USP7通过增强Notch1蛋白稳定性促进结肠癌增殖、迁移过程

USP7 promotes the malignant progression process of colon cancer by enhancing the stability of Notch1 protein

摘要

目的 探讨USP7/Notch1/Hes⁃1信号轴对实体瘤结肠癌（colorectal cancer，CRC）的增殖、迁移影响的具体机制。 方法 通过ENCORI数据库（https：//rnasysu. com/ encori）分析USP7、Notch1在CRC中的表达；通过GEPIA数据库（http：//gepia. cancer.pku.cn/）分析USP7与Notch1的相关性；通过人类蛋白质图谱（the human protein atlas，HPA）数据库分析CRC组织和正常结肠组织中USP7、Notch1的蛋白表达水平。STRING数据库构建USP7、Notch1蛋白互作网络；HDOCK进行蛋白⁃蛋白对接；免疫共沉淀（co⁃immunoprecipitation，Co⁃IP）实验验证USP7与Notch1的蛋白互作。建立过表达USP7细胞系，Western blot检测Notch1及下游分子Hes⁃1的蛋白表达，IP验证过表达USP7后Notch1的泛素化水平；CCK8、平板克隆实验检测过表达USP7和同时敲低Notch1后CRC增殖能力变化，Western blot检测Notch1、Hes⁃1的蛋白表达；划痕、Transwell实验检测CRC迁移能力变化，Western blot检测Vimentin、E⁃cadherin的蛋白表达。 结果 与正常组织（n=41）相比，USP7、Notch1在CRC组织（n=471）中明显高表达（P<0.01）；CRC组织中的USP7、Notch1蛋白表达水平高于正常结肠组织；且USP7与Notch1明显相关，USP7与Notch1存在相互作用；过表达USP7后，Notch1、Hes⁃1蛋白水平增加，Notch1的泛素化水平降低；过表达USP7后，CRC细胞克隆形成数目增加，迁移能力增强（P<0.05）；在过表达USP7基础上敲低Notch1后，细胞克隆数目减少，迁移能力降低（P<0.05）。 结论 去泛素化酶USP7在CRC中高表达；USP7通过增强Notch1的蛋白稳定性从而影响CRC的增殖和迁移。

Abstract

Objective To investigate the specific mechanisms by which the USP7/Notch1/Hes⁃1 signaling axis regulates the proliferation and migration of colorectal cancer （CRC） cells. Methods The expression of USP7 and Notch1 in CRC was assessed using the ENCORI database （https：//rnasysu.com/encori）. The correlation between USP7 and Notch1 expression was analyzed utilizing the GEPIA database （http：//gepia.cancer-pku.cn/）. Protein expression levels of USP7 and Notch1 in CRC tissues and paired normal colon tissues were examined via The Human Protein Atlas （HPA） database. The protein⁃protein interaction network between USP7 and Notch1 was constructed using the STRING database. Molecular docking of USP7 and Notch1 was performed using HDOCK. The physical interaction between USP7 and Notch1 proteins was experimentally validated by co⁃immunoprecipitation （Co⁃IP）. An USP7⁃overexpressing cell line was established. Western blot was employed to assess the protein expression levels of Notch1 and its downstream effector， Hes⁃1. The effect of USP7 overexpression on Notch1 ubiquitination was further confirmed by immunoprecipitation （IP） analysis. To investigate the functional consequences， cell proliferation was evaluated using CCK⁃8 and colony formation assays following USP7 overexpression and concomitant Notch1 knockdown. Protein levels of Notch1 and Hes⁃1 under these conditions were again determined by Western blot. Cell migration capacity was assessed by wound healing （scratch） and Transwell assays. Additionally， Western blot was used to detect changes in the expression of epithelial⁃mesenchymal transition （EMT） markers， Vimentin and E⁃cadherin. Results Compared to normal tissues （n=41）， both USP7 and Notch1 were significantly upregulated in CRC tissues （n=471，P<0.01）. Consistent with this， protein expression levels of USP7 and Notch1 were also markedly higher in CRC tissues than in normal colon tissues. Furthermore， a significant correlation and direct interaction were identified between USP7 and Notch1. Overexpression of USP7 led to a significant increase in Notch1 and Hes⁃1 protein levels and a concomitant decrease in Notch1 ubiquitination. Functionally， USP7 overexpression significantly enhanced CRC cell clonogenicity and migration capacity （P<0.05）. Importantly， these pro⁃tumorigenic effects were reversed by concomitant Notch1 knockdown under USP7 overexpression conditions， resulting in significantly reduced colony formation and migration （P<0.05）. Conclusion The deubiquitinating enzyme USP7 is highly expressed in CRC and promotes cancer cell proliferation and migration by stabilizing the Notch1 protein.

