非肌肉肌球蛋白ⅡA维持高糖诱导的脑微血管内皮细胞功能

Non‑muscle myosin ⅡA preserves the functionality of brain microvascular endothelial cells in high glucose environments

摘要

目的 探讨非肌肉肌球蛋白ⅡA（non‑muscle myosin ⅡA， NMⅡA）在高糖（high glucose，HG）诱导的脑微血管内皮细胞损伤中的作用机制。 方法 采用高糖培养基培养小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3，建立体外糖尿病脑血管病变模型。利用siRNA技术敲低NMⅡA表达，检测细胞活力、炎症因子、氧化应激产物水平及细胞表征改变。通过CCK‑8法、细胞划痕实验、原子力显微镜检测等方法，检测细胞增殖、迁移、侵袭及力学特性变化。通过Western blot和RT‑qPCR检测相关蛋白及基因表达。 结果 成功构建bEnd.3高糖模型。敲低NMⅡA后，炎症因子和氧化应激产物水平明显升高，细胞活力和迁移能力降低，细胞高度、表面黏附力和杨氏模量降低（P<0.05）。 结论 NMⅡA参与细胞收缩、迁移、胞质分裂及维持细胞张力等关键过程。在高糖环境下，敲低NMⅡA会造成炎症因子等指标加重，细胞功能活力减弱（P<0.05）。说明NMⅡA或是维持高糖状态下脑微血管内皮细胞正常功能的关键因素之一，可能为治疗糖尿病脑血管病变寻找到新的潜在靶点。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of non‑muscle myosin ⅡA （NMⅡA） in high glucose （HG）‑induced injury of brain microvascular endothelial cells bEnd.3. Methods An in vitro diabetic cerebrovascular injury model was established by culturing bEnd.3 cells in HG medium. NMⅡA expression was knocked down using siRNA， followed by assessments of cell viability， inflammatory factors， oxidative stress markers， and cellular morphological changes. Functional assays （CCK‑8， wound healing， atomic force microscopy） were performed to evaluate proliferation， migration， invasion， and mechanical properties. Protein and gene expression were analyzed by Western blot and RT‑qPCR. Results The HG‑induced bEnd.3 model was successfully established. NMⅡA knockdown exacerbated inflammation and oxidative stress， reduced cell viability and migration， and decreased cell height， adhesion， and Young's modulus（P<0.05）. Conclusion NMⅡA regulates critical processes including cell contraction， migration， and tension maintenance. Under HG conditions， NMⅡA deficiency worsens inflammation and impairs endothelial function， suggesting its pivotal role in preserving cerebrovascular homeostasis（P<0.05）. Targeting NMⅡA may offer a novel therapeutic strategy for diabetic cerebrovascular complications.

Graphical abstract

关键词

糖尿病 / 脑微血管内皮细胞 / 非肌肉肌球蛋白ⅡA（NMⅡA） / 高糖 / 细胞损伤

Key words

Diabetes mellitus / Cerebral microvascular endothelial cells / Non‑muscle myosin ⅡA （NMⅡA） / High glucose / Cell injury

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种由胰岛素绝对或相对分泌不足以及利用障碍引发的，以高血糖为标志的慢性疾病^［1］。该疾病主要分为1型、2型和妊娠糖尿病3种类型^［2］。病因主要归结为遗传因素和环境因素的共同作用，在糖尿病众多的并发症中，脑血管病变是最为严重的并发症之一^［3］。临床研究表明，糖尿病患者发生脑血管疾病的风险较非糖尿病患者明显增加，约为2~4倍。脑血管病变的发生，使得糖尿病患者的认知功能障碍、脑梗死及脑出血等疾病的发生率大幅上升，成为糖尿病患者致死、致残的重要原因^［4］。长期的高血糖状态是糖尿病引发各种并发症的关键始动因素。长期高血糖诱导晚期糖基化终末产物（AGEs）积累，直接导致内皮细胞凋亡和基底膜增厚，破坏血脑屏障（BBB）的完整性等，高血糖也会加剧细胞发生铁死亡，铜死亡等病理变化^［5］。

