基于PARP9‑DTX3L/Notch轴探讨平喘颗粒抑制树突状细胞成熟的机制研究

Mechanism of Pingchuan Granules in inhibiting dendritic cell maturation via the PARP9‑DTX3L/Notch Axis

摘要

目的 观察平喘颗粒对PARP9‑DTX3L/Notch轴介导的树突状细胞成熟的影响，从而明确其抑制哮喘气道炎症的分子机制。 方法 采用粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素‑4诱导C57BL/6J小鼠骨髓源单个核细胞分化为树突状细胞，并用肿瘤坏死因子‑α刺激建立体外成熟模型。实验分为空白组、模型组、平喘颗粒组、抑制剂组及抑制剂+平喘颗粒组。通过倒置显微镜观察细胞形态；流式细胞术检测树突状细胞纯度及表面分子CD80、CD86、MHC‑Ⅱ、FcεRI的表达；Western blot和RT‑qPCR检测PARP9、DTX3L、N1ICD蛋白及mRNA表达，并分析N1ICD核质转位；免疫共沉淀检测PARP9‑DTX3L相互作用、N1ICD泛素化及Ub的ADP核糖基化水平。 结果 与模型组相比，平喘颗粒含药血清能明显抑制树突状细胞成熟并降低CD80、CD86、MHC‑Ⅱ及FcεRI的表达水平（P<0.01）。在分子水平层面，平喘颗粒可下调树突状细胞中PARP9、N1ICD蛋白及PARP9、Hes1、Hes5、Hey1 mRNA的表达水平（P<0.01），并抑制N1ICD入核（P<0.05），而对DTX3L蛋白及mRNA表达和Notch1 mRNA表达无明显影响（P>0.05）。此外，平喘颗粒可抑制PARP9与DTX3L的相互作用，降低Ub的ADP核糖基化修饰及促进N1ICD的泛素化修饰水平，差异具有统计学意义（P<0.01）。 结论 平喘颗粒能有效抑制树突状细胞的成熟，其机制可能与干扰PARP9‑DTX3L复合物形成，进而抑制Notch信号通路N1ICD的激活、核转位及其下游靶基因转录有关。

Abstract

Objective To investigate the effects of Pingchuan Granules on dendritic cell maturation mediated by the PARP9‑DTX3L/Notch axis， thereby elucidating its molecular mechanism in inhibiting airway inflammation in asthma. Methods Bone marrow‑derived mononuclear cells from C57BL/6J mice were differentiated into dendritic cells using granulocyte‑macrophage colony‑stimulating factor and interleukin‑4， and an in vitro maturation model was established by stimulation with tumor necrosis factor‑α. The experiment included the control group， the model group， the Pingchuan Granule group， the inhibitor group， and the inhibitor+Pingchuan Granule group. Cell morphology was observed under an inverted microscope. Flow cytometry was employed to detect dendritic cell purity and the expression of surface molecules CD80， CD86， MHC‑Ⅱ， and FcεRI. Western blot and RT‑qPCR were used to measure the expression of PARP9， DTX3L， and N1ICD at both protein and mRNA levels， and the nucleocytoplasmic translocation of N1ICD was analyzed. Co‑immunoprecipitation was performed to detect the PARP9‑DTX3L interaction， N1ICD ubiquitination， and the ADP‑ribosylation level of Ub. Results Compared to the model group， Pingchuan Granule‑containing serum significantly inhibited dendritic cell maturation and reduced the expression levels of CD80， CD86， MHC‑Ⅱ， and FcεRI （P<0.01）. At the molecular level， Pingchuan Granules downregulated the expression of PARP9 and N1ICD proteins， as well as the mRNA levels of PARP9， Hes1， Hes5， and Hey1（P<0.01）， and inhibited the nuclear import of N1ICD （P<0.05）， whereas they had no significant effect on the protein and mRNA expression of DTX3L as well as the mRNA expression of Notch1 （P>0.05）. Furthermore， Pingchuan Granules significantly inhibited the interaction between PARP9 and DTX3L， reduced the levels of ADP‑ribosylation of Ub， and promoted the ubiquitination of N1ICD， with all differences being statistically significant （P<0.01）. Conclusion Pingchuan Granules can effectively inhibit the maturation of dendritic cells， its mechanism may be related to interfering with the formation of the PARP9‑DTX3L complex， thereby suppressing the activation and nuclear translocation of N1ICD in the Notch signaling pathway， and the transcription of its downstream target genes.