Graphical abstract

关键词

USP7 / Notch1 / 泛素化 / 结肠癌

Key words

USP7 / Notch1 / Ubiquitination / Colorectal cancer

泛素⁃蛋白酶体系统（ubiquitin⁃proteasome system，UPS）可调控细胞的增殖、凋亡进程，其调控机制主要与共价连接泛素分子标记靶蛋白，将其被蛋白酶体降解，或改变靶蛋白活性、定位和相互作用。去泛素化酶（deubiquitinating enzymes， DUBs）可特异性移除底物蛋白上的泛素链或单个泛素分子，逆转泛素化修饰，从而精确调控靶蛋白的稳定性、功能活性及亚细胞定位。泛素化与去泛素化之间的动态平衡，是细胞生命活动调控的核心网络之一，其失调与众多癌症的发展进程相关^［1⁃4］。

泛素特异性蛋白酶7（USP7），是DUBs家族的重要成员，可识别并结合特定底物蛋白，从而水解泛素分子与底物蛋白赖氨酸残基之间形成的异肽键^［5，6］。Tang等^［7］研究发现USP7可拮抗FBXW7介导的ZMYND8降解来增强乳腺癌的增殖迁移能力。USP7在表观遗传修饰、DNA损伤修复以及信号通路传导等多个关键生物学过程中发挥重要作用，是多种肿瘤发生、发展的重要因素之一^［8⁃10］。USP7对胃癌、肺癌、乳腺癌等实体瘤的发病进程都有重要的调控作用^{［11⁃13］}，在白血病研究中，USP7被证实能通过去除Notch1蛋白上的泛素链，阻止其被蛋白酶体降解，从而明显稳定Notch1蛋白水平，增强其致癌信号活性^［14］。这一发现揭示了USP7通过去泛素化Notch1促进白血病发生、发展的关键机制，也展现了USP7/Notch1轴作为血液病治疗靶点的巨大潜力。

Notch1信号通路在结肠癌（colorectal cancer，CRC）中常呈现异常激活状态，这与其促进CRC增殖，迁移及化疗药物的抵抗性密切相关^{［15⁃17］}。Liu等^［18］发现Siah1通过去泛素化调控Notch1稳定性来促进NSCLC细胞增殖。目前已明确泛素化修饰是调控Notch1蛋白稳定性和活性的关键环节^{［19，20］}，但USP7是否在实体瘤CRC中拮抗Notch1泛素化降解、维持其稳定性，尚未有明确研究。本研究旨在探究USP7是否通过去泛素化作用调控Notch1蛋白在CRC细胞中的稳定性，并阐明USP7/Notch1轴对CRC细胞增殖和迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

人结肠癌细胞系（RKO）购自博士德生物工程有限公司，CCK8试剂（HY⁃K0301）及蛋白酶抑制剂（HY⁃K0010）购自MCE，胰酶（03⁃050⁃1A）购自BI公司，PAGE凝胶快速制备试剂盒（PG112）购自上海雅酶生物医药科技有限公司，极超敏ECL化学发光即用型底物（AR1191）、BCA试剂盒（AR1189）购自博士德生物工程有限公司，蛋白Marker（26616）购自赛默飞世尔科技公司、Transwell小室24孔购自康宁公司，蛋白裂解液（P0013B）、SDS⁃PAGE蛋白上样缓冲液（P0015L）及结晶紫染色液（C0121）购自碧云天生物技术公司，Notch1和HES⁃1抗体购自正能公司、USP7抗体购买自博士德，GAPDH抗体（100494⁃1⁃AP），Ub 抗体够买自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 数据库在线分析