非肌肉肌球蛋白Ⅱ（non‑muscle myosin Ⅱ，NMⅡ）是肌动蛋白结合蛋白，存在非肌肉细胞中，是促进肌动蛋白细胞骨架网络收缩的分子马达^［6］。除了为细胞内分子运动提供动力外，NMⅡ还参与各种细胞生理活动，如细胞迁移、黏附、细胞分裂、信号转导等。NMⅡ有3种亚型，分别由MYH9、MYH10和MYH14编码，即NMⅡA（MYH9）、NMⅡB（MYH10）和NMⅡC（MYH14）^［7］。MYH9作为NMⅡ的3种亚型之一，是一种具有收缩特性的运动蛋白，其表现出非常不对称的形状，具有2个主要结构域；N端的球状头部，包括肌动蛋白结合位点和C端α螺旋杆结构域，影响双极细丝的形成^［8］。MYH9参与一系列细胞功能，例如迁移、黏附、吞噬、胞质分裂和信号转导，其中一些功能依赖于多种蛋白质相互作用的调节^［9］。MYH10在细胞的前端延伸和后端收缩过程中起着重要的推动作用，使细胞能够在基质上移动。此外，MYH10还参与细胞与细胞或细胞与基质之间的黏附过程，影响细胞的稳定性和组织的完整性^［10］。

研究表明NMⅡA在内皮细胞稳态中发挥保护作用，但其在高糖诱导的脑微血管内皮损伤中的具体机制尚未明确。尤其缺乏以下关键问题的深入研究：NMⅡA‑MYH9是否通过维持细胞力学特性（如黏附力、杨氏模量）保护高糖下的内皮功能，NMⅡA缺失如何通过炎症（如VCAM‑1）和自噬（如p62）通路加剧血管损伤，靶向NMⅡA能否成为糖尿病脑血管病变的治疗新策略。本研究旨在解决上述问题，通过体外模型阐明NMⅡA‑MYH9在高糖微环境中维持脑微血管内皮功能的机制，为糖尿病脑血管并发症提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

D‑（+）‑葡萄糖（glucose，GLU）购自德国sigma公司（货号：G7021），DMEM高糖培养基（货号：C11995）购自美国Gibco公司；胰蛋白酶‑EDTA消化液（0.25%）含酚红购自中国索莱宝科技有限公司，T25细胞培养瓶、35/60/100 mm细胞培养皿、6/12/96孔细胞培养板、玻底细胞培养皿/共聚焦小皿购自中国无锡耐思生命科技股份有限公司；SDS裂解液、蛋白酶抑制剂（100×）、EDTA（100×）、含DAPI荧光防淬灭剂NMⅡ购自中国北京碧云天生物科技有限公司；组织细胞固定液（4%多聚甲醛），30%丙烯酰胺、Tris‑HCl（pH8.8）10% SDS、Tris‑HCl （pH6.8）、过硫酸铵 （APS）10%、TEMED都购自中国武汉赛维尔生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、Western blot一抗稀释液、Western blot二抗稀释液、SDS‑PAGE 5×蛋白上样缓冲液、驴血清，、ECL超能化学发光试剂盒购自中国杭州弗德生物技术有限公司；蛋白Marker （Protein Ladder）购自中国武汉爱博泰克生物科技有限公司；聚乙二稀二氟化物薄膜（PVDF膜，0.22/0.45 μm）购自德国Merck MiLipore公司；Stripping buffer购自康为世纪生物科技股份有限公司；CCK‑8、活性氧（reactive oxygen species， ROS）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase， LDH）购自上海碧云天生物技术有限公司；EZ‑press RNA Purification Kit试剂盒、EZB逆转录试剂盒、2×Color SYBR Green Qpcr Master Mix试剂盒购自EZBioscience公司；引物siRNA购自上海生工生物工程股份有限公司；NMⅡA Antibody、NMⅡA Antibody购自Biolegend公司。

