4‑二乙氨基苯甲醛诱导肠道屏障稳态失调的机制研究

Mechanism of 4‑diethylaminobenzaldehyde‑induced disruption in gut barrier homeostasis

摘要

目的 探讨4‑二乙氨基苯甲醛（4‑diethylaminobenzaldehyde，DEAB）对小鼠肠道上皮屏障的影响，研究相关分子机制。 方法 12只成年雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组及DEAB组。DEAB组给予10 mg∙kg^‑1∙bw^‑1 DEAB腹腔注射，对照组给予玉米油腹腔注射。7 d后，采用H&E染色和PAS染色观察小鼠肠道组织病理形态表现；组织免疫荧光染色检测肠道上皮组织Lgr5、ZO‑1蛋白表达量；RT‑PCR检测肠道上皮细胞IL‑22、Reg3γ、Reg3β、Lgr5 mRNA表达量；流式细胞术检测肠道固有层淋巴细胞中CD11c⁺MHC‑Ⅱ⁺细胞、CD3⁺细胞数量；平板法检测肠系膜淋巴结及脾脏载菌量。 结果 相较于对照组，DEAB组小鼠肠绒毛长度明显缩短，肠道炎症细胞明显增多，杯状细胞明显减少（P<0.05）；肠道上皮隐窝Lgr5蛋白及ZO‑1蛋白表达明显减少（P<0.01）；小鼠肠道上皮细胞IL‑22、Reg3γ、Reg3β mRNA表达水平明显升高（P<0.05），而Lgr5 mRNA表达水平明显降低（P<0.05）；小鼠肠道固有层淋巴细胞中CD11c⁺MHC‑Ⅱ⁺细胞和CD3⁺细胞数量明显增多（P<0.05）；小鼠肠系膜淋巴结以及脾脏载菌量明显升高（P<0.01）。 结论 视黄酸代谢通路失调导致肠道免疫细胞数量异常，肠道屏障功能受损，细菌感染风险增加，其机制可能与Lgr5蛋白表达失调及紧密连接破坏有关。

Abstract

Objective To investigate the effects of 4‑diethylaminobenzaldehyde （DEAB） on the intestinal epithelial barrier in mice and to explore the underlying molecular mechanisms. Methods A total of 12 adult male C57BL/6 mice were randomly divided into a control group and a DEAB group. The DEAB group received intraperitoneal injections of 10mg∙kg^‑1∙bw^‑1 DEAB， and the control group received intraperitoneal injections of corn oil. After 7 days， H&E staining and PAS staining were performed to observe histopathological changes in mice intestinal tissues. Immunofluorescence staining was used to measure the expression levels of Lgr5 and ZO‑1 proteins in the intestinal epithelium. RT‑PCR was employed to detect mRNA expression levels of IL‑22， Reg3γ， Reg3β， and Lgr5 in intestinal epithelial cells. Flow cytometry was used to quantify CD11c⁺MHC‑Ⅱ⁺ cells and CD3⁺ cells in the intestinal lamina propria lymphocytes. The bacterial load in mesenteric lymph nodes and spleen was assessed using plate counting. Results Compared to the control group， DEAB‑treated mice exhibited significantly shorter intestinal villi， increased inflammatory cells， and reduced goblet cells （P<0.05）. The expression of Lgr5 and ZO‑1 proteins in intestinal crypts was significantly decreased （P<0.01）. The mRNA expression levels of IL‑22， Reg3γ， and Reg3β in intestinal epithelial cells were significantly elevated （P<0.05）， and the mRNA expression level of Lgr5 was decreased （P<0.05）. The numbers of CD11c⁺MHC‑Ⅱ⁺ cells and CD3⁺ cells in the intestinal lamina propria lymphocytes were significantly increased （P<0.05）. The bacterial load in mesenteric lymph nodes and spleen was significantly elevated （P<0.01）. Conclusion Dysregulation of the retinoic acid metabolic pathway leads to abnormal numbers of intestinal immune cells， impaired intestinal barrier function， and increased risk of bacterial infection. The underlying mechanism may be associated with dysregulated Lgr5 protein expression and disruption of tight junctions.

