液体活检中CTC及其簇的精准检测与分离技术研究进展

Advances in precise detection and isolation techniques for CTC and CTC cluster in liquid biopsy

摘要

循环肿瘤细胞（circulating tumor cell， CTC）及其簇（CTC簇）在肿瘤远处转移过程中发挥关键作用，然而其在外周血中数量稀少、结构脆弱且表型异质，给液体活检的高效检测带来极大挑战。高效且结构保真的分离富集策略，已成为构建实用化液体活检体系的技术瓶颈。近年来，研究者围绕CTC及CTC簇的表型多样性与结构完整性保护，提出了多种分离路径，包括基于物理性质、生物标志物识别及多技术融合策略，如免疫磁珠、密度梯度、微流控芯片与功能化纳米平台等。本文系统梳理了当前主流分离技术的发展脉络，重点比较各类方法在捕获效率、结构保护、处理通量与临床适应性等方面的性能差异，尤其关注其在识别低表达异质性亚群与保留CTC簇空间结构方面的实际表现。最后，结合新兴材料学与智能释放机制的应用进展，探讨多策略融合在功能研究与临床转化中的挑战与机遇，旨在为构建兼具高灵敏性、高特异性且实用的CTC及CTC簇检测平台提供系统化技术参考与理论支撑。

Abstract

Circulating tumor cell （CTC） and their clustered structure （CTC cluster） play a pivotal role in the process of distant tumor metastasis. However， they are extremely low abundance in peripheral blood， structural fragility， and phenotypic heterogeneity pose significant challenges for efficient detection via liquid biopsy. Achieving high⁃efficiency and structure⁃preserving enrichment of CTC and CTC cluster has become a critical technical bottleneck in the development of clinically applicable liquid biopsy systems. In recent years， various separation strategies have been proposed to address the phenotypic diversity and structural integrity of CTC and CTC cluster， including approaches based on physical properties， biomarker recognition， and integrated multi⁃modal techniques such as immunomagnetic beads， density gradient centrifugation， microfluidic chips， and functionalized nanoplatforms. This review systematically outlines the developmental trajectory of current mainstream enrichment technologies， with a focus on comparing their performance in terms of capture efficiency， structural preservation， throughput capacity， and clinical applicability. Special attention is given to their effectiveness in identifying low⁃expression heterogeneous subpopulations and preserving the intact architecture of CTC clusters. Furthermore， the review explores recent advancements involving novel materials and intelligent release mechanisms， highlighting the challenges and opportunities in functional research and clinical translation. The aim is to provide a comprehensive technical reference and theoretical foundation for building sensitive， specific， and practically applicable platforms for the detection of CTC and CTC cluster.

Graphical abstract

关键词

循环肿瘤细胞（CTC） / CTC簇 / 分离富集 / 细胞异质性识别 / 结构完整性保留

Key words

Circulating tumor cell （CTC） / CTC cluster / Separation and enrichment / Cellular heterogeneity recognition / Structural integrity preservation

癌症转移导致约90%癌症死亡，且常在临床症状显现前发生，因此早期识别转移风险至关重要^［1］。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells， CTC）作为从原发灶脱落进入血液循环的稀有细胞（1个/10⁶~10⁷白细胞），是肿瘤转移的“种子”，可为肿瘤早筛、进展监测、疗效评估和个体化治疗提供关键信息^［2，3］。然而，CTC在外周血中的极低丰度，使得高效富集与分离成为临床应用的核心挑战。

当前主流CTC富集方法是免疫亲和法（如FDA批准的CellSearch系统），主要依赖上皮细胞黏附分子（EpCAM）对CTC进行识别，然而EpCAM在上皮间质转化（EMT）过程中明显下调，导致这类依赖EpCAM的分离方法遗漏间充质CTC捕获效率降低，同时大量的白细胞也影响了捕获纯度^［4，5］。为突破这一瓶颈，研究者发展了多靶标联合识别策略（如结合EGFR^［6］、HER2^［7］、CD44^［8］、CD146^［9］等标志物），并引入新型抗吸附材料（如两性离子聚合物^［10］、各类细胞膜仿生涂层^{［11，12］}），以提升富集的特异性与纯度。