1.2 细胞及培养

本研究细胞实验所涉及的细胞为小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3，购自广州吉妮欧生物科技有限公司（货号：JNO‑2377‑2）。bEnd.3完全培养基：根据bEnd.3完全培养基说明书配制，89% DMEM基础培养基+10% FBS+1% P/S，混匀后置于4 ℃冰箱中避光保存。bEnd.3无血清培养基：99% DMEM基础培养基+1% P/S，混匀后置于4 ℃冰箱中避光保存。细胞经过复苏后，用配置好的bEnd.3完全培养基在三气培养箱中以5% CO₂、20.9% O₂，置于37 ℃培养箱下培养，待细胞密度达到80%后进行传代及后续实验操作。

1.3 实验方法

1.3.1 建立MYH9基因敲低细胞模型

根据小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3培养方法，种板密度为45 000/cm²，24 h内待细胞达到70%~90%密度，即可转染。从培养箱中取出细胞后，使用PBS洗涤1遍，12孔板、6孔板以及共聚焦小皿，每孔加入500 μL/mL的DMEM。Control组的12孔板、6孔板和共聚焦小皿，则每孔添加500 μL/mL的DMEM完全培养基，处理完成后将所有细胞放入培养箱，以备后续使用。在配制siRNA时，先以4 000~5 000 r/min离心约30 s，全程冰上操作，关风扇后缓慢开管盖。DEPC水解冻后置于冰上备用，依据管子上标明的纳摩尔数，每纳摩尔加入50 μL DEPC水，使siRNA浓度达20 μmol/L，先经漩涡混匀器轻柔振荡，再用枪多次混匀溶解，分装后于-20 ℃保存，若siRNA带有荧光标记（如FAM等），需在-20 ℃避光保存。配制转染复合物（以6孔板为例）时，先取570 μL DMEM基础培养基与36 μL RNA Transmate试剂，用枪轻柔混匀为管①；另取600 μL DMEM与6 μL siRNA（20 μmol/L），用枪轻柔混匀为管②。将管①加入管②中，轻柔混合均匀，静置10 min。按此配方，转染终浓度为10 nmol/L时，每孔需100 μL转染复合物；终浓度20 nmol/L时，每孔需200 μL，依此类推。以20 nmol/L为例，每孔弃去400 μL DMEM基础培养基后，悬空均匀滴加复合物，全板加完后轻柔摇晃混匀，转染4 h。

4 h后每孔补液1 000 μL，转染24 h后更换为新的完全培养基。至转染第4天，收集细胞RNA或蛋白，或用4%多聚甲醛固定，进行后续实验。

1.3.2 CCK‑8法筛选葡萄糖浓度

96孔板中每个孔接种10 000个细胞，使其密度均匀，通过预实验的浓度梯度筛选确定，设置5组葡萄糖浓度（5.5、25、100、300、600 mmol/L）及3个时间点（24、48、72 h），每组向孔内加入10 μL的CCK‑8溶液以及90 μL的基础培养基进行均匀混悬，随后将细胞置于孵育环境孵育1~4 h，最后使用多模式微孔板，测定其在450 nm处的吸光度值。明确筛选标准（抑制率≥50%且存活率>60%）。

1.3.3 LDH活性测定

将细胞接种于6孔板，使待检测时细胞密度不超过80%~90%满。加入siRNA处理细胞，并设置相应的对照组。刺激结束后，每孔吸弃200 μL上清，加入200 μL试剂盒提供的LDH释放试剂（按试剂盒说明，以1∶10比例将LDH释放试剂加入溶液中并混匀），轻轻晃动培养板使试剂与细胞均匀接触，随后将培养板放回细胞培养箱孵育1 h。孵育完成后，使用多孔板离心机以400×g离心5 min。收集各孔上清液120 μL，转移至新的96孔板对应孔中，采用LDH细胞毒性检测试剂盒，在多模式微孔板采用490 nm波长下的LDH活性进行检测。