Graphical abstract

关键词

平喘颗粒 / 树突状细胞 / Notch信号通路 / PARP9‑DTX3L复合物 / 哮喘

Key words

Pingchuan Granules / Dendritic cell / Notch signaling pathway / PARP9‑DTX3L complex / Asthma

支气管哮喘是一种以慢性气道炎症、气道高反应性及可逆性气流受限为特征的常见慢性呼吸道疾病，其病理过程与2型免疫应答异常激活密切相关^［1］。树突状细胞作为体内的专职抗原提呈细胞，通过连接固有免疫与适应性免疫，在哮喘免疫应答的启动中发挥核心作用^［2，3］。在吸入性变应原及局部炎症因子［如肿瘤坏死因子‑α（tumor necrosis factor‑α，TNF‑α）］的作用下，树突状细胞被活化并成熟，其表面CD80、CD86及主要组织相容性复合体Ⅱ类分子（major histocompatibility complex class Ⅱ，MHC‑Ⅱ）等共刺激分子和抗原提呈相关分子的表达明显上调^［4］。成熟树突状细胞迁移至引流淋巴结，通过提呈抗原并提供共刺激信号，驱动初始CD4⁺T细胞向2型辅助性T细胞（T helper 2 cells，Th2）细胞分化，进而促进白细胞介素（interleukin，IL）‑4、IL‑5、IL‑13等细胞因子释放，最终导致嗜酸性粒细胞浸润、黏液过度分泌及气道结构重塑等典型病理改变^［5］。因此，干预树突状细胞的成熟过程，是调控哮喘Th2型炎症的重要策略。

Notch信号通路在免疫细胞的发育、分化及功能调控中具有重要作用，其异常活化与多种炎症性疾病相关^［6］。课题组前期研究发现，平喘颗粒能抑制Notch信号通路的活化，从而减轻哮喘气道炎症^［7］。近年来研究表明，单ADP核糖基转移酶9［poly（ADP‑ribose）polymerase 9，PARP9］与E3泛素连接酶Deltex 3样蛋白（deltex E3 ubiquitin ligase 3L，DTX3L）可形成功能复合物，该复合物通过其ADP核糖基转移酶与E3泛素连接酶活性，参与调控包括Notch通路在内的关键信号转导过程^［8，9］。然而，该复合物是否在哮喘树突状细胞异常活化中发挥作用，以及平喘颗粒是否通过调节PARP9‑ DTX3L/Notch轴影响树突状细胞功能，目前尚未明确。因此，本研究通过体外实验观察平喘颗粒对树突状细胞成熟表型、PARP9‑DTX3L/Notch信号轴关键分子表达及活化的影响，旨在从树突状细胞免疫调控视角，系统阐明平喘颗粒发挥抗哮喘作用的新机制，为中医药防治哮喘提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级C57BL/6J小鼠（雄性，6~8周龄），体质量18~22 g，购于河北固安赛业生物科技有限公司，许可证号：SCXK（冀）2021‑003。小鼠于SPF级动物房中适应性饲养1周，保持恒温恒湿，12 h明暗交替，自由摄食饮水。

1.2 药物与试剂

平喘颗粒由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室提供，药物组成为淫羊藿、炙麻黄、太子参、黄芪、五味子、款冬花、地龙、罂粟壳、知母，以上药材配伍比例为5∶2.5∶3.75∶3.75∶3.75∶3.75∶2.5∶1∶2.5。衣霉素购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司（货号：T101151）；红细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒购于碧云天生物科技有限公司（货号：C3702‑500ml、P0009、P0027）；RPMI‑1640培养基购于武汉普诺赛生命科技有限公司（货号：PM150141）；重组小鼠粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte‑macrophage colony‑stimulating factor，GM‑CSF）、IL‑4、TNF‑α购于美国Sigma‑Aldrich公司（货号：SRP3201、SRP3211、654245）；抗小鼠FITC标记的CD11c、PE标记的CD86抗体购于英国Abcam公司（货号：ab210308、ab320067）；APC标记的CD80、PerCP/Cyanine 5.5标记的MHC‑Ⅱ、HRP标记的羊抗兔抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司（货号：APC‑FcA98158、CPY5‑FcA65663、SA00001‑2）；APC/Cy7标记的CD11b、PE/Cy7标记的FcεRI抗体购于BioLegend（北京）生物科技有限公司（货号：101226、134318）；兔抗小鼠PARP9、DTX3L、N1ICD、Ubiquitin、ADP Ribose、β‑actin、Histone H3一抗购于美国CST公司（货号：20009、14795、4147、43124、89190、4967、9715）；蛋白A/G磁珠购于美国Thermo Fisher Scientific公司（货号：88802）；TRIzol试剂、PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购于日本TaKaRa公司（货号：9109、RR037A、RR820A）。

