骨骼肌Osteonectin介导肌源性因子调控促进青少年特发性脊柱侧凸成骨分化

Skeletal muscle osteonectin‑mediated myokine regulation promotes osteogenic differentiation in adolescent idiopathic scoliosis

摘要

目的 探讨青少年特发性脊柱侧凸（adolescent idiopathic scoliosis，AIS）椎旁肌分泌的骨粘连蛋白（osteonectin）表达特征及其对成骨分化的影响，为阐明AIS脊柱椎旁肌肌源性因子调控异常提供依据。 方法 采用多重免疫法检测对照组与AIS患者外周血及主弯顶椎区凹、凸侧椎旁肌中多种肌源性因子水平；免疫组织化学和qPCR检测两侧椎旁肌中osteonectin蛋白与mRNA表达。体外肌‑骨共培养模型：慢病毒感染人骨骼肌细胞系（human skeletal muscle myoblasts，HSMM）过表达osteonectin并诱导肌管分化。收集培养基上清后，制备过表达条件培养基（OE‑CM组）与普通HSMM条件培养基（CM组）用于孵育AIS原代成骨细胞。通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色及qPCR评估osteonectin对成骨分化的影响。 结果 多重免疫检测结果显示，与对照组相比，AIS患者外周血中osteonectin、脂肪酸结合蛋白3、促红细胞生成素水平明显下降（P<0.05）。免疫组织化学结果显示AIS顶椎区椎旁肌osteonectin蛋白表达下降，且凹侧明显低于凸侧（P<0.01）；qPCR与多重免疫检测进一步证实凹侧osteonectin mRNA与蛋白表达低于凸侧（P<0.05）。OE‑CM组AIS原代成骨细胞ALP阳性染色较CM组明显加深；qPCR结果显示，OE‑CM组成骨细胞中ALP、RUNX2、COL1A1 mRNA水平明显上调（P<0.001）。 结论 AIS患者外周血多种肌因子表达异常，凹、凸侧椎旁肌分泌功能失衡；osteonectin可通过增强ALP活性并上调成骨相关基因表达，促进AIS原代成骨细胞分化，提示osteonectin介导的肌源性因子调控可能通过影响骨代谢参与AIS的发生与进展。

Abstract

Objective To investigate the expression characteristics of paraspinal muscle‑derived osteonectin in adolescent idiopathic scoliosis （AIS） and its effect on osteogenic differentiation， providing evidence for elucidating aberrant myokine regulation of paraspinal muscles in AIS. Methods Multiplex immunoassays were used to measure multiple myokines levels in peripheral blood and the concave and convex sides of apical vertebra paraspinal muscle of the control and AIS patients. Immunohistochemistry and qPCR were used to assess protein and mRNA expressions of osteonectin in bilateral paraspinal muscles. An in vitro muscle‑bone co‑culture model was established using human skeletal muscle myoblasts （HSMM） infected with lentivirus to overexpress osteonectin and induce myotube differentiation. After collecting the culture medium supernatant， conditioned medium from osteonectin‑overexpressing cells （OE‑CM group） and regular HSMM‑conditioned medium （CM group） were prepared to culture primary AIS osteoblasts. The effects of osteonectin on osteogenic differentiation were evaluated by alkaline phosphatase （ALP） staining and qPCR. Results The results of multiplex immunoassays indicated that the levels of osteonectin， fatty acid‑binding protein 3， and erythropoietin in the peripheral blood of the AIS patients were significantly decreased compared to the controls （P<0.05）. Immunohistochemistry revealed a reduced expression of osteonectin protein in AIS paraspinal muscles， with lower expression on the concave side than the convex side （P<0.01）. qPCR and multiplex immunoassays confirmed that the osteonectin mRNA and protein expressions were lower on the concave side than the convex side （P<0.05）. The ALP positive staining of primary AIS osteoblasts was significantly enhanced in the OE‑CM group compared to the CM group， and qPCR showed that the mRNA levels of ALP， RUNX2， and COL1A1 in osteoblasts of the OE‑CM group were significantly upregulated （P<0.001）. Conclusion AIS patients exhibit abnormal expression of multiple myokines in peripheral blood and imbalanced secretory function of the concave and convex sides of paraspinal muscle. Osteonectin promotes osteogenic differentiation of primary AIS osteoblasts by enhancing ALP activity and upregulating osteogenic gene expressions， suggesting that osteonectin‑mediated myokine regulation may contribute to the pathogenesis and progression of AIS through modulating bone metabolism.

