基于METTL3介导的Rubicon m6A甲基化修饰探讨芪参汤通过促进自噬治疗非酒精性脂肪性肝病的机制研究

Mechanism of Qishen Decoction treating nonalcoholic fatty liver disease via promoting autophagy based on METTL3‑mediated Rubicon m6A methylation

摘要

目的 探讨芪参汤对METTL3介导的Rubicon m6A甲基化的影响，从而阐明其调控自噬治疗非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的分子机制。 方法 采用0.5 mmol/L游离脂肪酸处理AML‑12肝细胞构建NAFLD模型。设置空白组、模型组、芪参汤含药血清组及芪参汤+METTL3过表达组。通过油红O染色、BDPY 493/503荧光染色及生化试剂盒检测细胞内脂质含量；Western blot检测自噬相关蛋白（LC3‑Ⅱ/Ⅰ、p62）及METTL3、Rubicon表达；mCherry‑GFP‑LC3慢病毒示踪检测自噬流；采用斑点杂交技术检测各组细胞总RNA中整体的m6A修饰水平。采用m6A甲基化RNA免疫共沉淀结合定量PCR（MeRIP‑qPCR）技术检测特定靶基因Rubicon mRNA上的m6A修饰富集程度。 结果 与空白组相比，模型组肝细胞脂质沉积（油红O积分光密度、甘油三酯、总胆固醇）明显增加（P<0.01），自噬流受阻（LC3‑Ⅱ/Ⅰ与p62蛋白、自噬溶酶体明显减少）（P<0.01）。METTL3与Rubicon的蛋白及mRNA表达上调，Rubicon mRNA的m6A修饰水平升高（P<0.01）。芪参汤含药血清干预后，上述异常被明显逆转（P<0.01）。然而，过表达METTL3可部分抵消芪参汤的上述保护作用，包括逆转其对脂质沉积的改善、对自噬流的促进以及对Rubicon m6A修饰水平的下调效应（P<0.01）。 结论 芪参汤可能通过抑制METTL3的表达，降低其对Rubicon mRNA的m6A甲基化修饰，恢复自噬通量，从而减轻肝细胞脂质沉积。

Abstract

Objective To investigate the effects of Qishen Decoction （QSD） on METTL3‑mediated m6A methylation of Rubicon and to elucidate its molecular mechanism in regulating autophagy for treating nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD）. Methods An NAFLD cell model was established by treating AML‑12 hepatocytes with 0.5 mmol/L free fatty acids. The cells were divided into a control group， a model group， a QSD‑containing serum group， and a QSD+METTL3 overexpression group. Intracellular lipid content was assessed by Oil Red O staining， BDPY 493/503 fluorescence staining， and biochemical assays. Protein expressions of autophagy‑related markers （LC3‑Ⅱ/Ⅰ and p62）， METTL3， and Rubicon were detected by Western blot. Autophagic flux was traced using mCherry‑GFP‑LC3 lentivirus. Dot blot assay was used to detect the global m6A modification levels in total RNA from each group of cells. Methylated RNA immunoprecipitation combined with quantitative PCR （MeRIP‑qPCR） was employed to specifically measure the m6A enrichment on Rubicon mRNA. Results Compared to the control group， the model group exhibited significantly increased lipid deposition （Oil Red O integrated optical density， triglycerides， and total cholesterol） （P<0.01）， and impaired autophagic flux （accumulation of LC3‑Ⅱ/Ⅰ and p62 proteins and autolysosomes significantly reduced） （P<0.01）. Protein and mRNA expressions of METTL3 and Rubicon were upregulated， and Rubicon mRNA m6A modification was elevated （P<0.01）. QSD‑containing serum intervention significantly reversed the abnormalities mentioned above （P<0.01）. However， overexpression of METTL3 could partially counteract the protective effects of QSD mentioned above， including reversing its improvements in lipid deposition， autophagic flux promotion， and downregulation of Rubicon m6A modification level （P<0.01）. Conclusion QSD may alleviate hepatocyte lipid deposition by inhibiting METTL3 expression， reducing METTL3‑mediated m6A methylation of Rubicon mRNA， and restoring autophagic flux.

