基于内质网应激探讨山奈酚抑制前列腺癌PC-3细胞增殖与迁移的机制研究

Mechanism of kaempferol in inhibiting proliferation and migration of prostate cancer PC-3 cells via endoplasmic reticulum stress

摘要

目的 观察山奈酚对内质网应激介导的细胞增殖与迁移的影响，从而阐明其治疗前列腺癌的分子机制。 方法 人前列腺癌PC-3细胞分为空白组、山奈酚低/高剂量组（30/60 μg/mL）及si-PERK基因干预组（含空载对照）。采用CCK8实验和流式细胞术观察各组细胞活性及细胞周期分布水平；利用Transwell实验检测细胞迁移水平；Western blot和RT-qPCR分析增殖、细胞黏附和PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路中关键蛋白的表达。 结果 与空白组相比，山奈酚组G0/G1期分布比例明显增加，S期细胞比例、细胞活性和细胞迁移的数量明显降低，E-cadherin、PERK、ATF4、CHOP蛋白与mRNA的表达和p-eIF2α/eIF2α的比值明显上调，p-Rb/Rb的比值和Cyclin D1、N-cadherin蛋白的表达明显下调，差异具有统计学意义（P<0.01）。通过si-PERK基因干预实验证实，PERK通路敲除可逆转山奈酚对细胞增殖和迁移的抑制作用，si-PERK组与si-PERK+山奈酚组间差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 山奈酚通过特异性激活 PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号轴诱导持续性内质网应激，进而抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖与迁移能力。

Abstract

Objective To investigate the effects of kaempferol on endoplasmic reticulum stress （ERS）-mediated cell proliferation and migration， and to elucidate its molecular mechanism in treating prostate cancer. Methods Human prostate cancer PC-3 cells were divided into a blank control group， low/high-dose kaempferol groups （30/60 μg/mL）， and a si-PERK gene intervention group （including a vector control）. Cell viability and cell cycle distribution were assessed using the CCK-8 assay and flow cytometry， respectively. Cell migration was evaluated using the Transwell assay. Western blot and RT-qPCR were employed to analyze the expression of key proteins involved in proliferation， cell adhesion， and the PERK/eIF2α/ATF4/CHOP pathway. Results Compared to the blank control group， the kaempferol groups showed a significant increase in the proportion of cells in the G0/G1 phase， while the proportion of cells in the S phase， cell viability， and the number of migrating cells were significantly reduced. The expression of E-cadherin， PERK， ATF4， and CHOP proteins and mRNA， as well as the ratio of p‑eIF2α/eIF2α， were significantly upregulated. In contrast， the ratio of p-Rb/Rb and the expression of Cyclin D1 and N-cadherin proteins were significantly downregulated， with all differences being statistically significant （P<0.01）. The si-PERK gene intervention experiment confirmed that knocking out the PERK pathway reversed the inhibitory effects of kaempferol on cell proliferation and migration， with no significant changes observed between the si-PERK group and the si-PERK + kaempferol group （P>0.05）. Conclusion Kaempferol induces sustained endoplasmic reticulum stress by specifically activating the PERK-eIF2α-ATF4-CHOP signaling axis， thereby inhibiting the proliferation and migration of prostate cancer PC-3 cells.

Graphical abstract

关键词

山奈酚 / 前列腺癌 / 内质网应激 / 增殖 / 迁移

Key words

Kaempferol / Prostate cancer / Endoplasmic reticulum stress / Proliferation / Migration

前列腺癌（prostate cancer， PCa）是起源于前列腺上皮细胞的恶性肿瘤，作为男性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在男性肿瘤中位居前列^［1］。流行病学数据显示，2020年全球新发PCa病例约141.4万例，死亡人数约37.5万^［2］。尽管诊疗技术的进步提高了PCa的早期诊断率，但晚期PCa的治疗仍面临挑战，对现有疗法（如雄激素剥夺治疗及化疗）产生的耐药性问题日益突出^［3］。因此，探索新的治疗策略和分子靶点至关重要。

山奈酚（Kaempferol）是一种广泛存在于多种植物源性食物中的天然黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎及抗癌的活性。研究表明，山奈酚通过多种机制发挥抗癌作用，包括诱导肿瘤细胞凋亡、抑制细胞增殖与迁移以及调控肿瘤微环境^［4］。在PCa研究中，山奈酚已被证实可诱导癌细胞凋亡、抑制雄激素依赖性途径介导的细胞增殖以及抑制肿瘤血管生成^［5］。这些发现为山奈酚应用于PCa的治疗提供了理论基础。

