敲除PTEN基因对人胆管上皮细胞H69生物学功能的影响及机制初探

Biological effect of PTEN knockout on human cholangiocyte cell line H69 and its underlying mechanisms

摘要

目的 利用规律成簇间隔短回文重复（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR）/相关蛋白9（CRISPR-associated protein 9， Cas9）系统构建磷酸酶-张力蛋白同源物（Phosphatase and tensin homolog， PTEN）基因稳定敲除的人胆管上皮细胞H69细胞系，检测PTEN基因敲除对人胆管上皮细胞生物学功能的影响，并探索其可能的作用机制。 方法 建立sgRNA-PTEN重组质粒并包装成慢病毒感染H69细胞，经嘌呤霉素筛选获取PTEN基因稳定敲除细胞系，通过免疫印迹（Western blot， WB）检测PTEN蛋白的敲除效率，观察细胞生长情况及形态学改变，利用细胞增殖实验和平板克隆形成实验检测PTEN基因稳定敲除细胞的增殖能力，通过WB检测敲除PTEN基因对AKT信号通路和ERK信号通路蛋白的影响。 结果 WB检测PTEN蛋白敲除效率显示，感染sgRNA 2慢病毒的单细胞克隆中未检测到PTEN蛋白表达，而感染sgRNA 1慢病毒的单细胞克隆中仍存在部分PTEN蛋白表达，提示成功构建稳定敲除PTEN基因的H69细胞株。克隆形成实验结果显示：与WT组比较，PTEN-KO组细胞克隆形成数目增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；MTS检测结果显示，与WT组比较，PTEN-KO组细胞增殖能力显著增强，差异有统计学意义（P＜0.05）；细胞形态学观察结果显示，与WT组比较，PTEN-KO组细胞呈更为明显的长梭形，细胞质更为饱满，并伴有部分伪足形成。与WT组比较，PTEN-KO组磷酸化AKT蛋白（包括p-AKT 308和p-AKT 473）表达水平显著增加，而总AKT蛋白水平未发生显著变化；磷酸化ERK蛋白和总ERK蛋白表达水平均未出现显著变化，提示PTEN基因的敲除AKT信号通路被显著激活，但对ERK信号通路无显著影响。与WT组比较，PTEN-KO组N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug的表达水平显著上调。 结论 PTEN基因敲除促进细胞增殖和触发细胞形态改变，此过程可能与其激活AKT通路和诱导上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition， EMT）有关。

Abstract

Objective To establish phosphatase and tensin homolog （PTEN） gene stable knockout human cholangiocyte cell line H69 using clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）/CRISPR-associated protein 9 （Cas9） system， and to investigate the effect of PTEN knockout on altered cell biological behaviors and its underlying mechanisms. Methods Firstly， sgRNA oligos targeting PTEN gene were designed. The constructed recombinant plasmids and empty vectors were respectively packaged with lentivirus， and then infected with H69 cells. Subsequently， PTEN stable knockout H69 cell line were constructed by screening using puromycin， and then the expression of PTEN protein was detected via western blot （WB） assay. The morphological changes and growth of H69 cells with PTEN knockout were observed， and cell proliferation ability was detected using cell proliferation assay and cell colony formation assay. Finally， the canonical downstream signal molecules of PTEN genes were explored and detected using WB. Results WB analysis of PTEN protein knockout efficiency showed that PTEN protein expression was undetectable in single-cell clones infected with sgRNA 2 lentivirus， while partial PTEN protein expression was still present in single-cell clones infected with sgRNA 1 lentivirus， suggesting the successful construction of a stable PTEN genes knockout H69 cell line. The results of the colony formation assay indicated that the number of cell colonies in the PTEN-KO group was significantly increased compared with the WT group， with a statistically significant difference （P＜0.05）. The MTS assay results showed that the proliferation ability of cells in the PTEN-KO group was significantly enhanced compared with the WT group， with a statistically significant difference （P＜0.05）. Morphological observation of cells revealed that cells in the PTEN-KO group were more elongated and spindle-shaped， with fuller cytoplasm and partial pseudopodia formation compared with the WT group. Compared with the WT group， the expression levels of phosphorylated AKT proteins （including p-AKT 308 and p-AKT 473） in the PTEN-KO group were significantly increased， while the total AKT protein levels did not change significantly. The expression levels of phosphorylated ERK protein and total ERK protein did not show significant changes， suggesting that the knockout of the PTEN gene significantly activated the AKT signaling pathway but had no significant effect on the ERK signaling pathway. Compared with the WT group， the expression levels of N-cadherin， Vimentin， Snail， and Slug in the PTEN-KO group were significantly upregulated. Conclusion PTENloss can promote cell proliferation and trigger morphological changes， which may be related to the activation of AKT pathway and induction of EMT.