1.3 含药血清制备

小鼠随机分为空白组与平喘颗粒给药组。平喘颗粒给药组参照临床等效剂量换算，以平喘颗粒水溶液（31.2 g∙kg^-1∙d^-1）灌胃，空白组给予等体积蒸馏水，2次/d，连续7 d。最后一次灌胃1 h后，经腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，无菌条件下腹主动脉取血，静置后离心分离血清。血清于56 ℃水浴灭活30 min，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装后-80 ℃保存备用。

1.4 细胞分离与鉴定

无菌分离小鼠股骨与胫骨，用注射器冲出骨髓细胞。经红细胞裂解液处理后，用含10%FBS的RPMI‑1640完全培养基重悬，接种于培养皿。加入重组小鼠GM‑CSF（20 ng/mL）和IL‑4（10 ng/mL），于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。隔天半量换液，补充等量细胞因子。培养至第7天，收集悬浮及半贴壁细胞，即为富集的骨髓来源树突状细胞。采用流式细胞术，以CD11c和CD11b双阳性细胞比例鉴定树突状细胞纯度（目标纯度>85%）用于后续实验。

1.5 细胞分组与药物干预

实验分为以下5组：（1）空白（Control）组：正常培养的树突状细胞；（2）模型（Model）组：树突状细胞加入TNF‑α（20 ng/mL）刺激24 h诱导成熟；（3）平喘颗粒（PCG）组：树突状细胞先用10%平喘颗粒含药血清预处理2 h，再加入TNF‑α（20 ng/mL）共培养24 h；（4）抑制剂（Inhibitor）组：树突状细胞先用衣霉素（0.5 μg/mL）预处理2 h，再加入TNF‑α（20 ng/mL）共培养24 h；（5）抑制剂+平喘颗粒（Inhibitor+PCG）组：树突状细胞先用10%平喘颗粒含药血清与衣霉素（0.5 μg/mL）共同预处理2 h，再加入TNF‑α（20 ng/mL）共培养24 h。

1.6 指标检测

1.6.1 细胞形态

各组细胞干预结束后，置于倒置相差显微镜下观察并拍照记录细胞形态变化。

1.6.2 流式细胞术

收集各组细胞，PBS洗涤，分别与荧光标记的流式抗体（CD11c、CD11b、CD80、CD86、MHC‑Ⅱ、FcεRI）或相应同型对照抗体避光孵育。洗涤后重悬，上机检测。使用FlowJo软件分析CD11c⁺CD11b⁺细胞群中目标分子的阳性细胞百分比。

1.6.3 Western blot

收集细胞，提取总蛋白或使用核质分离试剂盒分别提取胞质和胞核蛋白。BCA法测定蛋白浓度。经SDS‑PAGE电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭后，分别加入一抗（PARP9、DTX3L、N1ICD、β‑actin、Histone H3）于4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后，加入相应HRP标记的二抗室温孵育1 h。ECL化学发光法显影，ImageJ软件分析条带灰度值，以目标蛋白与内参（β‑actin或Histone H3）的比值进行半定量分析。

1.6.4 RT‑qPCR

TRIzol法提取细胞总RNA，测定浓度与纯度。按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA。以cDNA为模板，采用SYBR Green法在实时荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。采用2^-ΔΔCt法计算PARP9、DTX3L、Notch1、Hes1、Hes5、Hey1 mRNA的相对表达量，以GAPDH为内参基因。引物序列见表1。

1.6.5 免疫共沉淀

收集细胞后，用含相应酶抑制剂的裂解液提取总蛋白。每组取等量蛋白，分为实验组与同型IgG阴性对照组。实验组分别加入抗DTX3L、抗N1ICD或抗PARP9抗体，4 ℃孵育过夜后，与Protein A/G磁珠结合以捕获免疫复合物。经充分洗涤，加入上样缓冲液煮沸洗脱。最后，通过Western blot分别检测洗脱产物中PARP9与DTX3L的共沉淀、N1ICD的泛素化条带以及Ub的ADP核糖基化水平，Input样品作为对照。