Graphical abstract

关键词

青少年特发性脊柱侧凸（AIS） / 肌源性因子调控 / 肌源性因子 / Osteonectin / 成骨分化

Key words

Adolescent idiopathic scoliosis （AIS） / Myokine regulation / Myokines / Osteonectin / Osteogenic differentiation

［Author］ TIAN Wenlin， E‑mail： [e-mail].

青少年特发性脊柱侧凸（adolescent idiopathic scoliosis，AIS）是一种复杂的脊柱三维畸形，发病于青春期早期，青少年患病率约为1%~4%，且女性患病率明显高于男性^［1］。随着侧凸程度加重，AIS患者可能出现躯干外观不对称、心肺功能受限及心理社会问题，严重影响生长发育期青少年的生活质量^［2］。因此阐明AIS发生、发展机制并寻找新的干预靶点具有重要临床意义。

既往研究发现AIS的发生、发展与肌肉、骨骼、环境、基因、神经和激素等因素相关^［3‑8］。骨骼方面的研究表明，AIS患者普遍存在骨量减少及骨密度降低现象^［9］。此外，骨组织形态学研究表明，AIS患者普遍存在骨代谢异常^［10］。成骨细胞功能失调是骨代谢异常的核心环节之一。既往研究证实，与健康对照相比，AIS患者来源的原代成骨细胞表现出更低的分化与矿化能力^［11］。提示成骨细胞功能缺陷为核心的骨代谢异常可能是AIS发生、发展的重要因素。

越来越多的证据表明椎旁肌在AIS的发生、发展中扮演着至关重要的角色。现有研究发现，AIS患者的椎旁肌体积存在与侧凸的严重程度密切相关的左右不对称性^［12］。除此之外，其成分也发生了改变，如AIS椎旁肌的肌内脂肪含量也存在不对称性，且脂肪浸润程度与侧凸严重程度呈正相关^［13］。随着肌肉作为内分泌器官的研究逐渐深入，大量证据表明骨骼肌可分泌脑源性神经营养因子等多种肌源性因子，这些因子可通过旁分泌和内分泌等途径参与调节局部骨骼微环境，影响骨代谢^［14］。

肌‑骨交互是指骨骼与骨骼肌之间通过机械耦合、分泌因子（如肌因子、骨因子）等介导的双向通讯机制，这一过程不仅维持肌肉骨骼系统的稳态，还与衰老、多种代谢疾病密切相关^［15］。其中肌源性因子调控在肌‑骨交互中扮演重要角色。骨骼肌可分泌骨粘连蛋白（osteonectin，编码基因为SPARC）等肌源性因子，通过肌源性因子调控影响骨代谢^［14］。本研究聚焦骨骼肌分泌的osteonectin，探讨其介导的肌源性因子调控在AIS成骨分化中的作用，以期为AIS的发病机制及潜在早期干预靶点提供生物学证据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选择12~17岁女性AIS患者90例为实验组（AIS组），其中40例为侧凸进展患者，6年随访中Cobb角进展≥5°。同时选择74例年龄匹配且无其他系统疾病的女性外伤手术患者为对照组（CON组）。每位AIS患者经过2名经验丰富的脊柱外科医生的详细查体及影像学检查排除先天性脊柱侧凸及神经源性脊柱侧凸，每位CON组患者经详细体检排除任何类型的脊柱侧凸和可能影响骨代谢或肌源性因子水平的基础疾病。本研究方案经海南医科大学第一附属医院伦理委员会批准（伦理批准号：2025‑KYL‑162），所有受试者及其监护人签署知情同意书。

1.2 标本采集与处理

1.2.1 外周血血浆标本

所有受试者于清晨空腹状态下采集肘静脉血5 mL，置于含抗凝剂的真空采血管中，室温静置30 min后3 000 r/min离心10 min，分离上清血浆，分装于EP管中，-80 ℃冰箱保存备用，用于检测外周血多种肌源性因子水平。