Graphical abstract

关键词

PTEN磷酸水解酶 / 人胆管上皮细胞 / 细胞增殖 / AKT信号通路 / CRISPR/Cas9系统

Key words

PTEN phosphohydrolase / Human biliary epithelial cells / Cell proliferation / AKT signaling pathway / CRISPR/Cas9 system

胆管细胞癌（Cholangiocarcinoma，CCA）是一种起源于胆管树，具有高异质性和高侵袭性的恶性肿瘤，近年来发病率和死亡率不断攀升。CCA患者预后极差，5年生存率仅7%～20%^［1］。研究提示，胆道系统肿瘤中PTEN基因变异频率仅0.6%～11%^［2］。JIANY T Y等^［3］运用深度靶向测序手段发现，CCA患者标本及患者异种移植模型来源的细胞中存在PTEN基因变异，其中缺失频率高达40%。全晓明等^［4］研究发现PTEN蛋白在人肝外CCA组织较正常胆管组织表达显著降低。

磷酸酶-张力蛋白同源物（Phosphatase and tensin homolog，PTEN）基因是一种与肿瘤发生密切相关的抑癌基因，兼具脂质和蛋白磷酸激酶活性。PTEN作为重要的负调控因子，通过自身的磷酸酶活性抑制AKT的磷酸化，调节PI3K/AKT信号通路的活性，进而调控细胞的存活、增殖、代谢等^［5］。PTEN的基因缺失、表达下调、启动子甲基化沉默等会解除其对PI3K/AKT通路的拮抗作用，导致CCA等多种恶性肿瘤的发生^［6］。CHUNG J Y等^［7］研究发现CCA患者体内PTEN表达、PTEN/p-AKT表达与患者不良预后相关。尽管上述研究证实了PTEN缺失与CCA的发生和不良预后密切相关，但这些发现大多基于肿瘤组织样本或已癌变的细胞系。在这些模型中，PTEN缺失仅仅是众多复杂的基因变异网络中的一环，我们难以将观察到的恶性表型单一地、精确地归因于PTEN缺失。因此，为探究PTEN缺失在人正常胆管上皮细胞恶性转化过程中的驱动作用及其可能的机制，在基因层面构建一个背景清晰、变量单一的实验模型至关重要。CRISPR/Cas9系统由起导向作用的sgRNA以及具有核酸内切酶活性的Cas9蛋白组成，可以精准靶向目的基因，通过同源重组修复或非同源重组修复机制引起基因变异，从而发挥特异性基因编辑作用^［8］。鉴于此，本研究基于CRISPR/Cas9系统构建PTEN基因敲除的人胆管上皮H69稳定细胞株，以期为研究人正常胆管上皮对PTEN缺失的应答及应答机制提供有力的实验工具。

1 材料与方法

1.1　主要材料和试剂

HEK293T细胞由本实验室保存。人正常胆管上皮细胞系H69细胞由美国梅奥诊所杰克逊维尔分院纪保安教授馈赠。Lenti-CRISPR-V2载体（Plasmid #52961）、腺病毒包装载体psPAX2（Plasmid #12260）和pCMV-VSV-G（Plasmid #8454）均购自Addgene公司；PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；PCR产物回收试剂盒、DNA小量胶回收纯化试剂盒和质粒提取试剂盒均购自Qiagen公司；感受态Stbl3细胞、限制性内切酶BsmB Ⅰ和T4连接酶均购自NEB公司；1 kb Plus DNA Ladder、质粒转染试剂Lipofectamine^TM2000、RIPA蛋白裂解液、BCA试剂盒均购自Thermo Fisher公司；PTEN抗体、p-AKT 308抗体、p-AKT 473抗体、pan-AKT抗体、p-ERK1/2抗体、ERK1/2抗体和上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）抗体试剂盒均购自CST公司；GAPDH抗体购自Santa Cruz公司；二抗均购自Jackson labs公司；K-SFM培养基、PBS、胰蛋白酶、青链霉素均购自Gibco公司；嘌呤霉素、氨苄西林、Polybrene、琼脂糖均购自Sigma公司；MTS试剂购自Promega公司；PCR引物和寡核苷酸链由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2　方法