内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是细胞应对内质网功能紊乱时启动的保护性反应，涉及未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）和细胞凋亡通路的激活^［6］。研究表明，ERS在肿瘤发生、发展中具有双重作用，其中适度的ERS通过激活UPR促进肿瘤细胞存活与增殖，而过度的ERS则可诱导肿瘤细胞凋亡^［7］。在PCa中，ERS与肿瘤细胞的侵袭转移及治疗耐药性密切相关^［8］。此外，ERS还可通过调控肿瘤微环境中的免疫细胞功能影响PCa的进展^［9］。因此，本研究旨在通过探讨山奈酚对人PCa PC-3细胞ERS的影响，阐明其治疗PCa的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞

人前列腺癌细胞系PC-3（细胞编号：SCSP-532）购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞在含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的RPMI-1640培养基中，并在37 ℃、100%湿度且含5%CO₂的细胞恒温培养箱中培养。每2~3天更换新鲜培养基，并观察细胞生长状态。当细胞生长至80%~90%融合时，使用0.25%胰酶-EDTA溶液消化，以1∶3~1∶4的比例进行传代。所有实验使用对数生长期的细胞，以确保实验的一致性和可重复性。

1.2 药物与试剂

RPMI-1640培养基购于欧玛仕（上海）生物科技有限公司（货号：OMDCM-038）；含0.25%胰酶细胞消化液、山奈酚标准品、结晶紫染色液和RIPA裂解液购于上海碧云天生物技术有限公司（货号：C0201、Y261837、C0121、P0013B）；PERK沉默质粒和空载质粒由圣克鲁斯生物技术（上海）有限公司提供；细胞活力检测试剂盒购于武汉菲恩生物科技有限公司（货号：FNCK064）；细胞周期检测试剂盒购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司（货号：E-CK-A351）；Lipofectamine 3000、BCA蛋白定量试剂盒、TRIzol试剂和逆转录试剂盒购于美国Thermo Fisher公司（货号：L3000015、23225、15596-026、K16215）；多聚甲醛购于美国Sigma公司（货号：P6148）；PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4、CHOP和β-actin一抗购于美国Cell Signaling Technology公司（货号：3192、3398、5324、11815、2895、4967）；HRP标记二抗购于英国Abcam公司（货号：ab6721）；ECL发光试剂购于美国Millipore公司（货号：WBKLS0500）；SYBR Green qPCR Master Mix购于翌圣生物科技（上海）股份有限公司（货号：11201ES08）。

1.3 细胞分组与药物干预

取对数生长期的PC-3细胞，胰酶消化后离心（1 000 r/min，3 min），弃上清后加入完全培养基。细胞以完全培养基重悬后调整细胞密度，并以2×10⁵个/孔接种于6孔板中培养至细胞贴壁。细胞分为空白组、山奈酚低剂量组（30 μg/mL）和山奈酚高剂量组（60 μg/mL），每组设置3个复孔。

此外，细胞分为空载组、si-PERK组和si-PERK+山奈酚高剂量组，每组设置3个复孔。其中空载组和si-PERK组及si-PERK+山奈酚高剂量组分别使用Lipofectamine 3000转染试剂，按照说明书分别将空载体质粒或si-PERK质粒转染至PC-3细胞中。转染后6 h更换为完全培养基，继续培养24 h。此外，si-PERK+山奈酚高剂量组在转染后24 h给予山奈酚60 μg/mL进行干预，每组设置3个复孔。

1.4 指标检测

1.4.1 细胞活性检测

取“1.3”中PC-3细胞，弃培养基，每孔加入100 μL含10%CCK-8试剂的新鲜培养基，继续孵育2 h。使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度值。

1.4.2 细胞周期检测

取“1.3”中PC-3细胞，弃培养基，用预冷的PBS洗涤2次，重悬于70%乙醇中，4 ℃固定过夜。次日，弃去固定液，用PBS洗涤细胞，加入含有RNase A和PI的染色缓冲液，37 ℃避光孵育30 min。使用流式细胞仪检测细胞周期分布，通过FlowJo软件分析G0/G1、S和G2/M期的细胞比例。

1.4.3 Transwell实验

取“1.3”中PC-3细胞，将2×10⁴个细胞接种于上室（无血清培养基），下室加入含10%胎牛血清的培养基作为趋化因子。置于37 ℃培养箱中孵育24 h。取出小室，用棉签轻轻擦去上室未迁移的细胞，下室细胞用4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色。在显微镜下随机选取3个视野计数细胞数。