值得注意的是，除单细胞形式外，部分CTC以由两个及以上细胞组成的簇状结构（CTC簇）存在，可为同源肿瘤细胞簇或与白细胞、成纤维细胞、血小板等形成的异源簇^［13］。CTC簇在循环中具有更高的存活率和远端定植能力，其转移效率可达单个CTC的20~100倍^［14］，并与更差的预后明显相关（包括更短的总生存期和无进展生存期）^［15］。多项临床研究表明，CTC簇的大小及循环浓度与转移风险密切相关^{［16，17］}。然而，CTC簇结构脆弱且对机械力高度敏感，传统分离方法（如离心、过滤）易造成解离，难以获得结构完整的原位样本，限制了其功能研究与临床应用。

当前CTC及CTC簇的检测仍面临3大核心技术难题：一是异质性CTC识别能力不足，如表型转换（如上皮⁃间质转化）导致的标志物表达变化，限制了单一元件识别效率；二是结构保真性差，尤其CTC簇在高剪切力环境或样本处理过程中易碎裂，影响其真实生物学功能的评估；三是分选效率与临床通量之间的矛盾，多数高精度方法捕获速率较低，难以兼顾灵敏度与实际应用需要。

基于此，本文系统梳理CTC及CTC簇的富集技术（基于物理特性、生物标志物识别及融合策略），分析其在异质性识别、簇结构保护、分选效率及临床适配性方面的优劣，旨在为构建灵敏、结构保真且临床可行性的检测平台提供依据，助力肿瘤早期诊断与转移风险评估。

1 CTC的分离富集

1.1 基于物理特性的分离方法

基于物理特性的分离策略因其高通量、成本较低及操作简便等优势，已成为CTC富集研究的重要方向。多数CTC在形态学和生物物理参数上与外周血细胞存在明显差异：其直径通常大于红细胞和多数白细胞，密度低于红细胞和白细胞，单位膜电容普遍高于白细胞，细胞质电导率相对较低^［2，18］。基于这些特性，可采用膜过滤、密度梯度离心、介电泳分离等方法实现物理富集。然而，此类方法在保持细胞活性、避免形态破坏以及捕获小尺寸CTC或CTC簇方面仍存在局限性，已有综述对上述技术原理与应用进展进行了系统总结^{［19，20］}。在此基础上，微纳制造技术的快速发展推动了基于CTC物理特性的集成化微流控平台成为研究热点。这类平台可整合多种物理机制，在提高通量与分离精度的同时，更好地保留细胞活性^［21］。为便于比较，本文归纳了几种代表性的多物理场耦合富集技术及其性能特点（表1）。

尽管基于物理特性的CTC分离方法具有成本低、处理快、细胞活性保存好等优势，但其临床转化仍面临标准化与适应性的双重挑战。一方面，该类方法对样本状态、微流控通道尺寸及操作条件高度敏感，导致操作难标准化，结果稳定性不足；另一方面，现有技术多处于实验室原型阶段，缺乏成熟商品化体系与严格质控，难以满足临床对高通量自动化检测的需求。因此，该类方法目前更适合作为预富集或辅助筛查工具。

1.2 基于生物特性的分离方法

基于CTC独特生物学特性的分离策略，尤其是利用其细胞表面标志物的特异性亲和作用，已成为当前研究的主流方向。本节将重点评述3种主要的基于生物性质的分离策略：基于抗体的特异性识别与分离、基于适配体的CTC富集技术以及新兴的非抗体配体识别策略。并对这3种方法的关键参数、优缺点及应用前景进行了归纳与比较（表2）。

1.2.1 抗体介导的特异性识别与分离策略

相较于物理分离，基于分子识别的免疫富集策略在提升CTC捕获特异性方面优势明显。根据富集靶标的差异，免疫富集策略可分为阴性富集（去除CD45⁺白细胞）与阳性富集（靶向EpCAM等肿瘤抗原）。阴性富集适用于EMT表型明显的CTC亚群，但因缺乏正向识别能力，常伴随较高背景污染^{［27，28］}。阳性富集捕获效率与纯度较好，但EpCAM表达异质性及EMT导致其存在识别盲区^{［29，30］}。