Graphical abstract

关键词

视黄酸 / 4‑二乙氨基苯甲醛（DEAB） / Lgr5 / 肠道感染

Key words

Retinoic acid / 4‑diethylaminobenzaldehyde （DEAB） / Lgr5 / Intestinal infection

肠道上皮屏障作为机体防御病原体入侵的第一道防线，上皮细胞间紧密连接的动态调控、干细胞维持与分化的平衡以及黏膜免疫稳态起到重要作用^［1，2］。ALDH家族酶（尤其ALDH1A亚型）介导的视黄酸（retinoic acid，RA）合成通过调控树突状细胞分化、T细胞极化及黏膜屏障完整性，成为连接先天免疫与适应性免疫的关键分子^［3］。研究表明，维生素A代谢产物RA可通过激活视黄酸受体（RAR/RXR）信号通路，调控干细胞分化，影响免疫细胞分化以及功能^［4］。二乙氨基苯甲醛（4‑diethylaminobenzaldehyde，DEAB）是一种特异性ALDH1A抑制剂，可通过阻断视黄醛向RA的转化干扰RA信号通路^［5］。现有研究多聚焦DEAB在肿瘤干细胞中的调控作用，但其对肠道RA代谢及屏障功能的影响尚未系统阐明。

本研究旨在揭示DEAB通过抑制ALDH1A介导的RA合成、破坏肠道屏障增加肠道感染易感性的具体分子机制。通过建立DEAB干预的动物实验，明确DEAB‑ALDH1A‑RA轴对肠道屏障功能的调控，为RA调控肠道屏障功能提供新的分子机制，也为肠道细菌感染等疾病治疗提供新的治疗思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂

12只8周SPF级C57BL/6雄性小鼠购于重庆腾鑫生物技术限公司，体质量（20±2） g。12 h交替照明，温度保持在22~26 ℃，自由获取食物和水，按照《实验动物许可管理办法》和《实验动物管理条例》的相关规定进行实验。本实验获得西南医科大学实验动物伦理委员会批准，伦理审查号：20221002‑003。

DEAB购于美国selleck公司；H&E染色试剂盒以及PAS染色试剂盒、CD11c、MHC‑Ⅱ、CD3流式抗体购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司；ZO‑1、Lgr5抗体购于美国ABCAM公司；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购于南京诺维赞有限公司；HANKs培养基、HEPES、EDTA。LPL消化液配置：1640培养基、Liberase酶、DNasel，购于西格玛（上海）贸易有限公司。

1.2 DEAB药物干预

DEAB溶于DMSO保存，DEAB给予剂量为10 mg∙kg^‑1∙bw^‑1，采用玉米油稀释（DMSO浓度为0.2%）给予小鼠腹腔注射。隔天注射1次，共2次，第7天麻醉后处死小鼠进行取样。对照组采用同样浓度DMSO的玉米油进行腹腔注射^［6］。

1.3 H&E染色、PAS染色

处死小鼠取新鲜肠道组织（回肠末端部分），10%甲醛固定20 h，脱水、透明、浸蜡和包埋，组织切片（4 μm），按H&E染色试剂盒以及PAS染色试剂盒说明书处理后续步骤。

1.4 荧光定量PCR方法检测

分段取小鼠空回肠部分组织，采用HANKs上皮细胞消化液37 ℃震荡消化5 min，收取上清悬浮细胞进行离心采集。将收集细胞按照RNA提取试剂盒说明书提取RNA，测定RNA纯度浓度。取1.5 μg总RNA，按逆转录试剂盒合成cDNA，将cDNA进行PCR扩增。反应体系10 μL∶5 μL SYBR Mix，1 μL cDNA模板，1 μL目标基因引物，3 μL H₂O。观察溶解曲线保证引物特异性，以β‑actin为内参基因，使用2^-△△Ct法计算IL‑22、Reg3β、Reg3γ、Lgr5 mRNA相对表达水平，引物序列见表1。

1.5 流式细胞检测

分段取小鼠空回肠部分组织，收取上皮细胞后，剪碎组织，加入LPL消化液，37 ℃震荡消化30 min，收取上清悬浮细胞进行离心采集^［7］。采用流式上样液稀释流式抗体染色细胞，室温30 min，离心清洗，上机检测肠道固有层淋巴细胞中CD11c⁺MHC‑Ⅱ⁺细胞、CD3⁺细胞数量。