Graphical abstract

关键词

非酒精性脂肪性肝病 / 芪参汤 / METTL3 / Rubicon / m6A甲基化 / 自噬

Key words

Nonalcoholic fatty liver disease / Qishen Decoction / METTL3 / Rubicon / m6A methylation / Autophagy

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD），现在也称为“代谢相关脂肪性肝病”，是一种以肝细胞脂肪过度蓄积为核心病理特征的慢性肝脏疾病^［1］，其疾病谱涵盖单纯性肝脂肪变性、脂肪性肝炎、肝纤维化及肝硬化等一系列进展性病变。流行病学调查显示，NAFLD在全球范围内的患病率高达25%，已成为我国最常见的慢性肝脏疾病，成为了一项严峻的公共卫生负担^［2，3］。NAFLD的发病与肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常等代谢紊乱密切相关，涉及脂质代谢失调、氧化应激与慢性炎症反应等多重机制的共同作用。尽管近年来治疗策略有所进展，特别是甲状腺激素受体‑β激动剂Resmetirom与GLP‑1受体激动剂Semaglutide等相继获批，为NAFLD的治疗提供了新选择，但其在特定人群中的适用性、长期疗效与安全性等方面仍存在局限^［4，5］。因此，深入阐明NAFLD的病理生理学机制并探寻有效的干预策略，已成为当前肝脏病学研究的重要方向。

自噬是细胞通过溶酶体途径降解受损细胞器、错误折叠蛋白及多余脂滴以维持内环境稳定的关键过程^［6］。研究表明，NAFLD的发展与自噬功能受损密切相关^［7］。恢复自噬可以促进脂肪分解，改善肝脂肪变性，并减少肝细胞损伤^［8］。此外，自噬还能维持非实质细胞类型的稳态和功能，从而抑制肝脏炎症和纤维化，减缓NAFLD进展^［9］。近年来，RNA N6‑甲基腺苷（m6A）修饰作为真核生物信使RNA中最普遍的转录后修饰，被证实广泛参与基因表达调控，并与代谢性疾病的发生、发展密切相关^［10］。尤其在自噬调控网络中，m6A修饰可通过影响自噬相关基因mRNA的稳定性、剪接、输出及翻译效率，从而参与自噬流的启动、延伸与降解的调控^{［11，12］}。因此，本研究通过观察芪参汤对METTL3‑Rubicon m6A修饰介导的肝细胞自噬的影响，从而明确其改善脂质代谢治疗NAFLD的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞

清洁级C57BL/6J雄性小鼠，8周龄，购于赛业（固安）生物科技有限公司，许可证号：SCXK（冀）2021‑003。所有小鼠于SPF级环境中适应性饲养1周，饲养条件为恒温（22±2） ℃、恒湿（50±10）%、12 h明暗交替，自由摄食饮水。动物实验方案经黑龙江省中医药科学院实验动物伦理委员会审查批准（批件号：SY3R‑2025059）。小鼠肝细胞系AML‑12购于上海瑾原生物科技有限公司（货号：JY175），使用DMEM/F12培养基（含10%胎牛血清、1%胰岛素‑转铁蛋白‑硒、40 ng/mL地塞米松、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素）培养。