利用ENCORI数据库（https：//rnasysu.com/encori）分析USP7、Notch1在CRC中的表达量，进一步用GEPIA数据库（http：//gepia.cancer.pku.cn/）分析USP7、Notch1的相关性，人类蛋白质图谱（HPA）数据库（https：//www.proteinatlas.org/）分析人结肠癌组织中USP7、Notch1的蛋白表达量，STRING数据库（https：//cn.string-db.org/）构建USP7、Notch1蛋白互作网络；HDOCK（http：//hdock.phys.hust.edu.cn/）进行蛋白⁃蛋白对接，pymol软件对对接结果进行可视化分析。

1.2.2 细胞培养

将RKO细胞置于37 ℃、5%CO₂的培养箱中，用含10%胎牛血清、1%双抗的MEM培养基培养，待细胞长至约80%~90%密度时传代，进行后续实验。

1.2.3 克隆形成实验检测细胞增殖能力

取对数生长期的细胞，以500/孔细胞进行铺板，贴壁后给药，继续孵育10 d。PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色，拍照计数。

1.2.4 Transwell实验检测细胞侵袭能力

取对数生长期的细胞，用无血清MEM调整密度为1×10⁴/mL。将小室置于24孔板中，下室加入含20%血清的MEM，上室加入200 μL细胞悬液。培养48 h后，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色2 min，PBS洗3次，显微镜下观察计数。

1.2.5 细胞转染实验

将细胞接种于6孔板中，贴壁后加入lipo3000和质粒，转染6 h后换液，待细胞密度为90%左右，收样。

1.2.6 蛋白印迹法（Western blot）检测相关蛋白表达水平

向收集的细胞沉淀中加入RIPA裂解液和PMSF，裂解30 min后，离心取上清，加5×loading buffer混匀，100 ℃加热10 min，取适量蛋白样本进行电泳和转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，4 ℃冰箱一抗孵育过夜（USP7 1∶1 000，Notch1 1∶1 000，Hes⁃1 1∶500，Vimentin 1∶4 000 E⁃cadherin 1∶1 000），TBST洗膜5 min×3，二抗孵育1 h，TBST洗膜5 min×3，凝胶成像显影，ImageJ分析条带灰度值。

1.2.7 免疫共沉淀实验

收获细胞，弃培养基后使用预冷的PBS清洗2次。加入含1×PMSF的RIPA裂解缓冲液，冰上裂解30 min。4 ℃，12 000 r/min离心15 min，收集上清液作为总蛋白样品。将Protein A/G磁珠用裂解缓冲液洗涤3次后，加入USP7（5 μg），Notch1（5 μg），室温孵育1 h。磁力分离去除未结合抗体，保留抗体⁃磁珠复合物，加入200 μL蛋白样品，4 ℃孵育过夜。将样品置于磁力架上放置约1 min，吸去上清液。在磁珠中加入SDS⁃PAGE上样缓冲液，加热处理后置于磁力架上分离，取上清即可用于Western blot检测。

1.8 统计学处理

实验结果采用GaphPad Prism 10软件处理，计量资料以\overline{x}\pm s表示，2组样本采用独立样本t检验，多组样本采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。所有实验独立重复3次。

2 结果

2.1 USP7、Notch1在CRC中高表达

ENCORI数据库检测USP7、Notch1在CRC中的表达，结果显示，与正常组织相比，CRC组织中的USP7、Notch1表达量增多，且差异具有统计学意义（P<0.01，图1A、B）。HPA数据库中CRC与正常结肠组织人USP7、Notch1蛋白的免疫组化结果，结果表明，CRC组织中的USP7、Notch1蛋白水平高于正常结肠组织（图1C、D）。

2.2 USP7与Notch1在CRC中相互作用

GEPIA数据库评估USP7与Notch1的相关性，结果显示，USP7与Notch1两个基因之间在CRC中的Spearman相关系数为0.56，说明二者表达明显相关（图2A）。STRING数据库构建蛋白互作网络，表明USP7蛋白与Notch1蛋白有相互作用关系（图2B）。HDOCK来评估USP7与Notch1之间的相互作用，结果显示Docking Score=-284.15；Confidence Score=0.936 0，Pymol软件将对接结果进行可视化分析，证实USP7与Notch1具有很好的结合能力（图2C）。