1.3.4 ROS的水平测定

按照ROS试剂盒说明书进行操作。先将细胞用PBS（轻轻洗涤1~2次，以去除残留的培养基和其他杂质。然后加入试剂盒提供的ROS检测工作液，使其充分覆盖细胞，孵育一段时间（一般为30 min左右），使ROS与检测工作液发生反应，产生荧光信号。接着使用荧光酶标仪在相应的激发波长和发射波长下检测各孔的荧光强度值，荧光强度与细胞内ROS的水平呈正相关，根据标准曲线或试剂盒提供的计算方法即可得出细胞内ROS的含量。或者将细胞消化下来，用基础培养基混悬后进行染色，在用PBS重悬后用BD Accuri C5流式细胞仪进行阳性细胞的筛选。

1.3.5 细胞划痕实验检测细胞迁移能力

将各组细胞以45 000个/cm²的密度种于6孔板，待其生长至单层汇合后，运用1 μL无菌吸头尖沿孔长轴垂直方向轻划以形成均匀直线划痕，注意保持力度一致以防过度损伤细胞及干扰细胞外基质；随后用PBS轻柔洗涤孔板3次并轻晃孔板，确保彻底去除划痕产生的碎片和未贴壁细胞，避免影响后续细胞迁移；接着加入适量无血清培养基，置于37 ℃、5% CO₂培养箱继续培养，以减少血清成分对细胞迁移的潜在干扰；于0、24、48 h取出孔板，使用倒置显微镜对划痕部位拍照，确保光线均匀、焦距合适且拍照位置每次一致，以便准确比较不同时间点的划痕愈合情况；拍照后，利用图像分析软件测量划痕宽度，依据公式划痕愈合率=（初始划痕宽度-愈合后划痕宽度）/初始划痕宽度×100%计算愈合率，从而定量评估各组细胞的迁移能力。

1.3.6 原子力显微镜检测细胞表征的改变

将bEnd.3细胞接种于玻底培养皿中，敲低MYH9，MYH10后用固定，用超快速原子力显微镜，仪器型号Bruker/Nano Wizard UL TRA Speed，选用布鲁克MLCT探针，Z轴长度0.48 μm，速度66 μm/s，像素数480，数据速率66 000.000赫兹，持续时间7.3 ms，算法选为“Calibration”，数据平滑处理有，垂直尖端位置设为“Tip Scanner‑Full Range（Active）”，电动载物台位置为（1 714.2 μm，-725.4 μm），Z轴扫描器为“Head Internal”，Z轴范围15 μm，像素时间18 ms进行液下细胞高度，黏附力，表面形貌等的测定。最后用仪器配套软件JPKSPM Data Processing进行图像分析。

1.3.7 Western blot 检测相关蛋白表达

用配置好的SDS裂解缓冲液提取蛋白样品，再利用BCA试剂盒进行定量。随后通过SDS‑PAGE凝胶分离蛋白，转膜后用5%脱脂牛奶封闭阻断2 h。接着加入一抗NMⅡA （1∶1 000）、VCAM‑1 （1∶1 000）、 VE‑cadherin （1∶2 000）、p62 （1∶1 500）、β‑actin（1∶10 000），并在4 ℃下孵育过夜。次日于室温下加入稀释比为1∶10 000的二抗孵育1 h。最后采用增强化学发光法检测，利用ImageJ软件分析条带强度，并借助Graphpad prism进行分析绘图。

1.3.8 RT‑qPCR检测相关基因表达

使用EZB RNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作，提取样本中的总RNA，得到的RNA溶液放于冰上并用微量分光光度仪进行浓度测定。按说明配置20 μL逆转录反应体系，依次加入总RNA、4×RT Master Mix和ddH₂O，吹打混匀并弹去气泡后，进行逆转录反应（42 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s，4 ℃ ∞），反应结束后得到的产物即为cDNA。利用NCBI设计引物，经BLAST验证特异性后，在生工生物工程股份有限公司网站下单订购，引物序列详情见表1。