1.7 统计学处理

数据以SPSS 27.0软件分析，计量资料以\overline{x}\pm s表示。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两的比较采用LSD‑t检验。P<0.05为差异具统计学意义。

2 结果

2.1 树突状细胞分离及鉴定

采用流式细胞术鉴定分离得到的小鼠树突状细胞，其中树突状细胞（CD11c⁺CD11b⁺细胞）的纯度>90%，可进行后续实验（图1A）。倒置相差显微镜下可见，空白组细胞呈圆形，表面光滑，树突状突起短小，为典型未成熟形态。模型组经TNF‑α诱导后，胞体明显增大，伸出大量细长分支的树突状突起，呈星形，为成熟态典型特征。平喘颗粒组与抑制剂组形态相似，胞体增大不明显，树突状突起数量与长度明显减少，成熟形态受到明显抑制。在平喘颗粒与抑制剂联合干预下，抑制效果最为明显，细胞绝大多数保持圆形，表面光滑，树突状突起极少，形态最接近未成熟状态，表明二者在抑制树突状细胞成熟上可能具有协同效应（图1B）。

2.2 平喘颗粒对树突状细胞表型的影响

采用流式细胞术分别检测各组树突状细胞表面标记分子的表达水平。与空白组相比，模型组CD80、CD86、MHC‑Ⅱ、FcεRI的表达明显增加（P<0.01）。与模型组相比，平喘颗粒组、抑制剂组和抑制剂+平喘颗粒组树突状细胞的CD80、CD86、MHC‑Ⅱ和FcεRI的表达明显降低（P<0.01），见图2。

2.3 平喘颗粒对树突状细胞PARP9/DTX3L/N1ICD通路的影响

与空白组相比，模型组树突状细胞中PARP9和N1ICD蛋白的表达明显增加（P<0.01）。与模型组相比，平喘颗粒组、抑制剂组和抑制剂+平喘颗粒组树突状细胞中PARP9和N1ICD蛋白的表达明显降低（P<0.01）。而各组间DTX3L蛋白的表达未见明显改变，差异无统计学意义（P>0.05），见图3A。与空白组相比，模型组树突状细胞细胞质/细胞核中N1ICD的比值明显降低（P<0.01）。与模型组相比，平喘颗粒组、抑制剂组和抑制剂+平喘颗粒组树突状细胞细胞质/细胞核中N1ICD的比值明显增加（P<0.05），见图3B。

RT‑qPCR结果显示，与空白组相比，模型组树突状细胞中PARP9、Hes1、Hes5、Hey1 mRNA表达明显增加（P<0.01）。与模型组相比，平喘颗粒组、抑制剂组、抑制剂+平喘颗粒组树突状细胞中PARP9、Hes1、Hes、5Hey1 mRNA表达明显降低（P<0.01）。各组间DTX3L和Notch1 mRNA表达未见明显改变，差异无统计学意义（P>0.05），见图3C、D。

2.4 平喘颗粒对Ub的核糖基化和N1ICD泛素化修饰的影响

为分别检测PARP9‑DTX3L相互作用、N1ICD泛素化及Ub的ADP核糖基化，实验独立进行3组免疫共沉淀检测。与空白组相比，模型组树突状细胞中PARP9与DTX3L的相互作用明显增加，而游离的DTX3L的水平明显降低（P<0.01）。与模型组相比，平喘颗粒组、抑制剂组和抑制剂+平喘颗粒组树突状细胞中PARP9与DTX3L的相互作用明显降低，游离的DTX3L的水平明显增加（P<0.01），见图4A。

此外，免疫共沉淀结果显示，与空白组相比，模型组树突状细胞中Ub的ADP核糖基化修饰水平明显增加，N1ICD蛋白的泛素化修饰水平明显降低（P<0.01）。与模型组相比，平喘颗粒组、抑制剂组和抑制剂+平喘颗粒组树突状细胞中Ub的ADP核糖基化修饰水平明显降低，而N1ICD蛋白的泛素化修饰水平明显增加（P<0.01），见图4B、C。