2.3 免疫共沉淀（CO⁃IP）验证USP7与Notch1相互作用

CO⁃IP实验结果显示，Input组及Notch1组可检测到USP7蛋白；Input组及USP7组可检测到Notch1蛋白（图3A、B）。

2.4 USP7 影响Notch1的蛋白稳定性

构建过表达USP7的RKO稳转细胞系，WB检测USP7、Notch1、Hes⁃1的表达情况，结果显示在过表达USP7后，Notch1、Hes⁃1的蛋白水平增高（图4A）。蛋白免疫共沉淀检测Notch1的泛素化水平，结果发现过表达USP7后，Notch1的泛素化水平降低（图4B）。

2.5 USP7/Notch1影响结肠癌细胞增殖能力

构建过表达USP7的RKO稳转细胞系，同时在过表达USP7基础上敲低Notch1（图5A），CCK8结果显示，与对照组相比，过表达USP7组，细胞活力增强（P<0.01），敲低Notch1后，细胞活力下降（P<0.05）（图5B）；克隆形成结果显示，与对照组相比，过表达USP7组，细胞克隆数量增多（P<0.05），敲低Notch1后细胞克隆数量减少（P<0.05），见表1。

2.6 USP7/Notch1影响结肠癌细胞迁移能力

划痕实验结果显示，与对照组相比，过表达USP7组细胞迁移率增加（P<0.05），敲低Notch1后细胞迁移率降低（P<0.05），见表2；Transwell实验结果显示，与对照组相比，过表达USP7组，细胞迁移数增加，敲低Notch1后细胞迁移数减少（图6A、B），（P<0.05）。WB检测Vimentin、E⁃cadherin的表达，结果表明过表达USP7后Vimentin表达升高、E⁃cadherin表达降低，敲低Notch1后Vimentin表达降低、E⁃cadherin表达升高（图6C）。

3 讨论

研究表明去泛素化酶USP7可通过其TRAF结构域结合KRAS，去除KRAS第147位赖氨酸（K147）上连接的K48型泛素链来稳定KRAS蛋白并促进非小细胞肺癌的进程^［21］。这发现证实去泛素化酶在调控关键蛋白稳定性的重要作用，去泛素化酶对蛋白稳定性的调控具有广谱性^［22］。除KRAS外，Notch1作为另一关键致癌因子，其蛋白活性也会受到泛素化与去泛素化的动态调控，其异常激活与多种肿瘤发生密切相关。例如：果糖⁃1，6⁃二磷酸酶（FBP1）可通过促进Notch1胞内结构域（NICD）的泛素化来抑制非小细胞肺癌（NSCLC）干细胞特性^［23］；lncRNA BREA2通过破坏E3泛素连接酶WWP2介导的Notch1泛素化促进乳腺癌转移^［24］。这些都揭示了去泛素化酶对Notch1关键蛋白稳定性的影响，进一步说明靶向泛素化调控在癌症治疗中的重要作用。

本研究提出去泛素化酶USP7可通过调控Notch1蛋白的泛素化水平来影响CRC的增殖和迁移，本研究先通过生物信息学验证USP7与Notch1在CRC组织中的表达明显高于正常组织，且两者呈强相关性，提示两者在CRC中存在潜在协同作用。后通过HDOCK进行蛋白⁃蛋白对接，发现USP7与Notch1具有强结合力，免疫共沉淀实验进一步确认两蛋白存在互作。这一结果与前期报道中USP7调控KRAS等癌蛋白的泛素化水平相似，并在CRC证实USP7通过直接结合Notch1调控其泛素化稳定性，为靶向USP7⁃Notch1轴治疗CRC提供实验依据。为深入探究USP7与Notch1之间的相互作用及协调作用，本研究构建USP7过表达的稳转细胞系，结果表明，过表达USP7后，Notch1及下游分子Hes⁃1蛋白水平升高，为进一步验证USP7是否会通过调控泛素化修饰影响Notch1的稳定性，进行了免疫共沉淀实验，结果发现USP7过表达明显降低Notch1的泛素化水平，表明USP7通过去泛素化作用影响Notch1蛋白稳定性。USP7与Notch1在肺癌、乳腺癌、卵巢癌中被报导有促癌作用^{［25⁃27］}，本研究中，在过表达USP7稳转细胞系基础上敲低Notch1，结果表明过表达USP7后细胞的增殖，迁移能力都升高，敲低Notch1后上述作用被逆转，说明USP7通过影响Notch1的稳定性影响CRC的生物学功能。