1.4.4 Western blot检测

取“1.3”中PC-3细胞，弃培养基，PBS洗涤×2次。加入RIPA裂解液与冰上裂解30 min。4 ℃离心（12 000 r/min，15 min），取上清。BCA法测定蛋白浓度。上样后进行电泳，随后将凝胶中的蛋白转至PVDF膜。将膜浸至5%脱脂牛奶中室温摇床封闭1 h，加入适当比例稀释的PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4、CHOP和β-actin一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗涤×3次，加入HRP标记的二抗后与室温下摇床孵育1 h，TBST洗涤×3次。将ECL化学发光试剂均匀覆盖在膜上，避光反应1 min，凝胶成像系统成像，采用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.4.5 RT-qPCR检测

取“1.3”中PC3细胞，弃培养基，无菌PBS缓冲液洗涤×2次。采用TRIzol法提取细胞总RNA，微量分光光度计测定RNA浓度与纯度。使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，反应体系为20 μL，实验步骤参照试剂盒说明书。配置反应体系，加入PERK、eIF2α、ATF4、CHOP及GAPDH引物。引物信息如下：PERK：上游引物，5′-TTCAATGCCTGGGACGTGGT-3′，下游引物，5′-ACCTTTTCCCGAGCCAATTCC-3′，产物长度：121 bp；eIF2α：上游引物，5′-ACCCTGGAG AGAACAGAAGGC-3′，下游引物，5′-TGCCTCGCAAGTTCAGTCTC-3′，产物长度：146 bp；ATF4：上游引物，5′-ATGGGTTGGTCAGTCCCTCC-3′，下游引物，5′-CCAACAGGGCATCCAAGTCG-3′，产物长度：108 bp；CHOP：上游引物，5′-TTCACCACTCTTGACCCTGC-3′，下游引物，5′-CTCCTTCATGCG CTGCTTTC-3′，产物长度：213 bp；GAPDH：上游引物，5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物，5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′，产物长度：101 bp。设置反应程序：预变性95 ℃预变性30 s，循环40次（95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s），随后熔解曲线分析。使用GAPDH作为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算PERK、eIF2α、ATF4和CHOP mRNA相对表达量。

1.5 统计学处理

数据采用SPSS 27.0统计软件进行分析。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间比较采用Tukey′s HSD检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量山奈酚对PC-3细胞增殖的影响

与空白组相比，山奈酚低剂量和高剂量组G0/G1期分布比例明显增加，S期细胞比例明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。而各组间G2/M期细胞比例差异无统计学意义（P>0.05），见图1A。与空白组相比，山奈酚低剂量24 h的OD值明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05），山奈酚高剂量组24 h的OD值明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01）；与空白组相比，山奈酚低剂量和高剂量组48 h的OD值明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01），见图1B。此外，Western blot结果显示，与空白组相比，山奈酚低剂量和高剂量组p-Rb/Rb的比值和Cyclin D1蛋白的表达明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。而各组间Rb蛋白的表达无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），见图1C。

2.2 不同剂量山奈酚对PC-3细胞迁移的影响

与空白组相比，山奈酚低剂量和高剂量组细胞迁移数量明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01），见图2A。与空白组相比，山奈酚低剂量和高剂量组N-cadherin蛋白的表达明显降低，E-cadherin蛋白的表达上调，差异具有统计学意义（P<0.01），见图2B。

2.3 不同剂量山奈酚对PC-3细胞PERK信号通路的影响

与空白组相比，山奈酚低剂量和高剂量组PERK、ATF4、CHOP蛋白的表达和p-eIF2α/eIF2α的比值明显增加，差异具有统计学意义（P<0.01），见图3A。此外，与空白组相比，山奈酚低剂量和高剂量组PERK、ATF4、CHOP mRNA的表达明显增加，差异具有统计学意义（P<0.01）。而各组间eIF2α mRNA的表达无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），见图3B。

2.4 山奈酚通过PERK对PC-3细胞增殖的影响

与空载组相比，si-PERK组和si-PERK+山奈酚组G0/G1期分布比例明显降低，S期细胞比例明显增加，差异具有统计学意义（P<0.01）。而各组间G2/M期细胞比例差异无统计学意义（P>0.05），见图4A。与空载组相比，si-PERK组和si-PERK+山奈酚组24 h和48 h的OD值明显增加，差异具有统计学意义（P<0.01），见图4B。Western blot结果显示，与空载组相比，si-PERK组和si-PERK+山奈酚组p-Rb/Rb的比值和Cyclin D1蛋白的表达明显增加，差异具有统计学意义（P<0.01）。而各组间Rb蛋白的表达无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），si-PERK组和si-PERK+山奈酚组比较，差异无统计学意义（P>0.05），见图4C。