1.2.1　细胞培养

细胞培养于含表皮生长因子和牛垂体提取物以及1%青链霉素的K-SFM培养基中，并置于37 ℃、5%CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中。

1.2.2　靶向PTEN基因的sgRNA设计和合成

在NCBI网站获得PTEN基因（Gene ID：5728）的CDS基因序列，利用网址（http： //crispr. mit. edu/）在线设计2个sgRNA序列，在其正、反义链模板5'端分别添加CACCG和AAAC末端。sgRNA序列及DNA测序由上海生工生物工程股份有限公司合成和完成。

1.2.3　Lenti-CRISPR-PTEN-sgRNA载体的构建和鉴定

首先，利用BsmB Ⅰ限制性内切酶对质粒Lenti-CRISPR-V2（1 μg）进行酶切，使其线性化。随后，通过1%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，收集并纯化线性化的载体片段。接下来，将合成的sgRNA引物进行退火处理，形成双链DNA。退火反应体系包括100 μmol·L^-1的正义链和反义链引物，10 μL的10×NEB ligation缓冲液，最后用超纯水将反应体系补足至100 μL。将反应体系置于沸水中加热，随后自然冷却至室温，以完成退火过程。连接体系：线性化的Lenti-CRISPR-V2质粒2 μL，稀释10倍退火形成双链的sgRNA 6 μL，10×T4 DNA buffer 1 μL，T4连接酶1 μL，4 °C连接过夜。转化：从-80 °C取出分装好的Stbl3感受态细胞（每管100 μL）至冰上解冻后，加5 μL连接产物，冰上孵育，热激后添加无抗生素的SOC培养基，37 °C摇床复苏1 h，取适量菌液均匀涂于LB-Amp板上，37 °C过夜培养。挑取单克隆置于500 μL含有Amp抗生素的LB液体培养基中，37 °C、220 rpm振荡培养3 h，利用U6正向引物（5'-GACTATCATATGCTTACCGT-3'）和sgRNA的反向引物通过PCR反应筛选阳性克隆。所得阳性克隆扩大培养，提取和纯化质粒Lenti-CRISPR-PTEN-sgRNA并测序验证。

1.2.4　Lenti-CRISPR-PTEN-sgRNA慢病毒的包装和转染

使用Lipofectamine^TM 2000将Lenti-CRISPR-PTEN-sgRNA∶pSPAX2∶pCMV-VSV-G=10∶9∶1的比例，转染至HEK293T细胞中进行慢病毒质粒包装。48 h后收集含有病毒的DMEM培养基。将H69细胞接种至6孔板中培养，待细胞密度达到60%～70%时，通过Polybrene（4～6 μg·mL^-1）试剂将慢病毒感染至H69细胞中。以等量的Lenti-CRISPR-V2空白载体作为阴性对照（Negative control， NC）。

1.2.5　 PTEN基因敲除的H69稳定细胞株的筛选和建立

H69细胞在感染Lenti-CRISPR-PTEN-sgRNA病毒48 h后，经嘌呤霉素（1 μg·mL^-1）筛选，待阳性克隆形成后，采用极限稀释法，将H69细胞以1个细胞/400 μL的密度接种于96孔板，随后观察各孔细胞的生长情况，并对单细胞生长孔进行标记。待标记孔中的H69细胞密度达到80%～90%时，用胰酶消化细胞后，将其传代接种至6孔板进行扩大培养。当细胞密度达到80%～90%时，收集细胞提取蛋白，通过WB检测PTEN蛋白水平，挑选PTEN基因完全敲除的H69细胞，经扩大培养后得到PTEN基因稳定敲除的H69细胞株，以用于后续实验。

1.2.6　免疫印迹（Western blot， WB）检测细胞相关蛋白表达

细胞裂解液对各组细胞裂解并提取细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，各组取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，100 V恒压湿转至NC膜，室温封闭30 min，加入目的蛋白抗体4 °C孵育过夜，TBST洗膜3次，加入山羊抗兔或抗鼠荧光二抗，室温孵育1 h，洗膜3次，上机显影。利用Image J软件半定量分析，以目的蛋白条带与GAPDH蛋白条带灰度值的比值表示其相对含量。