为拓展识别谱系、提高覆盖率，多抗体联合识别策略逐步发展（N⁃钙黏蛋白^［31］、HER2^［7］、EGFR^［6］）。例如，EpCAM与前列腺特异性膜抗原（PSMA）抗体联合后，捕获效率由38%提升至85%^［32］； EpCAM与去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）抗体联合实现了对肝癌患者CTC的高灵敏检测^［33］。类似的双抗体组合还包括EpCAM与CD146^［9］、波形蛋白^［34］、N⁃钙黏蛋白^［31］等，用于覆盖不同亚群CTC。Li等^［35］开发了一种基于三金属AuIrPt多面体纳米酶的电化学细胞传感器，通过三靶点协同识别策略实现CTCs的高精度检测。该策略利用EpCAM适配体修饰的纳米酶作为信号标签，抗MUC1抗体功能化磁珠进行捕获，以及抗EGFR抗体修饰电极进行固定。该纳米酶的多重催化活性（SOD/POD/CAT）明显放大信号，可检测5~1×10⁶ cells/mL的浓度范围，检出限低至2 cells/mL；独特的三靶点“与”逻辑门机制（仅当三者共同表达时触发电流）明显提高检测特异性并消除假阳性；全血样本中回收率>90%，15 d后信号稳定性达87.1%（图1A）。除传统抗体外，Salanti课题组提出的重组疟疾蛋白VAR2CSA（rVAR2）作为新型识别分子，可结合肿瘤细胞表面普遍表达的胎盘型硫酸软骨素（ofCS），不依赖于表型状态，具有良好的跨癌种兼容性和EMT适应能力^［36］。本课题组与其合作建立了rVAR2与EpCAM的双靶标富集体系，在维持高纯度的同时，明显提高了对间质型CTC和多表型CTC亚群的覆盖效率^［37］（图1B）。

在识别机制之外，微流控芯片的几何结构设计亦对免疫富集效率起到关键作用。纳米多孔微柱阵列通过调控芯片上的流体速度（即流体动力阻力），在捕获室内形成细胞黏附梯度，使不同EpCAM表达水平的单个CTC能够在提供平衡阻力的相应空间位置被特异性免疫捕获，实现了不同EpCAM表达水平CTC的特异性捕获与无标记分析，解决了低EpCAM CTCs漏检难题（图1C）^［38］。Xu等^［39］将免疫标记、磁捕获、鞘流聚焦和磁分离集成于单一芯片，以镧系元素标记的ASGPR抗体和EpCAM抗体修饰的磁珠作为信号探针和捕获探针对靶细胞进行高效标记，并在线结合单细胞电感耦合等离子体质谱（SC⁃ICP⁃MS）对肝癌细胞表面特定生物标志物（ASGPR）进行绝对定量分析（图1D）。一体化芯片设计简化操作流程，避免了样本损失与污染。然而，此类芯片在优化捕获效率的同时，对微通道精度和抗体涂层均匀性的依赖明显提高，对芯片制造工艺提出严苛要求。多数平台仍停留在科研实验阶段，尚未形成标准化、模块化的批量制备体系，在跨平台、多中心临床应用中的推广能力有限。

尽管多抗体联合策略明显拓展了CTC检测的靶标覆盖范围，其临床适配性仍面临多重挑战：首先，靶标存在癌种依赖性及个体间差异，易导致特定患者亚群出现检测盲区；其次，多抗体共修饰可能增加非特异性吸附，降低信噪比；此外，缺乏标准化工艺及自动化操作平台，不利于规模化生产与临床推广。上述因素共同制约了该策略在不同临床场景下的通用性与可及性。