1.6 组织免疫荧光染色

取小鼠回肠组织，置于4%多聚甲醛24 h。梯度脱水（50%~100%乙醇）、透明化处理后石蜡包埋，进行切片，厚度5 μm，室温保存。将切片二甲苯脱蜡、梯度脱水后，枸橼酸钠缓冲液中，95 ℃水浴加热20 min进行抗原修复。采用2.5% BSA室温封闭30 min，孵育一抗（ZO‑1 1∶200，Lgr5 1∶200），4 ℃过夜。PBS清洗后，二抗室温孵育2 h。PBS清洗后，DAPI染色5 min。上机观察肠道上皮组织Lgr5、ZO‑1蛋白表达量。

1.7 小鼠组织载菌量检测

采用平板法测量，将组织置于2 mL无菌EP管，按照重量体积比1 g∶10 mL PBS使用组织匀浆仪进行处理（60 Hz，30 s）。采用PBS将匀浆液稀释到不同浓度，取30 μL均匀涂抹LB琼脂板。37 ℃培养24 h后对菌落进行计数，并计算肠系膜淋巴结以及脾脏实际组织载菌量。

1.8 统计学处理

采用SPSS 24.0软件进行统计学分析。计量资料以\overline{x}\pm s表示。组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠肠道病理形态表现

DEAB是一种特异性ALDH1A抑制剂，直接影响RA通路的调控功能^［8］。为研究DEAB对小鼠肠道的病理影响，将小鼠肠道进行H&E染色和PAS染色。DEAB组小鼠肠道结构形态改变，小肠绒毛间隙增宽，上皮绒毛长度相较于对照组小鼠明显缩短（P<0.05），见图1A、B。杯状细胞参与肠道屏障维稳，预防肠道细菌入侵。PAS染色显示，DEAB组小鼠肠道杯状细胞相较于对照组小鼠明显减少（P<0.01），见图1A、C。组织病理染色显示DEAB组小鼠肠道屏障受损。

2.2 小鼠肠道Lgr5、ZO‑1蛋白表达

病理染色结果显示DEAB组小鼠肠道绒毛变短，可能与肠道上皮干细胞的增殖、分化和组织更新受损有关。Lgr5蛋白是隐窝底部肠道干细胞的标志物，作为Wnt/β‑catenin信号通路的受体，其激活可促进干细胞自我更新及下游细胞增殖^［9］。为进一步验证肠道屏障功能受损的机制，将肠道上皮组织进行ZO‑1、Lgr5免疫荧光染色，结果显示DEAB组小鼠紧密连接蛋白ZO‑1表达明显降低（P<0.01），隐窝Lgr5蛋白表达明显降低（P<0.01），提示DEAB导致小鼠肠道屏障功能受损可能与Lgr5与ZO‑1蛋白调控有关，见图2A~C。

2.3 各组小鼠肠道Lgr5、Reg3β、Reg3γ、IL‑22 mRNA表达水平

为进一步验证DEAB处理小鼠肠道易感情况，将肠道上皮细胞消化提取RNA，进行RT‑PCR实验，检测感染相关基因Reg3β、Reg3γ、IL‑22 mRNA表达量，发现DEAB组小鼠感染相关基因明显增加（P<0.05），提示DEAB组小鼠肠道免疫细胞增殖，可能存在细菌侵入感染，见图3A~C。同时验证DEAB是否调控肠道上皮Lgr5蛋白的转录水平，结果显示DEAB组小鼠肠道上皮细胞Lgr5 mRNA表达量明显降低（P<0.05），见图3D。

2.4 各组小鼠肠道固有层免疫细胞数量水平及组织载菌量

DEAB组小鼠肠道屏障受损，细菌侵入肠道组织。肠道黏膜是体内重要的免疫组织，有大量的免疫细胞在肠道分化、增殖、驻守^［10］。采用流式细胞术检测相关免疫细胞的参与，发现DEAB组小鼠CD3⁺细胞（T细胞）、CD11c⁺MHC‑Ⅱ⁺细胞（MHC‑Ⅱ阳性树突状细胞）明显增多（P<0.05），见图4A~D。进一步检测，DEAB小鼠肠系膜淋巴结以及脾脏组织载菌量明显增多（P<0.01），见图4E。