1.2 药物与试剂

芪参汤购于北京同仁堂有限责任公司，由生黄芪15 g、丹参10 g、泽泻10 g、生山楂10 g、绞股蓝5 g、生甘草3 g组成。药物加5倍量水浸泡后，煎煮2次，过滤后合并煎煮药液，浓缩至每1 mL含生药1 g的浓缩液备用。棕榈酸和油酸购于美国Sigma‑Aldrich公司（货号：P0500、O1008）。METTL3过表达质粒购于汉恒生物科技（上海）有限公司。油红O染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司（货号：G1262）。BCA蛋白浓度测定试剂盒、Ad‑mCherry‑ GFP‑LC3B、脂滴绿色荧光检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司（货号：P0009、C3011、C2053S）。甘油三酯（triglycerides，TG）和总胆固醇（total cholesterol，TC）测试盒购于南京建成生物工程研究所（货号：A110‑1‑1、A111‑1‑1）。兔抗小鼠METTL3、Rubicon、LC3、p62/SQSTM1、GAPDH购于武汉Proteintech公司（货号：15073‑1‑AP、21444‑1‑AP、14600‑1‑AP、18420‑1‑AP、60004‑1‑Ig）。HRP标记的羊抗兔二抗和m6A抗体购于英国Abcam公司（货号：Ab6721、Ab284130）。Lipofectamine^TM 3000转染试剂购于美国Thermo Fisher Scientific公司（货号：L3000001）。RNA片段化试剂购于北京全式金生物技术有限公司（货号：KM402‑01）。TRIzol试剂、HiScript Ⅲ RT SuperMix、ChamQ SYBR qPCR Master Mix购于南京诺唯赞（货号：R401‑01、R333‑01、Q711‑02）。

1.3 含药血清制备

24只C57BL/6J小鼠随机分为空白组与芪参汤组，每组12只。芪参汤组参照课题组前期研究^［13］给予6.89 g/kg的芪参汤水溶液进行灌胃治疗，空白组给予等体积的蒸馏水进行灌胃，每日2次，连续7 d。末次灌胃后24 h以1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉取血。随后小鼠以1%戊巴比妥钠200 mg/kg腹腔注射安乐死。血样于室温静置2 h后，3 000 r/min离心15 min，收集上层血清，56 ℃水浴灭活30 min，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装后-80 ℃保存。

1.4 细胞分组与药物干预

AML‑12细胞分为：（1）空白组：常规培养；（2）模型组：给予0.5 mmo/L游离脂肪酸（free fatty acids，FFA）混合液孵育48 h构建NAFLD模型^［14］；（3）芪参汤组：FFA处理同时，分别加入芪参汤含药血清共孵育；（4）芪参汤+METTL3过表达组：转染METTL3过表达质粒后，给予FFA与芪参汤含药血清共处理。METTL3过表达质粒的转染按Lipofectamine^TM 3000说明书进行。

1.5 指标检测

1.5.1 油红染色

收集各组细胞，经4%多聚甲醛固定后，以0.5%油红O染液染色15 min，苏木素复染胞核。于光学显微镜下观察脂滴，并随机选取3个视野，使用Image‑Pro Plus软件分析红色区域积分光密度（IOD）。

1.5.2 细胞内TG和TC含量测定

收集各组细胞，弃上清液，加入1%~2% TritonX‑100裂解液，于冰上裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液。加入TG和TC检测工作液震荡混匀，37 ℃孵育10 min，使用酶标仪于500 nm波长测定吸光度值，并计算TG和TC的含量。

1.5.3 BDPY493/503

收集各组细胞，经PBS漂洗后，用含1 μmol/L BDPY493/503的培养基于37 ℃避光孵育30 min。荧光显微镜下观察中性脂滴（绿色荧光），并使用ImageJ软件定量BDPY493/503的荧光强度。以空白组的平均值为基准进行标准化，结果以相对荧光单位表示。

1.5.4 Western blot

收集各组细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定浓度。取等量蛋白上样，经SDS‑ PAGE凝胶电泳分离后，转印至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入一抗（METTL3、Rubicon、LC3‑Ⅱ/Ⅰ、p62、GAPDH） 4 ℃孵育过夜。次日，经TBST洗涤后，与HRP标记的二抗室温孵育1 h，ECL化学发光法显影。以GAPDH为内参，计算目标蛋白相对表达量。

1.5.5 RT‑qPCR

收集各组细胞，TRIzol法提取细胞总RNA，HiScript Ⅲ逆转录为cDNA。以cDNA为模板，ChamQ SYBR qPCR Master Mix进行扩增。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环。以GAPDH为内参，采用2^-ΔΔCt法计算METTL3和Rubicon mRNA相对表达量，引物序列见表1。