1.2.2 基于适配体的CTC富集

适配体是通过指数富集配体系统进化技术（SELEX）筛选的单链DNA/RNA，能以高度特异性和亲和力识别特定靶标。相较于传统抗体（直径12~15 nm），适配体体积更小（约2~3 nm），在识别空间位阻较大的细胞表位及CTC异质亚群方面具有天然优势^［50］。此外，适配体可大规模化学合成、成本低、结构易于修饰，结合亲和力可与抗体媲美，在CTC分离中展现出重要价值^［51］。

早期研究将sgc8适配体固定于PDMS微通道表面，特异性识别酪氨酸蛋白激酶7（PTK7）高表达的肿瘤细胞，验证了适配体在微尺度环境下的识别能力^［52］。随后，多适配体协同识别策略逐步发展。Zhang等^［53］构建了双适配体（EpCAM和PTK7）功能化的螺旋微流控系统，实现CTC的高效富集。Wang等^［40］则开发了一种结合双适配体识别与CRISPR/Cas12a响应释放的三维DNA网络系统，通过EpCAM与N⁃钙黏蛋白适配体协同构建空间包裹结构，提升了捕获效率与细胞结构保真性（图2A）。该策略引入CRISPR/Cas12a酶系统，通过特定双链DNA输入触发Cas12a活性，对网络中单链连接区进行精准切割，诱导结构解构，实现温和释放CTC并保持其活性。然而，该平台构建流程相对复杂，对输入DNA高度依赖，CRISPR系统在复杂临床样本中的生物安全性与非特异激活风险仍需进一步验证。

随着适配体修饰策略的不断优化，其结构构型与表面排列形式对富集性能的影响日益受到关注。受板状珊瑚高效捕食机制的启发，Jia等^［41］将多价适配体偶联到肿瘤细胞膜包被的磁性氧化石墨烯上，形成板状珊瑚CTCs纳米捕获探针（MNPA⁃TCMMGO）。多价适配体的高亲和力与肿瘤细胞膜的自身靶向能力和横向流动性相结合，提高了生物样本中癌细胞的识别和捕获能力，捕获后细胞存活率>90%，可直接再培养并增殖，适用于下游分析（图2B）。然而，尽管多价结构在缓解空间位阻、增强结合能力方面具有明显优势，其在全血环境中仍面临核酸酶降解和生物相容性等稳定性挑战^［54］。

为提升适配体在生理条件下的稳定性，研究者将其与DNA框架结构相结合构建刚性识别平台。TDF（DNA四面体）因其空间结构稳定、构型可控，能够有效提升适配体在复杂体系中的稳定性与结合特异性^［55］。Chen等^［42］开发的TEA系列多价适配体（TEA_n， n=1~3）融合TDF结构与识别序列，在模拟血清环境中展现出更优的解离常数与抗酶解性能，明显提高了CTC捕获效率与抗干扰能力，可用于动态监测患者的治疗响应过程（图2C）。

与此同时，表面抗污染修饰策略也成为提高CTC选择性富集效果的重要方向。研究者在泡沫镍基底上依次接枝聚乙二醇（PEG）与特异性适配体，构建了三维互连多孔结构的Ni@PDA⁃PEG⁃Apt晶片，实现对CTC的高效捕获与温和释放。PEG的引入明显降低了白细胞非特异吸附（减少约3倍），同时提供更多适配体结合位点，有效提升了捕获效率^［43］。此外，两性离子聚合物如磺基甜菜碱与羧基甜菜碱具有超亲水性，可在材料表面形成稳定的水合层，抑制蛋白与细胞吸附，被广泛用于生物界面的抗污染改性^［56］。Sun等^［10］基于壳聚糖纳米纤维构建了仿细胞外基质的功能性底物，并在其表面接枝聚（甲基丙烯酸羧基甜菜碱）（pCBMA）刷层，同时偶联多价适配体，用于CTC的高选择性捕获。在加标血样中，CTC捕获效率达54%~70%，而非特异性捕获的白细胞比例低于0.3%。