1.2.7　克隆形成实验检测细胞集落形成能力

将野生型（WT）和PTEN基因敲除（PTEN-KO）的H69细胞分别消化并计数，分别按照每孔500个细胞接种至6孔板中培养10～14 d。当6孔板中出现肉眼可见的克隆时，弃原培养基，PBS洗3遍后加1 mL 4%多聚甲醛固定15 min。去固定液，加入结晶紫室温染色15 min，洗去染色液，空气干燥，拍照，计算克隆数。

1.2.8　MTS法检测细胞增殖能力

收集野生型（WT）和PTEN基因敲除（PTEN-KO）的H69细胞，经消化计数后，以每孔1×10⁴个细胞密度分别接种于96孔板，每组设置6个复孔。于细胞培养箱中培养48 h，随后每孔加入30 μL MTS试剂，37 ℃孵育1 h。利用酶标仪检测各孔490 nm处的光密度（Optical density， OD）值，与野生型细胞株比较，计算PTEN基因敲除细胞的相对增殖能力。

1.3　统计学处理

采用GraphPad Prism 8.3.0软件进行数据分析。所有资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1　CRISPR sgRNA载体构建和鉴定

利用在线软件设计sgRNA，针对PTEN基因设计2对sgRNA的靶向序列引物（图1），2对序列分别靶向PTEN基因的第1和第7号外显子。合成后的寡核苷酸单链退火形成双链，然后将其插入通过限制性内切酶BsmB Ⅰ线性化的Lenti-CRISPR-V2质粒载体中，获得重组质粒并用于感染大肠杆菌，随机挑选8个单克隆菌落，采用Lenti-CRISPR质粒上U6启动子引物及sgRNA的反向引物进行PCR反应，筛选阳性克隆，菌液PCR结果显示对于sgRNA 1序列，除2号和8号单克隆外，其余均为阳性克隆；而sgRNA 2序列，8个克隆均为阳性（图2A）。挑选2个序列中各1个阳性质粒以U6启动子为引物进行测序，测序结果通过Chromas软件分析，结果表明PTEN基因敲除载体构建成功（图2B）。

2.2　 PTEN基因敲除H69细胞的构建、筛选及鉴定

Lenti-CRISPR-V2-PTEN sgRNA慢病毒感染H69细胞48 h后，采用嘌呤霉素（1 μg·mL^-1）进行筛选。72 h后，未感染病毒的野生型H69细胞全部死亡，而感染病毒的H69细胞中仍有大量活性细胞存活。WB检测PTEN蛋白敲除效率显示，感染sgRNA 2慢病毒的单细胞克隆中未检测到PTEN蛋白表达，而感染sgRNA 1慢病毒的单细胞克隆中仍存在部分PTEN蛋白表达（图3），提示成功构建稳定敲除PTEN基因的H69细胞株。随后，将感染携带有sgRNA 2慢病毒质粒的H69细胞进行扩大培养，并用于后续的功能学实验研究。

2.3　 PTEN基因敲除对H69细胞增殖能力及细胞形态的影响

克隆形成实验结果显示：与WT组比较，PTEN-KO组细胞克隆形成数目增加，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4）；MTS检测结果显示，与WT组比较，PTEN-KO组细胞增殖能力显著增强，差异有统计学意义（P＜0.05）（图5）；细胞形态学观察结果显示，与WT组比较，PTEN-KO组细胞呈更为明显的长梭形，细胞质更为饱满，并伴有部分伪足形成（图6）。

2.4　 PTEN基因敲除对H69细胞蛋白表达的影响

与WT组比较，PTEN-KO组磷酸化AKT蛋白（包括p-AKT 308和p-AKT 473）表达水平显著增加，而总AKT蛋白水平未发生显著变化；磷酸化ERK蛋白和总ERK蛋白表达水平均未出现显著变化，提示PTEN基因的敲除AKT信号通路被显著激活，但对ERK信号通路无显著影响（图7A）。与WT组比较，PTEN-KO组N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug的表达水平显著上调（图7B）。

3 讨论

如前所述，CRISPR/Cas9系统可起到特异性基因编辑作用。在本研究中，我们设计了2对sgRNA的靶向序列引物，利用CRSIPR/Cas9基因编辑技术选择有效位点成功敲除人正常胆管上皮H69细胞中的PTEN基因，并发现PTEN缺失能够促进细胞增殖，并明显提高细胞的克隆形成能力。进一步分子机制研究发现这种效应可能与激活AKT信号通路及EMT有关。这些发现表明，PTEN在维持正常胆管上皮细胞的稳态中扮演着重要角色，其功能缺失可能是驱动胆管癌发生的早期分子事件。