综上所述，本研究不仅揭示了去泛素化酶USP7通过降低Notch1泛素化水平增强其蛋白稳定性，进而影响CRC增殖与迁移的核心机制，更确立了USP7/Notch1/Hes⁃1轴在实体瘤CRC恶性进程中的关键作用。这些发现为靶向泛素化过程治疗实体瘤提供了新方向。本研究存也在一定的局限性。首先，虽然通过体外实验验证了USP7/Notch1轴对CRC的促癌作用，但缺乏体内动物模型验证；其次，虽明确USP7调控Notch1泛素化水平，但未明确其作用的具体泛素化位点及是否受其他E3连接酶等调控。因此，未来的研究应进一步探索USP7/Notch1轴促癌的具体机制，通过体内实验评估该通路在体内的致癌作用，并通过质谱技术鉴定关键泛素化位点及协同调控的E3酶，为开发精准靶向治疗策略奠定基础。

作者贡献度说明：

周雅娟：参与文章撰写和实验；刘晓东、尹茂续、张子璇、刘新辰：参与实验和文献查找、统计学处理；武艳： 参与论文指导；杨丽娟：参与实验设计和实验指导。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

参考文献

[1] Liu FF， Chen JY， Li K， et al. Ubiquitination and deubiquitination in cancer： From mechanisms to novel therapeutic approaches［J］.Mol Cancer， 2024， 23（1）： 148.

[2] Park J， Cho J， Song EJ. Ubiquitin⁃proteasome system （UPS） as a target for anticancer treatment［J］. Arch Pharm Res， 2020， 43（11）： 1144⁃1161.

[3] Clague Michael J， Sylvie URBÉ， David Komander. Breaking the chains： Deubiquitylating enzyme specificity begets function［J］.Nat Rev Mol Cell Biol， 2019， 20（6）： 338⁃352.

[4] Han DW， Wang LJ， Shan J， et al. The ubiquitin⁃proteasome system in breast cancer［J］.Trends Mol Med， 2023， 29（8）： 599⁃621.

[5] Saha G， Roy S， Basu M， et al. USP7 ⁃ a crucial regulator of cancer hallmarks［J］. Biochim Biophys Acta Rev Cancer， 2023， 1878（3）： 188903.

[6] Park HB， Baek KH. Current and future directions of USP7 interactome in cancer study［J］. Biochim Biophys Acta Rev Cancer， 2023， 1878（6）： 188992.

[7] Tang KX， Yin TT， Deng B， et al. USP7 deubiquitinates epigenetic reader ZMYND8 to promote breast cancer cell migration and invasion［J］. J Biol Chem， 2024， 300（9）： 107672.

[8] Cheron J， Beccari L， Hagué P， et al. USP7/Maged1⁃mediated H2A monoubiquitination in the paraventricular thalamus： An epigenetic mechanism involved in cocaine use disorder［J］. Nat Commun， 2023， 14（1）： 8481.

[9] Saha G， Roy S， Basu M， et al. USP7 ⁃ a crucial regulator of cancer hallmarks［J］.Biochim Biophys Acta Rev Cancer， 2023， 1878（3）： 188903.

[10] Liu JW， Zhou TT， Dong X， et al. De⁃ubiquitination of SAMHD1 by USP7 promotes DNA damage repair to overcome oncogenic stress and affect chemotherapy sensitivity［J］. Oncogene， 2023， 42（22）： 1843⁃1856.

[11] Guan XQ， Wang YC， Yu WK， et al. Blocking ubiquitin⁃specific protease 7 induces ferroptosis in gastric cancer via targeting stearoyl⁃CoA desaturase［J］. Adv Sci， 2024， 11（18）： e2307899.