除合成材料外，仿生界面的引入也为高特异性CTC富集提供了新思路，各类细胞膜仿生涂层用以构建低吸附背景分离界面^{［44，57］}。Shen等^［44］开发的抗体工程化红细胞膜（RBC⁃Ab）微流控系统，将EpCAM抗体功能化的红细胞膜修饰在DLD三角形微柱阵列上，红细胞微流控界面的横向流动性、柔韧性和抗吸附特性可实现高效（达96.5%），高活性（96.1%）和高纯度（白细胞残留降低至4.2对数级）CTCs捕获，展现出仿生抗污策略在复杂血样中的巨大潜力。

适配体作为新一代靶向识别分子，凭借其小尺寸、高亲和力、结构可编程性及合成便利性，在CTC富集中前景广阔。相较抗体，适配体更易实现多价化组装、空间构型控制，更易与仿生界面材料协同修饰，提高异质型CTC的识别效率与富集特异性。然而，适配体在临床应用仍面临核酸酶降解与非特异吸附等挑战。未来需增强其在复杂环境中的稳定性、推进界面标准化改造以及识别机制的多模态融合（如联合抗体、rVAR2或糖类配体），以构建更具鲁棒性与广谱适应性的液体活检平台。

1.2.3 非抗体类配体的多样化识别策略

除抗体和适配体外，一些天然或工程化小分子配体（如叶酸FA、透明质酸HA、单宁酸TA等）通过靶向肿瘤细胞膜受体，正成为CTC富集的重要补充。其分子量小、稳定性高、修饰灵活，利于微流控集成实现高效低背景捕获。FA靶向叶酸受体富集CTC^［46］，HA与CD44结合提升选择性^［45］，TA通过与细胞膜糖蛋白的多点作用增强结合强度，同时其对白细胞的低亲和力有助于减少非特异性吸附，从而提升捕获效率与纯度^［47］。

在此基础上，一些新兴识别机制和细胞仿生策略为非抗体识别提供了新的方向。Lao等^［48］基于肿瘤细胞糖代谢增强的特征，提出了一种“标记⁃捕获⁃释放”一体化策略。通过代谢标记在CTC表面引入叠氮基团，利用二苯基环辛烷（DBCO）修饰界面实现无铜点击化学反应捕获，再通过还原二硫键温和释放，保持细胞活性，兼容下游分析（图3A）。Sun等^［49］构建了肿瘤/白细胞杂交膜（HM）包覆的磁性Fe₃O₄纳米颗粒（Fe₃O₄⁃ICG@HM），实现对CTC的特异识别与选择性富集（图3B）。其中，肿瘤细胞膜赋予纳米粒子同源黏附能力，而白细胞膜则有效抑制非特异性吸附，从而提高整体捕获选择性与纯度。该平台不依赖任何抗体或适配体，适用于EMT状态下传统上皮标志物缺失的CTC亚群识别。进一步地，研究者将其与具有808 nm光子带隙的微流控芯片相结合，通过近红外激光激活光热/光动力协同效应，实现CTC原位捕获后的精准灭活，展示出液体活检与靶向治疗融合的新范式。

此类策略在靶点多样性和异质性CTC识别中优势明显，特别适用于识别传统策略难以覆盖的CTC异质性亚群。然而，此类策略仍面临配体亲和力差异、全血环境稳定性不足等挑战。未来需开发高亲和力配体、精准匹配肿瘤异质性靶点，并协同优化微流控界面，以推动临床转化。

2 CTC簇的精准分离策略研究进展

2.1 基于传统平台的延伸富集方法

CTC簇是由2~45个肿瘤细胞组成的聚集体，可进一步融合血小板、白细胞、成纤维细胞（CAF）等形成异源簇^［58］。尽管其在总CTC数量中仅占约2%~3%，但转移潜力明显高于单个CTC，并与不良预后密切相关^［59］。多项研究显示，CTC簇阳性患者的无进展生存期（PFS）明显短于阴性患者，提示其作为液体活检关键靶标在临床分期、预后评估和治疗决策中具有重要价值^［15］。