PTEN是PI3K/AKT信号通路最重要的负调控因子，其缺失与多种肿瘤的发生发展密切相关^［6］。本研究通过在正常人胆管上皮H69细胞中构建PTEN基因敲除模型，首次在纯净遗传背景下证实，单一的PTEN缺失即足以通过解除对AKT的抑制，引起AKT磷酸化水平显著升高，进而驱动细胞增殖与克隆形成能力增强。这一结果表明，PTEN-AKT轴功能紊乱在正常胆管上皮H69细胞向恶性表型转化的初始阶段发挥关键作用。本研究结论与多种动物模型结果一致。MARSH V等^［9］研究发现，特异性敲除小鼠胆道上皮PTEN基因足以诱发胆管病理性改变乃至肝内肿瘤；LIN Y K等^［10］研究也表明PTEN缺失在KRAS激活背景下显著协同诱导胆道癌变。这些结果共同支持PTEN缺失作为胆管癌变早期驱动事件的潜力。而本研究在无其他遗传干扰的人正常胆管上皮细胞模型中揭示了PTEN单基因缺失的直接效应，凸显了其独立启动恶性转化的能力。更重要的是，本研究发现PTEN缺失仅特异性激活AKT信号通路而非ERK信号通路，尽管既往研究提示PTEN缺失在进展期肿瘤中可通过激活ERK促进恶性表型^［11］，但我们发现在正常胆管上皮细胞恶性转化的起始阶段，AKT磷酸化是主导事件。这一差异表明，不同信号通路在癌变起始与发展阶段具有明确的功能分工，PTEN/AKT信号轴在胆管癌早期起源中可能扮演核心角色。

值得注意的是，在PTEN基因缺失引起H69细胞增殖的同时，细胞形态学也发生了显著改变。结合上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）标记蛋白的表达变化，特别是作为E-cadherin关键抑制因子的Snail表达水平显著上调^［12］，本研究证实PTEN缺失在正常人胆管上皮细胞中成功诱发了EMT。这一发现具有重要意义，因为EMT不仅是癌细胞获得侵袭性的基础，更是上皮细胞恶性转化的早期关键事件，它使细胞失去上皮极性、获得间质特性，从而易于突破生长限制并向恶性表型演变^［13］。本研究在遗传背景清晰的人正常胆管上皮H69细胞中直接表明PTEN缺失可独立诱发EMT，这一发现深化了对PTEN在胆管癌起源中作用的理解。尽管既往研究多聚焦于肝癌^［14］、乳腺癌^［15］和胆管癌^［16］中PTEN/AKT信号轴调控EMT的作用，但这些研究均无法区分PTEN缺失是癌变的原因还是肿瘤进展中伴随的结果。本研究在正常胆管上皮这一起源细胞中明确了PTEN缺失本身即足以驱动EMT相关表型转换，这很可能是胆管上皮细胞恶性转化进程中的一个早期关键驱动机制。我们推测，PTEN基因缺失通过解除对AKT等下游信号的抑制，进而活化Snail等EMT核心转录因子，最终促使胆管上皮细胞发生结构与功能的转化，逐步获得类间质细胞的增殖和生存优势。然而，PTEN缺失诱导EMT的具体上游分子机制仍有待进一步深入探索。

本研究在正常人胆管上皮细胞模型中证明，PTEN缺失可通过激活AKT信号通路及诱导EMT，直接驱动细胞的增殖与表型转化。这一发现为理解胆管癌的早期发病机制提供了新的视角，也提示针对PTEN缺失及其下游信号通路的干预，可能成为胆管癌预防或早期治疗的新策略。尽管目前针对胆管癌其他驱动基因（如FGFR2、IDH1）的靶向药物（如Pemigatinib、Infigratinib及Ivosidenib）已成功应用于临床^［17-19］，但对于PTEN缺失的胆管癌亚群，仍缺乏有效的靶向治疗方案。本研究构建的PTEN基因敲除H69细胞株，为填补这一空白提供了关键研究工具。利用该模型，未来可深入探索PTEN缺失特异性触发的致癌网络，筛选靶向PTEN/AKT信号轴或逆转EMT的化合物，并为开发针对PTEN缺失型胆管癌的精准治疗策略提供相关的临床前实验依据。

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基金资助

安徽省高校自然科学研究重大项目(2023AH040291)

安徽省高校自然科学研究重点项目(2024AH051288)

蚌埠医科大学自然科学重点项目(2023byzd077)