瘤中与M2巨噬细胞浸润正相关，与活化NK细胞、活化树突状细胞浸润呈负相关，差异具有统计学意义（P<0.05）（图3C~E）。

另外，本研究在PM表达数据库中筛选出与 FANCD2具有表达相关性的基因（图4A），基因共表达分析显示，蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A， CIP2A）、永恒的昼夜节律调节器基因（timeless circadian regulator gene， TIMELESS）、DNA聚合酶θ（DNA polymerase θ， Pol θ， POLQ）、FANCI、姐妹染色单体共凝结建立N-乙酰转移酶2（establishment of sister chromatid cohesion N-acetyltransferase 2， ESCO2）、BUB1有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶（BUB1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase B， BUB1B）与FANCD2呈明显正相关（图4B），而干扰素诱导的跨膜蛋白2（interferon induced transmembrane protein 2， IFTM2）、肿瘤抑制候选基因1（tumor suppressor candidate 1， TUSC1）、转录延伸因子A （SII）样2（transcription elongation factor A like 2， TCEAL2）、磷脂酶A2组IB基因（phospholipase A2 group IB， PLA2G1B）、细胞色素b5A型基因（cytochrome b5 type A， CYB5A）与FANCD2呈明显负相关。同时，通过进一步分析FANCD2基因和多个免疫检查点基因表达水平的相关性，见图4C、D，本研究发现FANCD2基因的表达水平与CD276、TNF受体超家族成员25（TNF receptor superfamily member 25，TNFRSF25）、神经纤毛蛋白（neuropilin 1， NRP1）等免疫检查点基因表达呈正相关。

2.5 基因富集分析

为了明确FANCD2在PM中的功能，对其进行GO与KEGG分析。在GO分析中显示FANCD2主要定位于纺锤体、染色体、凝集染色体、着丝粒、中间体等区域。与染色体分离、核裂解、核染色质分离、核有丝分裂、姐妹染色单体分离、有丝分裂姐妹染色单体分离等生物过程有关。参与微管、微管蛋白结合、丝氨酸蛋白激酶活性、微管运动活动、Yto骨骼运动活动、组蛋白激酶活性等生化过程（图5A）。在KEGG富集分析中，主要与细胞周期、卵母细胞减数分裂等信号通路相关（图5B）。基于PM表达数据本研究进一步对FANCD2基因进行基因集富集分析。结果显示，FANCD2高表达组主要与黏着连接、扩张型心肌病、受体之间相互作用、黏着斑、肥厚型心肌病等信号通路相关（图5C）。然而，FANCD2低表达组主要富集在补体激活、循环免疫介导的体液免疫反应、体液免疫球蛋白复合物、循环免疫球蛋白复合物、免疫球蛋白受体结合等信号通路（图5D）。

2.6 FANCD2基因mRNA和蛋白质水平在PM细胞中高表达

RT-qPCR实验结果进一步证实，相比较于人正常胸膜间皮细胞MeT-5A，FANCD2 mRNA 在4株不同PM细胞株（MTSO-211H、NCI-H28、NCI-H2052和NCI-H2452）中的表达明显上调（图6A）；Western blot检测结果同样显示，与人正常胸膜间皮细胞MeT-5A相比，FANCD2蛋白在4株不同类型的PM细胞中的表达也明显上调（图6B）。

2.7 敲低FANCD2基因明显抑制PM细胞增殖和迁移

采用慢病毒载体介导转染，将si-FANCD2-1、si‑FANCD2-2及阴性对照siControl分别导入NCI-H2052细胞。转染后利用嘌呤霉素进行48 h筛选，并通过传代培养，成功建立敲低FANCD2的NCI-H2052稳转细胞株。实验发现，敲低FANCD2后，细胞内FANCD2蛋白及mRNA表达水平出现明显下调（P<0.01）（图7A、B）。CCK-8实验结果显示，随着时间推移，细胞抑制率逐步升高，在48、96 h时间点，细胞存活率与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.01）（图7C）。克隆形成实验数据表明，相较于对照组，si‑FANCD2-1、si‑FANCD2-2组细胞的克隆形成数量明显减少（P<0.01）（图7D、E）。上述结果充分表明，敲低FANCD2能够有效抑制间皮瘤细胞的增殖能力。此外，划痕实验结果显示，48 h时si-FANCD2-1、si-FANCD2-2组间皮瘤细胞的迁移率较对照组明显下降（P<0.01）（图7F、G）。这一实验进一步证实敲低FANCD2可明显抑制NCI-H2052细胞的迁移能力。