2 结果

2.1 脑微血管内皮细胞高糖模型构建

本研究选取小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3，通过CCK‑8实验对不同葡萄糖浓度及作用时间进行筛选，根据预实验时间及浓度梯度实验结果，选定作用时间为48 h，作用浓度选择中剂量组25~300 mmol/L，再次进行二次浓度筛选，结果显示当葡萄糖浓度设定为200 mmol/L作用48 h时，细胞的增殖活性出现明显变化（图1A），据此选定该条件作为本研究的高糖模型参数。在该高糖模型下，对炎症因子的表达情况进行检测发现，与正常葡萄糖浓度组相比，高糖组IL‑6，IL‑1β的mRNA表达水平明显上调（图1B、C）。进一步的实验分析表明，高糖组的ROS水平明显高于对照组（图1D）。在高糖干预条件下，细胞模型中炎症因子（如TNF‑α/IL‑6）的mRNA及蛋白表达水平明显升高（P<0.05），同时ROS生成量较对照组增加。上述结果与糖尿病病理状态下特征性氧化应激及慢性炎症表型高度一致，证实成功构建了高糖状态下脑微血管内皮细胞模型。

2.2 敲低NMⅡA后对细胞LDH、炎症因子和氧化应激产物水平的影响

小鼠脑微血管内皮细胞敲低NMⅡA后，Western blot和qRCR分别在蛋白水平（图2A）和mRNA水平（图2B）检测敲低效率成功建立NMⅡA敲低模型。敲低NMⅡA后与敲低空白对照组相比，LDH（图2C），炎症趋化因子IL‑6、IL‑Iβ的表达明显上调（图2D、E）。高糖模型下炎症趋化因子IL‑6、ROS的生成明显增加，但在敲低NMⅡA的模型中，ROS无明显变化，值得注意的是，与高糖对照组相比，在敲低NMⅡA和高糖共同作用下，ROS的生成明显减少（图2F）。这提示NMⅡA可能参与了高糖诱导的ROS生成的某些信号通路，当NMⅡA被敲低时，部分缓解了高糖对ROS生成的促进效应。

2.3 原子力显微镜检测敲低NMⅡA后细胞形貌的变化

本研究采用超快速原子力显微镜对空白对照组和NMⅡA敲低组bEnd.3细胞进行细胞高度以及细胞表面黏附力的测定。通过JPKSPM Data Processing软件对所得图片进行分析处理，进而获取细胞高度（图3A）和黏附力图（图3B）。进一步分析从上述图片中得出细胞的杨氏模量（图3C）。研究结果显示，敲低NMⅡA后的bEnd.3细胞高度明显降低，细胞表面黏附力亦明显下降，同时敲低组的杨氏模量相较于空白对照组亦呈现出明显的降低趋势。这一系列变化表明NMⅡA的缺失不仅影响bEnd.3细胞的形态特征，还明显改变其表面黏附性能及力学刚度，这些发现为进一步理解NMⅡA在维持细胞机械完整性中的功能提供了重要的实验依据。

2.4 敲低NMⅡA对细胞活力和细胞迁移能力的影响

本研究采用siRNA技术成功敲低了bEnd.3细胞中NMⅡA的表达，随后通过细胞划痕实验和CCK‑8实验对细胞活力和迁移能力进行了检测。细胞划痕实验结果显示，与对照组相比，敲低NMⅡA后，细胞划痕区域在不同时间点的愈合程度（图4A、B），表明细胞的迁移能力受到抑制。CCK‑8实验则显示，敲低NMⅡA后，细胞的吸光度值（A₄₅₀）随时间推移的增长趋势较对照组明显减缓，细胞增殖活力明显下降（图4C）。上述结果表明，NMⅡA在维持bEnd.3细胞的正常迁移与增殖活动中具有重要作用。其表达下调不仅影响细胞运动能力，也明显抑制细胞生长，提示NMⅡA可能作为细胞力学‑生物学行为调控网络中的关键分子，参与调控脑血管内皮细胞的生理过程。本研究为深入理解NMⅡA在血脑屏障功能及相关病理机制中的作用提供了实验依据。