1.5.6 斑点杂交实验

提取细胞总RNA，经DNase Ⅰ消化后，将等量RNA变性后点样于尼龙膜上，紫外交联固定。用含5% BSA的TBST封闭1 h，随后与m6A抗体4 ℃孵育过夜。次日，经TBST洗涤后与二抗孵育，最后用超敏ECL化学发光底物显影，分析总RNA的m6A修饰水平。

1.5.7 MeRIP‑qPCR

收集各组细胞，使用TRIzol提取总RNA。取200 μg总RNA，加入RNA片段化试剂于94 ℃孵育5 min，将RNA随机打断为约100 nt的片段。取10%的片段化RNA作为“Input”对照，剩余RNA与抗m6A抗体IP缓冲液在4 ℃旋转孵育2 h，随后加入Protein A/G磁珠继续孵育2 h。经洗脱得到m6A富集的RNA片段。分别对“Input”和“IP”产物进行逆转录为cDNA，并用针对Rubicon mRNA特定片段的引物进行qPCR分析。以Input组Ct值归一化后，比较各组间Rubicon mRNA的m6A富集程度。

1.5.8 mCherry‑GFP‑LC3

细胞接种于共聚焦培养皿，待融合度达70%时，按MOI=50加入mCherry‑ GFP‑LC3腺病毒感染。感染6 h后更换新鲜培养基。干预结束后，用4%多聚甲醛固定细胞，于荧光显微镜下观察。其中黄色荧光点（mCherry+GFP+）代表自噬体，红色荧光点（mCherry+GFP‑）代表自噬溶酶体。

1.6 统计学处理

使用SPSS 27.0软件进行统计学分析，计量资料以\overline{x}\pm s表示。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD‑t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 芪参汤对肝细胞脂质沉积的影响

与空白组相比，模型组肝细胞油红O染色积分光密度值、TG与TC的含量明显升高（P<0.01），特异性标记中性脂质的BDPY 493/503荧光强度也升高至3.92倍。与模型组相比，芪参汤干预后肝细胞油红O染色积分光密度值、TG与TC的含量和BDPY 493/503荧光强度明显降低（P<0.01）。与芪参汤相比，芪参汤+METTL3过表达组油红O染色积分光密度值、TG与TC的含量和BDPY 493/503荧光强度被明显逆转（P<0.01），见表2、图1。

2.2 芪参汤对肝细胞自噬通量的影响

与空白组相比，模型组肝细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值与p62蛋白表达明显升高（P<0.01）。与模型组相比，芪参汤干预后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值与p62蛋白明显降低（P<0.01）。与芪参汤相比，芪参汤+METTL3过表达组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值与p62蛋白明显升高（P<0.01），见表3、图2。

此外，与空白组相比，模型组肝细胞中黄色荧光斑点数量明显增加，红色荧光斑点数量明显减少（P<0.01）。与模型组相比，芪参汤干预后黄色荧光斑点数量减少，红色荧光斑点数量明显增加（P<0.01）。与芪参汤相比，芪参汤+METTL3过表达组肝细胞黄色荧光斑点数量明显增加，红色荧光斑点数量明显减少（P<0.01），见表3、图3。

2.3 芪参汤对METTL3和Rubicon表达水平的影响

与空白组相比，模型组肝细胞METTL3和Rubicon蛋白及mRNA表达明显升高（P<0.01）。与模型组相比，芪参汤组METTL3和Rubicon蛋白及mRNA表达明显降低（P<0.01）。与芪参汤组相比，芪参汤+METTL3过表达组METTL3和Rubicon蛋白及mRNA表达明显增加（P<0.01），见图4、表4。

2.4 芪参汤对Rubicon m6A修饰水平的影响

与空白组相比，模型组肝细胞内Rubicon mRNA的m6A富集水平及总m6A修饰明显增加（P<0.01）。经芪参汤干预后，Rubicon mRNA的m6A富集水平和总m6A修饰水平较模型组明显降低（P<0.01）。与芪参汤相比，芪参汤+METTL3过表达组Rubicon mRNA的m6A富集水平及总m6A修饰水平均明显增加（P<0.01），见表5、图5。