1.2.2 椎旁肌及骨组织标本

AIS患者在全麻下行后路三维矫形融合内固定术时，于主弯顶椎水平经后正中切口暴露椎板，分别取自凹侧与凸侧相同节段、相同深度的椎旁肌组织（各约1 cm×1 cm×1 cm）及下关节突骨标本（各约1 cm×1 cm×0.5 cm）。标本分为两部分：一部分液氮速冻后转存-80 ℃冰箱，用于RNA与蛋白检测；另一部分置于4%多聚甲醛固定24~48 h，经脱水、石蜡包埋等处理后用于后续实验。CON组标本取自胸腰椎创伤行后路手术者，于未受累节段同水平获取双侧深部椎旁肌（约1 cm×1 cm×1 cm）及下关节突（约1 cm×1 cm×0.5 cm）。所有标本采集属正常手术流程范畴，不影响患者后续治疗实施与预后。

1.3 实验方法

1.3.1 多重免疫检测肌源性因子水平

样本于4 ℃缓慢融解（血浆需混匀；组织需称重后按比例加入预冷裂解液及蛋白酶抑制剂，匀浆后12 000 r/min离心15 min取上清）。采用Luminex系统及多重免疫检测试剂盒同时测定多种肌源性因子浓度，每个样本设置2个复孔，通过标准曲线计算各因子浓度，血浆结果以pg/mL表示。

1.3.2 免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）实验

将石蜡包埋椎旁肌组织切片（厚4 μm），常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，浸入枸橼酸钠抗原修复液，于65 ℃烘箱抗原修复过夜，3%过氧化氢室温避光孵育10 min。滴加 5%山羊血清封闭30 min后，加一抗4 ℃过夜孵育；次日加二抗孵育60 min，DAB显色，自来水充分冲洗后苏木精复染，脱水封片。每张切片随机选择5个高倍视野，采用ImageJ软件测定阳性表达面积百分比或平均光密度值进行半定量分析。

1.3.3 AIS原代成骨细胞的分离培养

在超净台内将脊柱截骨矫形内固定融合手术中分离的椎骨组织用无菌PBS 缓冲液漂洗3 次。在无菌培养皿中加入没过组织的DMEM/F12（含1%青、链霉素）基础培养基，用14 cm医用圆直组织剪将组织块剪成约1 mm³大小的细小颗粒，转移至无菌15 mL离心管中，用PBS缓冲液冲洗3次（1 000 r/min，离心5 min）。弃去PBS缓冲液，用含0.5 ng/mL D‑缬氨酸，10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基吹打重悬移至6孔细胞培养板中，置于37 ℃恒温、5% CO₂培养箱中培养1周后观察细胞是否具有成骨细胞的典型形态。

1.3.4 Osteonectin慢病毒转染及稳定株筛选

冰上融化osteonectin过表达慢病毒，按感染复数×细胞数/滴度计算用量；转染前1天接种细胞至20%~30%融合度；弃原培养基，加入含病毒及增强剂的感染液，混匀培养；感染16 h后更换完全培养基；感染48~72 h后观察荧光并检测表达；预实验确定2 d内杀死未感染细胞的最低嘌呤霉素浓度；感染48~72 h后加筛选浓度嘌呤霉素，48 h后未感染细胞死亡，保留感染细胞；嘌呤霉素降至维持浓度（1/2筛选浓度），扩增并鉴定osteonectin的表达效率；稀释至96孔板（约1个细胞/孔），扩增培养后加嘌呤霉素筛选，选择稳定表达株冻存，用于后续实验。

1.3.5 蛋白免疫印迹（Western blot）实验

采用裂解液充分裂解细胞后，收集于EP管中，于金属浴100 ℃加热10 min使蛋白变性；取制备好的样品上样进行SDS‑PAGE凝胶电泳约70 min，电泳结束后使用0.45 μm NC膜转膜；转膜完成后将NC膜置于5%脱脂奶粉中室温摇床封闭1 h，封闭后用TBST洗膜去除残余封闭液；随后将NC膜浸入含一抗的稀释液中，4 ℃摇床孵育过夜；回收一抗后用TBST洗膜3次，每次10 min；再按抗体稀释液配制合适浓度二抗，室温孵育1 h；最后用TBST摇床洗膜3次，每次10 min，加入化学发光底物后以化学发光成像系统曝光并获取条带信号。