2.5 敲低NMⅡA上调高糖诱导的bEnd.3细胞炎症相关蛋白表达

为阐明非肌肉肌球蛋白ⅡA（NMⅡA/MYH9）在高糖微环境中调控内皮细胞炎症反应的作用机制，本研究通过siRNA靶向干预结合Western blot技术进行系统性分析。结果显示特异性敲低MYH9可明显抑制NMⅡA蛋白表达（图5A、B），且该效应在高糖条件下进一步增强。同时，内皮屏障关键蛋白VE‑cadherin在MYH9缺陷组呈现明显下调趋势（图5C），提示NMⅡA缺失可能破坏细胞间连接完整性。对蛋白条带灰度值进行定量分析发现，MYH9敲除组炎症相关标志物VCAM‑1表达明显升高（图5D），而高糖共处理组该现象呈协同性加剧。自噬调控蛋白p62在MYH9干扰组呈现持续性累积，且高糖暴露明显放大其表达水平变化（图5E）。上述结果表明，NMⅡA可能通过双重调控自噬稳态与炎症信号通路，在高糖诱导的内皮细胞应激反应中发挥保护性作用，其功能缺失将导致炎症级联反应的异常激活。

3 讨论

糖尿病相关脑血管病变是糖尿病患者常见的严重并发症之一，对患者的认知功能和生命健康构成重大威胁^［11］。深入探究其分子机制对于开发新的治疗策略具有重要意义。本研究聚焦于NMⅡA，旨在阐明其在高糖诱导的脑微血管内皮细胞损伤中的作用机制。本研究在建立高糖状态脑微血管内皮细胞模型后，通过siRNA技术敲低NMⅡA后，细胞活力和迁移能力进一步降低，表明NMⅡA在维持细胞正常生理功能中具有重要作用。

已有研究报道，高糖环境会诱导AGEs的积累，这些产物能够直接导致内皮细胞的凋亡和基底膜的增厚，进而破坏BBB的完整性^［12］。NMⅡA表达能够维持细胞骨架的稳定性和细胞的正常生理功能^［13］。然而，当NMⅡA被敲低时，细胞骨架的重组和细胞间连接的破坏变得更为明显，这与原子力显微镜检测结果相一致。敲低NMⅡA后，细胞高度、表面黏附力和杨氏模量的降低，进一步证实了NMⅡA在维持细胞力学特性方面的重要性。细胞力学特性的改变可能会影响细胞的形态和功能，进而加剧细胞损伤^［14］。

在炎症反应方面，本研究发现敲低NMⅡA后，炎症相关标志物VCAM‑1的表达明显升高。VCAM‑1是炎症反应和血管损伤的重要标志物，其表达增加表明NMⅡA的缺失可能加剧血管炎症反应，促进血管损伤^［15］。这一结果与先前的研究报道相一致，即NMⅡA在调节炎症反应中发挥着重要作用^［16］。此外，敲低NMⅡA后，自噬调控蛋白p62的表达水平发生变化^［17］。自噬在细胞应对各种应激反应中具有重要作用，其稳态的破坏可能导致细胞功能障碍^［18］。因此，NMⅡA可能通过双重调控自噬稳态与炎症信号通路，在高糖诱导的内皮细胞应激反应中发挥保护性作用^［19］。其功能缺失将导致炎症级联反应的异常激活^［20］，进而加剧细胞损伤。

综上所述，NMⅡA在高糖诱导的脑微血管内皮细胞损伤中发挥着关键作用。NMⅡA能够维持细胞的正常功能和应对氧化应激^［21］。NMⅡA并非简单的结构蛋白，而是高糖环境下整合“力学‑氧化‑炎症‑自噬”四重信号的枢纽。这一发现为糖尿病脑血管病变的治疗提供了新的潜在靶点。未来的研究可以进一步探索NMⅡA在糖尿病脑血管病变中的具体信号通路，以及其作为治疗靶点的可行性和安全性。通过调节NMⅡA的表达或功能，可能为糖尿病脑血管病变的治疗提供新的策略。同时，结合其他研究报道，可以更全面地理解NMⅡA在糖尿病并发症中的作用机制，为开发更有效的治疗方法提供理论依据。

作者贡献度说明：

赵玉洁：完成实验、数据统计分析、结果解释及文章撰写；谭越雯，薛晋垣，周翊栋：数据统计分析。曹佳会：论文设计及资金支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(32000551)