3 讨论

肝脏作为机体脂质代谢的核心器官，其脂质稳态的维持有赖于脂肪酸的摄取、新生合成、β‑氧化和以极低密度脂蛋白分泌等多重途径的动态平衡^［15］。在营养过剩、胰岛素抵抗等代谢应激状态下，这一平衡被打破，导致TG等中性脂质在肝细胞内异常蓄积，形成肝脂肪变性，是NAFLD的起始病理特征。自噬，尤其是特异性降解脂滴的“脂噬”，是细胞在能量不足或代谢压力下，通过形成自噬体包裹脂滴等底物，并与溶酶体融合降解，从而实现物质循环与能量供应的重要生理机制^［16］。自噬流的功能障碍不仅直接削弱脂滴的清除能力，还会引起受损线粒体等细胞器堆积，加剧氧化应激，激活内质网应激和炎症反应，从而形成“脂质沉积‑细胞损伤‑炎症激活”的恶性循环，推动NAFLD向炎症及纤维化阶段进展。因此，恢复自噬功能已成为NAFLD治疗的重要策略。

Rubicon是自噬通路中的一个关键负调控蛋白，主要定位于晚期内体/溶酶体膜^［17］。它通过其RUN结构域与自噬核心复合物PI3KC3‑C2结合，并干扰自噬体与溶酶体融合所必须的同型融合与空泡蛋白分选复合物功能，从而特异性阻断自噬流晚期阶段，导致自噬体受阻和底物降解障碍^［18］。m6A甲基化修饰是真核生物mRNA中最常见的内部转录后修饰之一，由甲基转移酶复合物（如METTL3/METTL14/WTAP）催化形成，并可被去甲基化酶（如FTO、ALKBH5）去除，构成动态可逆的修饰网络^［19］。该修饰通过被不同的“阅读器”蛋白（如YTHDC1、YTHDF家族）识别，进而调控mRNA的剪接、出核、稳定性、翻译及降解等过程，在基因表达调控和细胞应激应答中发挥核心作用。近年研究表明，METTL3介导的m6A修饰可通过调控自噬相关基因的表达影响自噬进程^［20］。本研究证实，在FFA诱导的肝细胞脂肪变性模型中，METTL3及其下游靶点Rubicon的表达明显上调，而芪参汤干预可有效抑制二者的表达。在机制上，芪参汤通过下调METTL3，降低了Rubicon mRNA的m6A修饰水平，抑制了Rubicon蛋白表达，从而恢复自噬流并改善脂质沉积。

NAFLD归属于中医“胁痛”、“肝癖”、“积聚”等范畴，其病机关键在于肝失疏泄、脾失健运。脾虚则水湿不化，聚湿成痰；肝郁则气机阻滞，气滞血瘀。痰、湿、瘀互结，痹阻肝络，形成本虚标实之证。芪参汤以“脾虚肝郁、痰瘀互结”为核心病机，以生黄芪为君，益气健脾、利水消肿，从本论治；以丹参、泽泻为臣，活血利湿，疏通标实；佐以生山楂、绞股蓝消积化痰、清热降脂；使以生甘草调和诸药。全方共奏健脾益气、活血利湿、化痰消脂之效，体现标本兼治的原则。本研究证实，芪参汤能明显改善FFA诱导的肝细胞脂质沉积并促进自噬流，为其“健脾活血、化痰消脂”的功效提供了分子层面的证据。

综上所述，芪参汤可能通过抑制METTL3的表达，减少其对Rubicon mRNA的m6A甲基化修饰，从而下调Rubicon蛋白、恢复自噬通量，最终缓解肝细胞脂质沉积。本研究揭示了“METTL3‑m6A‑ Rubicon‑自噬”轴在芪参汤改善NAFLD中的重要作用，为该方的临床应用提供了新的科学依据，也为NAFLD的靶向治疗提供了潜在的研究方向。

作者贡献度说明：

袁星星：实验设计；李超凡、王炳予：完成实验；刘颖：指标检测；齐妍：实验数据统计、撰写论文。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

黑龙江省自然科学基金(PL2025H283)