在检测技术方面，由于CTC簇在物理特性和表型上与单个CTC相近，部分现有CTC富集平台（如基于免疫亲和、尺寸过滤或密度梯度的系统）无需额外改造即可同时捕获CTC簇。这类基于传统平台的延伸富集方法在操作便捷性与检测通量上具有明显优势，但在捕获异质性簇、保持簇结构完整性及支持后续功能学分析方面仍存在不足，本文对其进行了归纳总结（表3）。

2.2 基于微流控系统的富集系统

微流控技术凭借低剪切力、高通量、结构可设计性，在维持CTC簇的结构完整性与活性方面显示出独特优势。近年来，研究者围绕CTC簇的结构特性和生物行为，开发出多种具有针对性的微流控平台。按其分离机制和功能特征，当前主要微流控策略可归纳为3类：结构保护型微流控装置；可控释放型仿生芯片系统；异质性识别与多模态耦合平台。

结构保护型微流控装置主要基于流体动力学原理与几何结构优化，通过降低流速、调整通道形态等方式减少剪切力，从而避免CTC簇在分离过程中解离并保持其活性。作为最早专为CTC簇设计的平台，Cluster⁃Chip利用3个等距三角柱构建渐缩通道，依靠细胞间连接阻力捕获≥4细胞簇，捕获效率可达99%^［67］（图4A）。该平台在亚生理流速下运行，能够有效保留簇结构，但对<4细胞的小型簇识别能力有限。为解决小簇检测不足的问题，Cluster⁃Wells引入倾斜侧壁微孔设计，在维持高筛选通量（>25 mL/h）的同时，使双联体捕获灵敏度提升2倍，且背景污染率明显降低（白细胞<0.06%，血小板<0.025%），有效减少了下游分析的干扰（图4B）^［68］，显示出良好的低背景优势。在此基础上，为同时捕获不同形态的簇，两级DLD芯片引入“双阶段”位移结构：第一阶段按尺寸分离大型簇，第二阶段利用非对称性结构识别小型非球形簇，仅需数秒停留即可完成无标记分选，大簇回收率达99%，细胞活力超过87%^［69］。除芯片结构优化外，部分研究聚焦于传统过滤方法的改良，例如改良ScreenCell®过滤器先用15 μm孔径滤膜捕获CTC簇，再用6.5~8 μm滤膜捕获单个CTC，实现双重复合捕获，且捕获细胞可直接进入下游分析^［70］。另一种策略则通过力学环境的精细控制来降低损伤，如微流控分离（MICC）平台利用陷阱室动态力平衡设计，在低流速（25 μL/min）和低压（<170 Pa）条件下实现无标记捕获，CTC簇存活率可达95%^［71］。总体而言，该类平台在结构保真性方面具有明显优势，尤其适用于高活性簇的快速筛选与形态学研究，但在异质性或混合簇的识别方面仍存在局限。

可控释放型仿生芯片技术兼顾捕获与无损释放，支持后续功能分析。典型代表为抗EpCAM抗体功能化的三维明胶支架微芯片，其内部通道结构可诱导CTC或CTC簇发生微涡旋迁移，同时提供充足的结合位点实现高效捕获，捕获5~8细胞簇效率达97.5%。支架表面包覆的明胶材料可在37 ℃条件下快速溶解，使捕获细胞在无机械扰动条件下温和释放，细胞活性明显优于传统离心或剪切释放（图4C）^［72］。为了便于下游分析，需从捕获界面释放CTC或CTC簇，Park等^［73］使用配体交换反应，将带有EpCAM抗体的金纳米颗粒涂层修饰于改良人字形芯片（HB⁃chip）上，特异性捕获CTC；之后加入谷胱甘肽（GSH：含游离巯基的天然三肽），与金纳米颗粒发生硫醇交换反应，温和释放CTC，释放后细胞存活率>78%。该系统为CTC簇的体外培养、单细胞组学及功能验证提供了新平台，但其适用性仍依赖于靶抗原的表达情况，对于表型转化簇识别能力有限。