2.8 敲低FANCD2基因对PM细胞周期的影响

流式细胞术检测结果显示，在si-FANCD2-1、si‑FANCD2-2组中G0/G1期的细胞比例较siControl组增多，相对应的siFANCD2-1、siFANCD2-2组S期的细胞比例较siControl组减少，差异具有统计学意义（P<0.001），提示细胞周期出现G1/S期阻滞（图8A、B）。敲低FANCD2基因表达后，si‑FANCD2组细胞周期相关蛋白如细胞周期蛋白依赖性激酶 6（cyclin-dependent kinase 6， CDK6）、细胞周期蛋白依赖性激酶 4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）、G1/S-特异性周期蛋白-D1（G1/S-specific cyclin-D1，cyclin D1）的表达水平较 siControl组明显下降（图8C）。以上结果说明FANCD2通过抑制细胞周期蛋白介导的细胞周期阻滞来降低PM细胞的增殖能力。

3 讨论

大多数PM患者在确诊时已处于局部晚期，需采用多模式综合治疗。PM的治疗方案取决于肿瘤分期、组织学亚型及患者的体能状态^［19］。鉴于转移性疾病的治疗选择有限，且实体瘤存在明显的时空遗传异质性，导致治疗反应不佳和高复发率，预后普遍较差，因此亟需为PM寻找新的生物标志物以改善治疗效果^［20］。研究表明，FANCD2在癌症中参与调控肿瘤发生、细胞凋亡及其他生命过程^［21］，如胶质母细胞瘤^［22］、食管鳞状细胞癌（esophagus squamous cell carcinoma，ESCC）^［23］和肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）^［24］。作为与铁死亡相关的基因，FANCD2可调节铁死亡进程。铁死亡与多种癌症类型的进展密切相关，在PM中尤其发挥关键作用，FANCD2被确认为这一过程的重要调节因子，并对疾病预后产生明显影响^［25］。已有研究证实，FANCD2基因高表达提示PM预后不良，敲低 FANCD2 基因的表达水平会增加PM细胞对铁死亡诱导剂的敏感性 ^［25］。

本研究通过整合TCGA及GEO数据库PM患者的临床数据与转录组测序数据，评估了FANCD2基因的表达特征。基于TCGA和GEO数据库获取PM患者的临床信息及RNA测序数据，并提取出FANCD2基因表达水平数据。基因表达差异分析显示，与正常间皮组织相比，PM组织中FANCD2基因mRNA表达量明显升高。除此之外，研究发现FANCD2基因表达量与PM患者中患者年龄和肿瘤T分期有显著相关性，符合现实生活中PM的人群分布特征^［26］。FANCD2基因高表达提示PM患者预后不良，单因素Cox回归分析表明，PM病理类型及FANCD2表达水平与PM患者预后明显相关。多因素Cox回归进一步证实，非上皮型PM及FANCD2基因高表达是患者预后不良的独立危险因素。故FANCD2基因具有明显的独立预测效能，提示其可能作为PM患者的预后生物标志物。肿瘤浸润免疫细胞对肿瘤进展及机体免疫检查点阻断治疗应答具有重要调控作用^［27］。本研究发现，FANCD2表达与M2型巨噬细胞浸润呈明显正相关。相关研究揭示，M2巨噬细胞可能作为免疫抑制性细胞群，通过促进免疫抑制性肿瘤微环境的形成、增强肿瘤免疫逃逸能力，最终导致肿瘤发生及进展的加速^［28］。成功的免疫治疗不仅取决于肿瘤微环境中免疫细胞的充分浸润，还取决于免疫检查点的表达^［29］。免疫检查点分析表明，FANCD2的表达与CD276、TNFRSF25、NRP1等免疫检查点分子的表达呈明显正相关。其中CD276在癌细胞中高表达，可促进肿瘤免疫逃逸并协助癌细胞逃避免疫监视^［30］。除此之外，NRP1不仅对肿瘤微环境中调节性T细胞（Treg）的内源性稳定具有重要作用，还能明显抑制CD8⁺ T细胞的抗肿瘤功能。因此，NRP1可作为具有重要肿瘤免疫学及免疫治疗价值的检查点靶标^{［31，32］}。之后，本研究通过对表达差异的基因进行GSEA富集分析发现，FANCD2基因可能通过细胞周期、细胞衰老、卵母细胞减数分裂等信号通路影响PM的生物学功能。既往相关研究发现，敲低FANCD2基因表达可增加DNA损伤和减少S期细胞，进而降低肿瘤细胞的增殖能力，这与PM中FANCD2在细胞周期、卵母细胞减数分裂和DNA复制的基因富集结果一致^［15］。除此之外，有研究通过筛选发现CIP2A、TIMELESS、POLQ、FANCI、ESCO2、BUB1B等多个基因与FANCD2基因表达呈明显正相关。其中，CIP2A作为蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A， PP2A）的内源性抑制剂，主要通过抑制PP2A介导的蛋白激酶B去磷酸化及稳定骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物（myelocytomatosis oncogene，MYC）蛋白发挥促癌作用。而PM患者普遍存在CIP2A的过表达。该发现为通过个体化联合治疗方案改善PM患者预后提供了重要理论依据^［33］。相关研究也表明，ESCO2基因在LIHC、PAAD、 LUAD及间皮瘤（mesothelioma， MESO）等多种恶性肿瘤中高表达且患者生存期明显缩短，其表达水平对癌症患者预后具有可靠预测效能。此外，ESCO2还参与细胞周期进程与肿瘤细胞增殖的调控网络^［34］。最近有研究显示，FANCD2明显促进LUAD细胞的增殖、侵袭和迁移能力，其促进癌症细胞增殖的能力可以通过调节细胞周期来实现^［35］。通过分析FANCD2在不同肿瘤中的致癌作用，发现FANCD2是癌症治疗的潜在生物标志物和治疗靶点^［35］。