2.5 山奈酚通过PERK对PC-3细胞迁移的影响

与空载组相比，si-PERK组和si-PERK+山奈酚组细胞迁移数量明显增加，差异具有统计学意义（P<0.01），见图5A。与空载组相比，si-PERK组和si-PERK+山奈酚组N-cadherin蛋白的表达明显上调，E-cadherin蛋白的表达下调，差异具有统计学意义（P<0.01），见图5B。

2.6 不同剂量山奈酚对PC-3细胞PERK信号通路的影响

与空载组相比，si-PERK组和si-PERK+山奈酚组PERK、ATF4、CHOP蛋白的表达和p-eIF2α/eIF2α的比值明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01），见图6A。与空载组相比，si-PERK组和si-PERK+山奈酚组PERK、ATF4、CHOP mRNA的表达明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01），而各组间eIF2α mRNA的表达无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），见图6B。

3 讨论

细胞增殖和细胞周期调控异常是肿瘤发生、发展的核心机制之一^［10］。细胞周期由G1期、S期、G2期和M期组成，其中G1/S期是关键的检查点，决定细胞是否进入DNA合成和增殖阶段。在G1/S期调控中，Rb与Cyclin D1是关键因子。作为细胞周期的“分子制动器”，Rb蛋白通过抑制E2F转录因子（E2F transcription factors，E2F）的活性来维持细胞静止状态。而Cyclin D1/CDK4复合物是解除这一制动机制的关键调控因子^［11］。在前列腺癌PC-3细胞模型中，Rb蛋白的失活导致对Cyclin D1的依赖性降低，然而Cyclin D1仍可通过CDK依赖性途径和非依赖性途径促进肿瘤侵袭和转移特性^［12］。本研究结果证实，山奈酚通过调控Rb和Cyclin D1蛋白的表达水平，明显抑制了PC-3细胞的增殖活性和G1/S期阻滞。

肿瘤细胞的迁移是癌症侵袭和转移的关键步骤，涉及细胞与细胞外基质（ECM）的相互作用、细胞骨架的重组以及细胞间黏附力的改变^［13］。E-cadherin和N-cadherin是Cadherin家族的重要成员，其中E-cadherin是上皮细胞间的主要黏附分子，通过其胞外结构域与相邻细胞的E-cadherin结合，形成稳定的同型黏附连接，维持上皮组织的完整性和极性^{［14，15］}。N-cadherin的表达通常与肿瘤的侵袭和转移呈现明显的正相关。在前列腺癌中，N-cadherin的表达上调是上皮间质转化的标志之一，其通过与成纤维细胞生长因子受体等分子相互作用，促进肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移^{［16，17］}。本研究结果表明，山奈酚能够明显抑制N-cadherin蛋白的表达，上调E-cadherin蛋白的表达，从而抑制PC-3细胞的迁移。

内质网作为真核细胞中关键的膜性细胞器，承担着蛋白质合成、正确折叠与修饰、脂质合成和钙离子稳态维持等的核心功能^［18］。当细胞在缺氧、氧化应激、钙失衡或蛋白质合成负荷过载等病理条件下，诱发ERS以恢复内质网稳态。PERK是一种Ⅰ型跨膜蛋白，其N端位于内质网腔，C端位于细胞质。PERK是内质网应激的主要感受器之一，当内质网中未折叠或错误折叠蛋白质积累时，BiP从PERK上解离，导致PERK激活^［19］。eIF2α是蛋白质翻译起始过程中的关键调控因子，其中eIF2α是调控eIF2活性的核心亚基。PERK的激活通过促进eIF2α的磷酸化，进而促进ATF4的翻译^［20］。ATF4是一种碱性亮氨酸拉链转录因子，属于CREB/ATF转录因子家族。ATF4通过诱导CHOP的表达，促进细胞凋亡^［21］。本研究结果显示，山奈酚能够明显上调PERK、ATF4和CHOP的表达，促进eIF2α的磷酸化，促进ERS反应。在此基础上，沉默PERK的基础上给予山奈酚干预，山奈酚并未明显表现出对ATF4和CHOP的表达和eIF2α的磷酸化的调控作用。

综上所述，山奈酚通过特异性激活PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号轴诱导持续性内质网应激，进而抑制前列腺癌细胞的增殖与迁移能力。

作者贡献度说明：

袁星星：设计实验；杨小芳：数据统计；杨柳欣和邵余典：完成实验；袁星星和邵余典：撰写论文。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

黑龙江省博士后面上项目(LBH-Z21218)