针对复杂异质性CTC簇的精准识别，研究者们逐步开发出结合多标志物识别与多模态分离策略的平台，以应对不同表型簇的检测挑战。早期的尝试包括CTC⁃血小板簇富集平台，该方法将确定性侧向位移（DLD）与HB⁃Chip串联，并靶向血小板标志物CD41，从而实现对携带血小板的CTC簇的特异捕获。在肺癌、乳腺癌与黑色素瘤患者中的检出率分别达到66%、60%和83%，显示出良好的跨癌种适应性；然而，该平台的白细胞背景污染仍较高（~10⁵/mL），影响了下游分析的准确性^［74］（图4D）。在此基础上，为实现非接触式、低损伤分离，研究者引入声学微流控系统，利用超声驻波场与流体阻力的协同作用，根据细胞大小、密度及可压缩性进行分离。在转移性前列腺癌患者样本中，该方法的CTC/CTC簇阳性检出率明显高于CellSearch，体现了更高的灵敏度与发现能力^［75］。进一步的进展来自Krol等^［76］提出的SBS⁃CTC纳米钛氧化物载玻片，该平台基于整合素依赖的附着机制，在无剪切力条件下实现CTC及CTC簇的固相富集，并与CellSeed自动化系统结合，实现样本的均匀处理、高效成像及形态学分析，尤其适用于结构敏感型簇的长期保存与回溯研究（图4E）。

总体来看，异质性识别与多模态耦合平台明显提升了CTC簇的检测维度与处理柔性，拓展了跨表型和跨癌种的适应性。然而，该类平台在背景细胞去除效率、处理速率及样本通量方面仍需进一步优化，以实现临床检测中灵敏度、特异性与高通量的平衡。

2.3 CTC簇与多组学分析以及AI技术的结合

CTC簇在血液中存活并形成转移灶的效率远高于单个CTC，其转移潜力可达后者的20~100倍^［14］。因此，解析CTC簇的形成机制、分子特征及临床意义，对于理解肿瘤播散和开发抗转移策略至关重要。传统的单一组学分析往往难以全面揭示其复杂性，而多组学与人工智能（AI）的结合正逐渐成为突破的关键。

Aceto等^［59］通过对乳腺癌与前列腺癌患者以及小鼠模型的CTC簇开展多组学研究，逐步揭示了其高转移潜能的分子基础。单细胞RNA测序显示，斑珠蛋白在CTC簇中高表达，维持细胞间黏附并促进转移，其上调与患者不良预后密切相关。随后，基于DNA甲基化测序与转录组联合分析，研究发现CTC簇在干性与增殖相关转录因子（如OCT4、SOX2、NANOG）的结合位点呈低甲基化状态，类似于胚胎干细胞，并与转移能力增强相关。重要的是，该表观遗传特征可被药物逆转：Na⁺/K⁺泵抑制剂（如地高辛、乌本苷）能够解离CTC簇并抑制转移，为抗转移治疗提供了新的思路^［77］。

在此基础上，部分研究引入了AI技术来深化解析。Taftaf等^［78］发现ICAM1在三阴性乳腺癌转移灶中明显上调，并通过机器学习驱动的蛋白质结构建模预测其同源二聚体界面，进而结合定点突变实验证实ICAM1通过自我结合促进CTC簇形成和跨内皮迁移，为ICAM1作为新型治疗靶点提供了分子证据。此外，Aceto团队开发的CTC⁃SCITE模型基于贝叶斯推断与概率统计，可从混合测序数据中解卷积出细胞基因型，揭示CTC簇的寡克隆特性及其在转移播散中的优势^［79］，这一方法实质上体现了机器学习在单细胞多组学中的潜力。

总体而言，CTC簇研究已从传统单一组学拓展至多组学整合，并逐步引入AI驱动建模，明显推动了对其形成机制、表观遗传特征和转移潜能的理解。未来研究仍需解决若干挑战，包括单细胞数据稀缺与噪声大、多组学整合复杂度高以及临床可解释性不足。若能发展低成本、高精度的AI算法，并在大规模前瞻性队列中验证其预测效能，有望推动CTC簇研究从基础机制解析走向临床转化，为液体活检和个体化抗转移治疗提供切实支持。