3 讨论

肠道黏膜屏障作为人体最大的接触外界的界面，维持其稳态至关重要，其功能完整性研究具有理论价值和临床意义。肠道上皮细胞完整性以及黏膜免疫细胞屏障是其重要的构成部分。肠道上皮的紧密连接是维持肠道屏障功能的关键结构，ZO‑1属于膜相关鸟苷酸激酶蛋白家族，直接结合紧密连接的跨膜核心蛋白Claudins家族蛋白和Occludin家族蛋白^［11］。肠道上皮细胞ZO‑1表达异常，可导致肠道通透性增加，肠道致病菌易位引发慢性炎症^［12］。同时，肠道干细胞正常的自我更新以及分化能力对维持肠道上皮屏障稳态具有重要作用^［13］。

RA作为维生素A的活性代谢物，是调控树突状细胞功能的关键信号分子，其通过RARα/RXR异二聚体激活转录，诱导表达RA代谢酶ALDH1A^［14］。肠道上皮细胞是代谢维生素A生成RA的主要场所^［15］。Wang等^［16］研究发现，肠道共生菌可调节肠道上皮细胞ALDH1A2酶水平升高，从而诱导RA代谢增强。RA对免疫细胞功能的影响研究较多，其对肠道黏膜屏障的影响则尚未明确。本研究采用特异性ALDH1A抑制剂DEAB研究RA对肠道黏膜屏障的影响。DEAB小鼠对比正常小鼠，肠道上皮结构破坏严重，肠道上皮绒毛长度明显变短，同时肠道杯状细胞明显减少。肠道杯状细胞分泌黏液阻止肠道细菌直接接触上皮细胞，抑制致病菌如变形菌定植肠道^{［17，18］}。Lgr5是肠道干细胞的关键标志物，其调控肠道干细胞持续分化为肠道上皮细胞，维持肠道上皮细胞再生速率。研究表明，Lgr5表达缺失会导致上皮细胞更新受阻，肠道通透性增加，同时Lgr5可调控ZO‑1等蛋白的表达，影响肠道上皮屏障的稳态^［19］。本研究证实了DEAB小鼠肠道Lgr5蛋白表达明显降低，提示肠道上皮细胞RA通路对肠道上皮干细胞功能具有调节作用。进一步研究提示，DEAB小鼠肠道上皮细胞紧密连接蛋白ZO‑1明显下调，证明RA通路对肠道上皮细胞屏障的调控。

肠道黏膜屏障功能的稳态是影响肠道菌群定植的重要因素。肠道IL‑22细胞因子主要由ILC3细胞以及Th22细胞产生^［20］。Serafini等^［21］研究发现，ILC3细胞在肠道可抵御肠道致病菌，其中活化ILC3分泌IL‑22起到关键作用。当肠道上皮受损时，肠道IL‑22分泌水平迅速上升，同时IL‑22可促进肠道黏液及抗菌素Reg3γ、Reg3β的分泌^［22］。为验证DEAB小鼠肠道屏障受损后存在肠道内细菌侵入，本研究对肠道相关验证因子及免疫细胞进行了检测。结果提示，DEAB小鼠肠道IL‑22、Reg3γ、Reg3β mRNA表达明显升高，提示肠道菌群侵入。在肠道免疫细胞的检测中，DEAB小鼠肠道T细胞及MHC‑Ⅱ阳性树突状细胞明显升高，提示肠道细菌入侵黏膜免疫系统被激活。

本研究旨在利用特异性ALDH1A抑制剂DEAB研究RA通路对肠道黏膜屏障的影响，验证了RA通路对肠道上皮结构、肠道上皮干细胞更新具有调控作用及RA通路对于预防肠道菌群入侵的重要性。本研究也存在一定局限性，未来研究可以利用肠道上皮细胞特异性敲除基因鼠进一步验证RA相关蛋白对于肠道黏膜屏障的调节作用。

作者贡献度说明：

袁谢芳：经费支持和进行实验指导；蓝楠：论文撰写、图表制作核对；唐红梅、李柏均：实验操作；李月蛟、王孝芸：辅助实验操作。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(82001703)

四川省自然科学基金(2023NSFSC1620)