1.3.6 酶联免疫吸附测定（enzyme‑linked immunosorbent assay，ELISA）实验

实验前将试剂盒各组分及样本置室温平衡30 min，按说明书要求配制标准品、洗液、生物素标记抗体工作液及HRP标记亲和素工作液。分别设标准品孔和样本孔，每孔加入标准品或待测样本100 μL，覆膜，37 ℃温育2 h。弃去孔内液体，甩干，不洗，每孔加入生物素标记抗体工作液100 μL，覆膜，37 ℃温育1 h。弃液甩干，洗板3次，每孔每次加入洗液200 μL，浸泡2 min。每孔加入HRP标记亲和素工作液100 μL，覆膜，37 ℃温育1 h。弃液甩干，洗板5次，每孔每次加入洗液200 μL，浸泡2 min。每孔加入TMB底物溶液90 μL，37 ℃避光显色15~30 min；随后每孔加入终止液50 μL终止反应。终止反应后5 min内，于450 nm波长下测定各孔OD值，根据标准曲线计算样本浓度，结果乘以相应稀释倍数。

1.3.7 体外肌‑骨共培养细胞模型的建立

当人骨骼肌细胞系（human skeletal muscle myoblasts，HSMM）细胞与过表达osteonectin的HSMM细胞融合度达70%~80%时，更换为含2%马血清的DMEM/F12分化培养基，诱导其分化为肌管。分化过程中每2 天分别收集2组培养上清，1 000×g离心10 min去除细胞碎片，于-80 ℃保存。分化第4天采用抗肌球蛋白重链抗体（MF20）进行免疫荧光染色，确认肌管形成。随后将收集的两组HSMM细胞上清分别与含10%胎牛血清的成骨细胞完全培养基按体积比1∶1混合，配制条件培养基（conditioned medium，CM组）与过表达osteonectin的条件培养基（overexpression conditioned medium，OE‑CM组），用于孵育AIS原代成骨细胞，以此构建体外肌‑骨共培养细胞模型。

1.3.8 免疫荧光染色

将细胞以每孔3×10⁴进行铺板培养48 h。固定：弃培养液，用PBS缓冲液漂洗1~2遍后加入4%多聚甲醛固定30 min，后PBS洗涤2~3次。添加0.5% Triton X‑100，室温通透15 min，加入5%牛血清白蛋白封闭液，室温封闭40 min。一抗孵育：抗体稀释液稀释一抗覆盖细胞，4 ℃摇床孵育过夜。清洗：PBS缓冲液洗涤2~3次。抗体稀释液稀释含荧光标记的二抗，室温避光孵育1 h。PBS 缓冲液洗涤3次。加入DAPI染液覆盖细胞染色5 min，PBS缓冲液洗涤3次，荧光显微镜拍照观察。

1.3.9 成骨细胞成骨分化诱导及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）染色

将AIS原代成骨细胞接种于6孔板中，待融合度达70%~80%时，分别更换CM或OE‑CM，并加入成骨诱导剂（β‑磷酸甘油10 mmol/L、抗坏血酸磷酸盐 50 mmol/L、地塞米松0.1 mmol/L）培养，培养基每2 天更换1次。诱导7 d后，弃培养基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，按ALP染色试剂盒说明书配制染色液，室温避光孵育6 h，流水冲洗，观察并拍照记录ALP阳性染色情况。

1.3.10 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real‑time PCR，qPCR）

采用TRIzol法提取总RNA并逆转录为cDNA，以GAPDH为内参，通过SYBR qPCR和2^-ΔΔCt法计算相对表达量。椎旁肌检测：取凹侧与凸侧冻存组织各约30 mg，检测SPARC扩增条件为95 ℃预变性2 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，共45个循环。成骨相关基因检测：收集CM组与OE‑CM组AIS原代成骨细胞，检测ALP、RUNX2、COL1A1等成骨分化相关基因的mRNA表达。扩增条件为95 ℃预变性2 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，共45个循环，各基因引物序列见表1。

1.4 统计学处理

使用GraphPad Prism 11进行统计学分析与图表绘制。所有实验包含技术性3次重复，所示数据来源于至少3次独立生物学重复。经正态性检验后，符合正态分布的计量资料以\overline{x}\pm s表示，2组间比较采用独立样本t检验；配对资料比较采用Wilcoxon符号秩检验。对于同一实验中涉及多个预设两两比较的结果，已经过Bonferroni法进行多重比较校正，并以校正后的P值判断统计学差异。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AIS 外周血肌源性因子的表达水平