[12] He YM， Jiang SY， Zhong YY， et al. USP7 promotes non⁃small⁃cell lung cancer cell glycolysis and survival by stabilizing and activating c⁃Abl［J］. Clin Transl Med， 2023， 13（12）： e1509.

[13] Yi JJ， Li H， Chu B， et al. Inhibition of USP7 induces p53⁃independent tumor growth suppression in triple⁃negative breast cancers by destabilizing FOXM1［J］.Cell Death Differ， 2023， 30（7）： 1799⁃1810.

[14] Shan HZ， Li XY， Xiao XH， et al. USP7 deubiquitinates and stabilizes NOTCH1 in T⁃cell acute lymphoblastic leukemia［J］. Signal Transduct Target Ther， 2018， 3： 29.

[15] Png CW， Weerasooriya M， Li H， et al. DUSP6 regulates Notch1 signalling in colorectal cancer［J］. Nat Commun， 2024， 15（1）： 10087.

[16] Yi LB， Zhang ZY， Zhou WJ， et al. BRD4 Degradation enhanced glioma sensitivity to temozolomide by regulating Notch1 via Glu⁃modified GSH⁃responsive nanoparticles［J］. Adv Sci， 2024， 11（48）： e2409753.

[17] Abby E， Dentro SC， Hall MWJ， et al. Notch1 mutations drive clonal expansion in normal esophageal epithelium but impair tumor growth［J］.Nat Genet， 2023， 55（2）： 232⁃245.

[18] Liu Y， Li QL， Geng L， et al. Siah1 promotes the proliferation of NSCLC cells through ubiquitinating and stabilizing Notch1［J］. Exp Cell Res， 2022， 419（1）： 113305.

[19] Luo ZY， Mu LL， Zheng Y， et al. NUMB enhances Notch signaling by repressing ubiquitination of NOTCH1 intracellular domain［J］. J Mol Cell Biol， 2020， 12（5）： 345⁃358.

[20] Guo YN， Chi XW， Qu SY， et al. E3 ubiquitin⁃protein ligase 2 inhibits cell proliferation， migration， and invasion of non⁃small cell lung cancer through ubiquitination of Notch1［J］. Acta Histochem， 2022，124（1）：151818.

[21] Huang B， Cao D， Yuan X， et al. USP7 deubiquitinates KRAS and promotes non⁃small cell lung cancer［J］. Cell Rep， 2024， 43（11）： 114917.

[22] Dewson G， Eichhorn Pieter JA， Komander D. Deubiquitinases in cancer［J］.Nat Rev Cancer， 2023， 23（12）： 842⁃862.

[23] He TY， Wang YY， Lv W， et al. FBP1 inhibits NSCLC stemness by promoting ubiquitination of Notch1 intracellular domain and accelerating degradation［J］. Cell Mol Life Sci， 2024， 81（1）： 87.

[24] Zhang Z， Lu YX， Liu FZ， et al. lncRNA BREA2 promotes metastasis by disrupting the WWP2⁃mediated ubiquitination of Notch1［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2023， 120（8）： e2206694120.

[25] Zhi XF， Jiang S， Zhang JX， et al. Ubiquitin⁃specific peptidase 24 accelerates aerobic glycolysis and tumor progression in gastric carcinoma through stabilizing PLK1 to activate NOTCH1［J］. Cancer Sci， 2023，114（8）：3087⁃3100.

[26] Sun YJ， Zhang Q， Cao SJ， et al. Tetrahydrocurcumin targets TRIP13 inhibiting the interaction of TRIP13/USP7/c⁃FLIP to mediate c⁃FLIP ubiquitination in triple⁃negative breast cancer［J］. J Adv Res， 2025，75：591⁃605.

[27] Yadong Y， Li YJ， Ma BY， et al. Mitochondrial⁃derived peptide MOTS⁃c suppresses ovarian cancer progression by attenuating USP7⁃mediated LARS1 deubiquitination［J］.Adv Sci， 2024， 11（43）： e2405620.

基金资助

国家自然科学基金(81903102)

山东省自然科学基金(ZR2023QH153)

山东省中医药科技发展计划项目(2019⁃0517)