3 发展趋势与未来展望

3.1 CTC温和释放策略的优化前景

实现对CTC高效捕获后，如何以温和、可控的方式释放目标细胞，仍是制约其功能研究和临床应用的重要技术瓶颈。现有CTC释放方法（如酶消化^［80］、光/电/热/pH/化学触发^{［81⁃85］}）虽各具优势，但普遍存在损伤细胞活性/完整性、设备复杂、刺激条件苛刻等问题，难以满足下游活细胞分析的高标准需求。

针对上述挑战，研究开始引入仿生机制、酶响应可降解材料及内源性刺激触发策略，推动释放过程向更温和、更智能方向演进。未来，CTC温和释放技术优化方向在于：开发生物相容性好、可编程降解且精准响应的智能释放界面材料；实现释放模块与微流控捕获平台的高度集成与自动化；确保释放技术与单细胞组学、标志物分析及药物筛选平台的兼容性。智能响应材料和仿生策略的进步将推动构建高效、温和、标准化的释放系统，成为液体活检突破的关键。

3.2 CTC簇富集研究的功能转化前景

作为具有极高转移潜能的特殊结构，CTC簇在血液循环中的存活优势和远端定植能力，主要源于其与血液微环境中免疫细胞、血小板及内皮细胞之间复杂而动态的互作机制。例如，血小板可通过P⁃选择素与整合素介导，迅速包裹CTC簇形成保护性屏障，促进其在血管壁的附着与外渗^［86］；CTC簇亦可在保持细胞间黏附状态下穿越毛细血管裂隙，完成“angiopellosis”式迁移，从而避免解聚带来的细胞凋亡与功能丧失^［87］。然而，当前对这些协同机制的定量研究与系统建模仍显不足，限制了其作为潜在干预靶点的深入开发。

当前CTC簇富集策略多聚焦于结构保真与捕获效率的提升，未来的发展趋势应更强调富集平台与功能模拟系统的深度融合。一方面，可在CTC簇分离平台基础上进一步引入动态灌流/血管芯片系统，以模拟真实血流剪切力及细胞⁃细胞交互，动态解析CTC簇的力学行为；另一方面，需结合空间转录组学、单细胞多组学与AI辅助判读等高通量技术，有望实现CTC簇的聚集/解聚及转移调控网络的深入解析，识别关键驱动因子并建立预测模型。

基于对上述机制的系统理解，开发针对CTC簇的干预策略已成为抗转移的新方向。已有研究表明，阻断簇⁃血小板黏附通路（如CD44、CXCL12/CXCR4轴）或利用纳米载体解聚簇结构，可有效抑制早期转移^［77］。未来应以“高保真捕获⁃功能模拟⁃靶点挖掘”为核心，构建一体化多功能平台，推动研究范式从“结构识别”向“靶向阻断”方向转化。

4 总结

CTC及CTC簇作为反映肿瘤异质性与演进的关键标志物，在肿瘤早筛、疗效评估和精准治疗中潜力明显。然而，其极低检出率、结构脆弱性及表型异质性对检测技术构成严峻挑战。现有方法仍面临间充质亚群识别不足、温和释放策略不成熟、早期检测灵敏度/特异度不稳定，以及活性维持与多组学对接等瓶颈。未来需加速构建高通量、低剪切力且异质性兼容的富集平台，实现对CTC亚型及簇结构的精准识别与保护；同步发展温和释放与活性评估体系，保障下游分析稳定性；进一步推动CTC与ctDNA、细胞外囊泡、循环蛋白、影像组学的多模态融合分析，将有望实现液体活检从“标志物检测”向“系统诊疗决策支撑”的转变。

作者贡献度说明：

蒲佳荣：文章撰写及图表制作；丁丽华：查阅文献及汇总；合思甜、吴拥军：研究指导，论文修改，基金支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(82273685)

海南省高等学校科学研究项目(Hnky2025ZC⁃7)

海南医科大学学术提升支撑计划(XSTS2025031)