为进一步探究FANCD2基因在PM发生、发展过程中，是否通过调控细胞周期在增殖与迁移中发挥作用，本实验构建了敲低FANCD2 基因表达的稳转PM细胞株。实验结果显示，与对照组相比，敲低FANCD2基因表达后的PM细胞增殖能力和迁移能力明显降低，证实了PM细胞株中高表达的FANCD2能够促进肿瘤细胞增殖与迁移。为进一步剖析FANCD2影响PM细胞增殖的潜在分子机制，运用流式细胞术，检测敲低FANCD2基因对细胞周期的影响。实验数据表明，敲低FANCD2基因后，处于G0/G1期的细胞比例明显增加，而S期细胞比例则相应减少，提示细胞周期出现G1/S期阻滞。此外，敲低FANCD2后，其相关的细胞周期调控蛋白如CDK4、CDK6和cyclin D1表达水平也明显下降。CDK4/6和cyclin D1的下调可能介导G1/S期转换受阻并最终导致PM细胞生长受到抑制。该结果进一步揭示，FANCD2 可能通过调节细胞周期进程，参与对PM细胞增殖的调控。除此之外，相关研究表明，负责同源重组DNA修复的Fanconi贫血/BRCA2 通路是PM化疗和放射耐药的关键通路。FANCD2可以作为PM治疗的靶点^［36］。在癌症早期，基因组不稳定性升高，FANCD2可能因DNA损伤增加而被激活（如发生泛素化修饰）。血液或体液样本中FANCD2的异常片段（如循环肿瘤DNA中的突变）可能成为早期筛查的潜在指标，尤其适用于缺乏特异性标志物的癌症（如胰腺癌）。放疗和部分化疗药物（如顺铂、丝裂霉素）通过诱导DNA损伤杀伤肿瘤细胞，而FANCD2介导的修复通路会降低肿瘤对这些治疗的敏感性。若肿瘤中FANCD2高表达，可能提示其DNA修复能力强，对顺铂等药物耐药，可能需调整治疗方案。相关研究也表明，FANCD2表达与增殖相关特征Ki-67、Cyclin A和MAI的表达密切相关，FANCD2和Ki-67在浸润性乳腺癌细胞中共表达^［37］，提示FANCD2与其他标志物（如p53、Ki-67、DNA 损伤相关基因）联合检测可提高预后评估的准确性。

综上所述，FANCD2作为参与DNA复制和损伤修复的关键调控因子，可能参与细胞周期的调控，进而影响PM细胞的增殖和迁移，但其具体作用机制仍有待实验验证。本研究仍然存在一定的局限性，后期将继续扩大临床标本量，并且收集PM患者的临床信息及生存资料来进一步验证FANCD2基因在PM疾病诊断的作用及预后评估中的价值。未来本课题组也将进一步探索FANCD2基因在PM中的生物学功能及其可能的分子机制，为未来PM治疗提供新的潜在靶点。

作者贡献度说明：

赵丹、李正亮：实验设计、文章撰写；杨文仲：数据统计分析、作图；王小忆、李锦松：数据整理；张国美、熊伟：研究指导、论文审阅、经费支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(82160516)

云南省地方本科高校基础研究联合专项面上项目(202101BA070001-128)

云南省地方本科高校基础研究联合专项面上项目(202401BA070001-093)

大理大学第一附属医院第二批学科队伍建设项目(DFYXK2023019)

大理大学第一附属医院第四批学科队伍建设项目(DFYXK2024002)