通过多重免疫法检测CON组和AIS组外周血血浆中osteonectin等多种肌源性因子的表达，临床信息见表2。结果显示，AIS组osteonectin，促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）、脂肪酸结合蛋白3（fatty acid‑binding protein 3，FABP3）表达水平明显低于CON组（P<0.05），见图1A~C。以上结果提示AIS患者体内肌肉的分泌功能可能存在异常。骨骼肌可通过分泌osteonectin调节骨代谢，故本研究后续将重点聚焦于该因子。

2.2 AIS主弯顶椎区凹、凸侧椎旁肌osteonectin表达水平异常

基于AIS患者外周血中osteonectin表达异常的现象，为了探究osteonectin在局部肌源性因子调控微环境中的表达特征，本研究以IHC检测AIS组主弯顶椎区凹、凸侧椎旁肌及CON组双侧椎旁肌组织的osteonectin蛋白表达水平，并对阳性染色面积进行半定量分析。结果显示，与CON组相比，AIS组主弯顶椎区凹侧椎旁肌和凸侧椎旁肌中osteonectin蛋白表达水平明显降低（P<0.001）；与凹侧相比，凸侧肌组织中osteonectin蛋白表达明显升高（P<0.01），见图2A、B。该结果表明AIS主弯顶椎区椎旁骨骼肌组织中osteonectin的表达水平异常且凹、凸侧存在失衡。

为进一步验证AIS主弯顶椎区凹、凸双侧椎旁肌中osteonectin的转录水平，采用qPCR检测10例AIS患者凹、凸双侧椎旁肌组织中SPARC mRNA表达。结果显示，凹侧SPARC mRNA水平较凸侧明显降低（P<0.001），见图3A。进一步通过多重免疫检测检测8例CON组与17例AIS组双侧椎旁肌中osteonectin的蛋白表达，发现凹侧表达明显低于凸侧（P<0.05），见图3B。上述结果证实，AIS主弯顶椎区凹、凸侧椎旁肌osteonectin的转录和蛋白水平存在明显失衡。

2.3 骨骼肌分泌的osteonectin对AIS脊椎成骨细胞分化的作用

基于AIS外周血及凹、凸侧椎旁肌中osteonectin表达水平存在异常这一现象，为进一步研究骨骼肌分泌的osteonectin介导的肌源性因子调控在AIS成骨分化中的作用，本研究基于HSMM与AIS原代细胞构建了肌‑骨共培养细胞模型，见图4A。在HSMM分化4 d后，通过免疫荧光染色标记MF20对肌管分化情况进行鉴定，结果显示HSMM细胞已形成成熟肌管结构，见图4B。本研究从AIS主弯顶椎区椎骨骨组织中分离培养获得原代成骨细胞，并通过RUNX2和COL1A1的免疫荧光染色进行鉴定，确认所获得的细胞为成骨细胞，见图4C。

为明确骨骼肌分泌的osteonectin在肌‑骨调控中的作用，本研究通过慢病毒感染构建了osteonectin稳定过表达的HSMM细胞模型。Western blot结果显示，与CON组相比，过表达组（OE组）中osteonectin蛋白表达水平明显升高（P<0.05），见图5A。ELISA结果进一步显示，OE‑CM组中osteonectin的分泌水平明显高于CM组，表明过表达构建成功（P<0.05），见图5B。

为评估osteonectin对AIS成骨细胞分化的影响，本研究在上述肌‑骨共培养细胞模型基础上分别采用CM组和OE‑CM组培养AIS原代成骨细胞。ALP染色结果显示，与CM组相比，OE‑CM组AIS原代成骨细胞中呈现出更强的ALP阳性染色，见图6A。该结果表明，OE‑CM可明显增强ALP活性，从而促进AIS原代成骨细胞的成骨分化。进一步通过qPCR检测OE‑CM对成骨分化关键基因的调控作用。结果显示OE‑CM组原代成骨细胞的成骨分化标志物ALP、RUNX2、COL1A1 mRNA水平明显高于CM组（P<0.001），见图6B~D。以上结果提示，骨骼肌分泌的osteonectin可通过刺激ALP、RUNX2、COL1A1等成骨分化关键因子转录发挥促进成骨分化的作用。