3 讨论

Notch信号通路作为一条在进化上高度保守的细胞间通讯途径，主要由Notch受体、其跨膜配体、胞内DNA结合蛋白CSL（CBF‑1，Suppressor of hairless，Lag的合称）以及下游的靶基因效应分子（如Hes、Hey家族）等核心组件构成^［10］。在哺乳动物中，已鉴定出Notch1至Notch4 4种受体，以及包括Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3、DLL4在内的多种配体^［11］。Notch信号通路的激活机制始于相邻细胞表面Notch配体与受体的特异性结合，进而引发受体蛋白依次经历2次水解切割过程：首先由ADAM金属蛋白酶介导其胞外区的切割，随后由γ‑分泌酶复合物在跨膜区进行切割，最终释放出具有转录激活功能的Notch胞内结构域。该结构域迅速转运至细胞核内，与CSL蛋白及辅助激活因子如MAML等共同组装成转录激活复合体，进而启动下游靶基因的转录表达^［12］。活化的树突状细胞通过细胞接触依赖方式，向初始T细胞传递Jagged与Notch相互作用信号，进而与细胞因子信号如IL‑4协同作用，共同促进转录因子GATA3的表达及Th2型细胞因子包括IL‑4、IL‑5和IL‑13的生成^［13］。本研究结果进一步证实，在TNF‑α诱导的树突状细胞成熟过程中，Notch1信号通路被明显激活，具体表现为Notch1胞内结构域蛋白水平升高及其向细胞核内转位增加。而平喘颗粒能有效抑制上述激活过程，这一发现提示平喘颗粒可能通过干扰树突状细胞自身Notch信号通路的活化，影响其指导Th2细胞分化的能力。

ADP核糖基化是一种重要的可逆性翻译后修饰，由PARPs家族催化完成。该修饰过程以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）为底物，将一个或多个ADP核糖单元转移到靶蛋白的特定氨基酸残基上^［14］。根据催化产物的不同，PARPs可分为3类：仅催化单个ADP核糖单元转移的单ADP核糖基转移酶、催化形成长链ADP核糖聚合物的多聚ADP核糖聚合酶，以及功能尚不完全明确的非活性PARPs^［15］。PARP9，又称BAL1，是mono‑ARTs亚家族的重要成员。不同于PARP1主要参与DNA损伤修复，PARP9在免疫调节、抗病毒反应及肿瘤发生中显示出独特功能。它通过其催化结构域，将单个ADP核糖单元转移到靶蛋白上，快速改变靶蛋白的电荷、构象或与其他蛋白的互作能力，从而作为一种精密的分子开关，调控信号转导^［16］。

泛素化作为一种广泛存在且高度复杂的蛋白质翻译后修饰系统，参与并调控包括蛋白质降解、信号转导、膜运输及DNA修复在内的几乎所有关键细胞生命活动^［17］。该过程通过E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶依次催化的三级酶促反应完成。其中，E3泛素连接酶负责特异性识别底物蛋白，并催化泛素分子从E2酶转移至底物，因此是决定泛素化修饰靶向特异性的核心因素^［18］。DTX3L属于Deltex家族成员，是一种具有E3泛素连接酶活性的蛋白质^［19］。然而，ADP核糖基化与泛素化这两种修饰途径并非彼此独立，而是存在着密切的相互作用与交叉调控^{［20，21］}。研究证实，PARP9可催化其自身或结合伴侣如DTX3L发生ADP核糖基化修饰，通过改变底物构象或招募特定的阅读蛋白，进而影响DTX3L对其下游底物的识别及泛素化修饰效率^［22］。相反，DTX3L介导的泛素化修饰亦可能对PARP9的蛋白稳定性、酶活性或亚细胞定位起到调控作用^［23］。本研究结果显示，在树突状细胞成熟过程中，PARP9与DTX3L之间的相互作用明显减弱，同时伴随Ub的ADP核糖基化水平的增加以及Notch1胞内结构域的泛素化修饰水平的降低。平喘颗粒的干预能明显促进PARP9与DTX3L之间的相互作用和N1ICD蛋白的泛素化修饰水平，并抑制Ub的ADP核糖基化修饰水平。

综上所示，本研究揭示，平喘颗粒可通过下调PARP9表达，破坏PARP9‑DTX3L复合物功能，进而抑制Notch信号通路中N1ICD的核转位及其下游靶基因转录，从而阻断树突状细胞成熟。该发现为阐明平喘颗粒治疗哮喘的免疫学机制提供了新依据，也为靶向PARP9‑DTX3L轴治疗免疫性疾病提供了新思路。

作者贡献度说明：

袁星星：实验设计；尹兴梅、刘忱阳：完成实验；王瑶：指标检测；李超凡、袁星星：统计实验数据，并撰写论文。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金青年科学基金(82205007)

哈尔滨市科技局科研项目(2023ZCZJNS091)