3 讨论

AIS的发病机制复杂，涉及遗传、环境和代谢等多重因素^［16］。脊柱是由椎旁肌与骨骼构成的功能单元，肌肉与骨骼协同维持脊柱结构与生理稳定。肌肉通过分泌因子介导的肌源性因子调控在AIS发生与进展中的作用尚不明确。本研究发现AIS患者外周血及主弯顶椎区椎旁肌中osteonectin、EPO、FABP3等多种肌源性因子表达水平异常，且呈明显的凹、凸双侧失衡现象。进一步通过构建体外肌‑骨共培养模型，证实骨骼肌细胞来源的osteonectin能明显促进成骨细胞的早期分化，上调ALP、RUNX2、COL1A1等成骨关键基因的表达。这些证据共同提示，椎旁肌分泌功能紊乱导致的局部肌源性因子调控异常，可能是AIS发生、发展的重要机制之一。

既往研究报道AIS患者椎旁肌存在肌纤维类型、横截面积等方面的结构不对称，且与侧凸严重程度相关^{［17，18］}。AIS患者凹侧与凸侧椎旁肌承受的力学环境存在明显差异^［19］，且体外及动物模型研究已证实，机械负荷状态可明显调节肌源性因子的表达水平^{［20，21］}。此外，局部微环境中的炎症反应、神经支配异常、代谢改变等因素，也可能参与调控椎旁肌的肌源性因子表达。本研究结果证实AIS凹、凸双侧椎旁肌osteonectin等肌源性因子表达失衡的现象。然而，目前导致这种分泌功能失调的具体机制仍有待进一步研究。

研究表明AIS患者成骨分化受损。Park等^［22］发现AIS患者骨髓间充质干细胞的成骨分化能力明显低于健康对照组；Li等^［3］则从分子层面证实AIS患者成骨存在分化受损的现象。肌源性因子在调控成骨分化中扮演重要角色。Jaśkiewicz等^［23］的综述系统梳理了肌源性因子对骨代谢的影响，明确指出irisin、BDNF、myostatin等多种肌源性因子可通过旁分泌途径调控成骨细胞功能。近期研究证实BDNF为促进成骨细胞分化的肌源性因子^［24］。Irisin已被证实通过p38 MAPK信号通路促进成骨细胞分化^［25］，以上研究为肌源性因子调控成骨细胞功能提供了直接证据。与既往研究一致的是，本研究通过体外肌‑骨共培养模型阐明了骨骼肌分泌的osteonectin对成骨细胞分化具有明显的促进作用。

然而，本研究仍存在一定局限性。第一，本研究纳入的AIS患者和健康对照组均为女性，研究结果主要反映女性AIS人群中osteonectin表达异常及其对成骨分化的影响，未来仍需纳入男性AIS患者进一步验证该结果的普适性。此外，本研究虽观察到AIS患者椎旁肌中osteonectin分泌失衡，并通过体外实验证实其促成骨效应，但具体机制尚未明确。后续研究将采用蛋白质组学等方法筛选osteonectin的上下游互作蛋白，并明确其发挥促成骨效应的具体信号通路。第二，体外模型方面存在不足。受限于AIS原代成肌细胞获取困难且表型难以维持，本研究采用HSMM细胞系进行实验；同时，过表达体系中osteonectin浓度远高于生理水平。故当前结果仅能定性证实其促成骨分化潜能，尚不能直接反映人体内真实生理情况。后续研究将通过敲低、中和抗体等实验验证osteonectin在生理状态下促进成骨分化的必要性，并进一步明确其发挥该效应所需的生理浓度范围。第三，虽然外周血研究中osteonectin在AIS组明显低于CON组，但经分析发现外周血osteonectin水平与患者Cobb角未见明显相关性，提示其更可能作为反映AIS疾病发生的标志物，而非衡量侧凸严重程度的指标，其相关临床意义有待进一步阐明。

综上所述，本研究发现AIS患者椎旁肌存在以osteonectin表达失衡为特征的分泌功能紊乱，并通过体外肌‑骨共培养模型证实osteonectin可促进成骨细胞分化。这些结果为骨骼肌osteonectin分泌异常参与AIS发病机制的假说提供了实验依据，也提示osteonectin未来可作为AIS早期筛查的候选生物标志物及改善成骨分化异常的潜在干预靶点。

作者贡献度说明：

田文林：实验实施、数据分析、论文撰写；徐海霞：实验指导、论文修改；何贤波：临床样本采集、论文修改；文王强：临床资料收集；孙博：临床诊断；王华：实验指导；陈焕雄：研究构思、设计及临床诊断。全体作者参与论文讨论、审阅并同意论文最终版本，对研究的真实性和完整性负责。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金地区科学基金项目(82160435)

海南省高等学校科学研究项目(Hnky2024‑35)