糖基化对电压门控型钾离子通道作用的研究进展

Research progress on the role of glycosylation in voltage-gated potassium channels

摘要

糖基化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰，通过影响电压门控型钾离子通道（Voltage-gated potassium^{channels，Kv）的结构、功能及膜定位，参与调控神经元兴奋性、心脏电生理等过程。近年来，研究发现特定糖链（如N-聚糖、O-聚糖）的添加或缺失可显著改变Kv通道的蛋白细胞膜定位、通道蛋白稳定性、门控特性及药物敏感性，且Kv通道糖基化水平异常与心律失常、癌症以及神经系统等疾病的关联性逐渐被揭示。本文综述了糖基化的主要类型及糖基化对Kv通道功能的影响，并探讨了Kv通道的糖基化与相关疾病的联系，旨在为相关疾病的研究和治疗提供新思路。}

Abstract

Glycosylation， as an important post-translational modification of proteins， regulates neuronal excitability， cardiac electrophysiology， and other processes by influencing the structure， function， and membrane localization of voltage-gated potassium channels（Kv）. In recent years， studies have found that the addition or loss of specific glycans （such as N-glycans and O-glycans） can significantly alter the membrane localization， protein stability， gating properties， and drug sensitivity of Kv channels. Moreover， the correlation between abnormal glycosylation levels of Kv channels and diseases， such as arrhythmia， cancer， and neurological disease， has been increasingly revealed. This review summarizes the main types of glycosylation and the impact of glycosylation on the function of Kv channels， and also explores the relationship between glycosylation of Kv channels and related diseases， aiming to provide new insights for the research and treatment of related diseases.

Graphical abstract

关键词

电压门控型钾离子通道 / 糖基化 / 心律失常 / 癌症 / 神经系统疾病

Key words

Voltage-gated potassium channels / Glycosylation / Arrhythmias / Cancer / Neurological disease

电压门控型钾离子通道（Voltage-gated potassium channels，Kv）是一类对膜电压变化高度敏感的钾离子通道亚型，其在调控细胞生理功能和信号传递等生理过程中扮演着重要角色。糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，通过在特定氨基酸残基（如天冬酰胺的N-糖基化或丝氨酸/苏氨酸的O-糖基化）上添加糖链，调控蛋白质的折叠、稳定性、亚细胞定位及功能^［1］。糖基化对人心脏的生理功能也起着重要作用，心脏中钠、钾通道的糖基化修饰若能维持正常功能，将有助于增强心肌电活动的稳定性，从而减少心律失常的发生。此外，内质网和高尔基体中的糖基化不足可能导致人类出现Ⅰ～Ⅳ型糖蛋白合成障碍综合征^［2-3］。因此，深入了解糖基化对Kv通道功能的影响，探索Kv通道糖基化与疾病之间的联系，可能为揭示人类疾病的发病机制以及开发新的防治策略提供线索和思路。

1 电压门控钾离子通道的概述

离子通道是一类跨膜蛋白，通过在细胞膜和细胞器膜上形成亲水性孔道使离子进行跨膜转运。钾离子通道广泛分布于人体组织、器官中，特异性允许钾离子跨膜流动，具有重要的生理和病理功能^［4］。其中，Kv通道作为钾离子通道的重要亚型，其开放和关闭受膜电位变化的精确调控。Kv通道由α亚基和若干个辅助亚基组成。在哺乳动物中，Kv通道的α亚基由大约40种基因编码，其被系统分为12个类别，包括Kv1～Kv12^［5］。每个α亚基由6个跨膜片段构成，其中前4个片段S1～S4共同构成了电压感受器结构域（Voltage-sensing domains， VSD），该部分能够敏感地检测并响应细胞膜上的电压变化。S5和S6共同组成孔结构域（Pore domain， PD），其对离子的选择性通过起着决定性作用^［5-6］。4个α亚基与若干个辅助亚基（如Kvβ1、Kvβ2、Kvβ3等）共同组成功能性Kv通道^［5］。根据Kv通道的生理特性，进一步细分为延迟整流钾离子通道、瞬时外向钾离子通道和钙激活型钾离子通道^［7］。延迟整流钾离子通道在心肌细胞动作电位复极化过程中发挥调节作用；瞬时外向钾离子通道在心脏正常活动中具有重要作用；而钙激活型钾离子通道则调节细胞兴奋性和肌肉紧张度。Kv通道的功能多样性不仅来源于不同亚基之间的组合，还包括α亚基或辅助亚基通过糖基化、磷酸化等翻译后修饰影响通道功能所产生的多样性，这些修饰可以单独或协同作用于Kv通道，形成复杂的调控网络^［8］。

2 糖基化修饰

糖基化是不同单糖或由单糖构成的结构各异的聚糖在糖基转移酶催化下连接到蛋白质分子上的酶促过程，这一过程主要在细胞的内质网和高尔基体中进行。与蛋白质的转录和翻译过程不同，糖基化是一个不依赖模板的动态过程^［9］。N-糖基化和O-糖基化是2种最常见的糖基化形式，其中聚糖通过N-糖苷键或O-糖苷键与多肽链相连（图1）。N-糖基化通常发生在一个特定的氨基酸序列Asn-X-Ser/Thr中，其中X代表除脯氨酸以外的任何氨基酸，而O-糖基化则将糖链转移到多肽链的丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸的羟基氧原子上^［10］。这些附着在蛋白质上的糖链对蛋白质的结构、稳定性和生物活性具有显著影响^［11］。在细胞表面，糖蛋白可与蛋白聚糖、糖脂和其他可溶性血浆成分组成糖萼，其在细胞信号转导、物质交换等生理过程中起着重要的作用^［12］。聚糖结构的特异性变化与细胞生理病理过程紧密相关，为我们理解细胞功能和疾病机制提供了新的视角。

2.1　N-糖基化修饰

N-糖基化修饰是指在糖基转移酶作用下，将尿苷二磷酸-乙酰氨基葡糖（Uridine diphosphate N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc）分子中的N-乙酰葡糖胺（N-acetylglucosamine，GIcNAc）转移至多萜醇载体，同时将甘露糖（Mannose，Man）和葡萄糖（Glucose，Glc）糖基逐个添加到糖链上。聚糖中的N-乙酰氨基葡糖（N-acetylglucosamine，N-GlcNAc）与蛋白多肽链中天冬酰胺残基的酰胺氮以共价键相连，产生N-连接型糖蛋白。糖蛋白分子中的天冬酰胺残基通常在含有Asn-X-Ser/Thr 3个氨基酸残基组成的特定氨基酸序列的情况下与聚糖连接，这一序列被称为糖基化修饰位点（图1）^［13］。尽管存在这种共识位点，但糖基化的发生并非总是必然，其可能受到多种因素的影响，比如该序列在目标蛋白中的具体位置以及氨基酸X的特性。

N-糖基化修饰具有多样性和复杂性，根据糖链组成的不同可将N-糖基化修饰分为高甘露糖型、复杂型和杂合型。N-糖基化修饰过程在内质网（Endoplasmic reticulum，ER）中启动，低聚糖前体从醇供体转移到目标蛋白的天冬酰胺残基上，形成未成熟的N-连接聚糖^［14］，随后，未成熟的N-连接聚糖的末端葡萄糖残基被修剪，这一步骤使得新生多肽链能够与内质网中的多种伴侣蛋白相互作用，如钙连接蛋白和钙网蛋白，这种相互作用对于新合成蛋白质的正确折叠起着关键作用^［15］。正确折叠的蛋白质随后进入分泌途径，并在高尔基体中进行进一步的糖基化修饰。相反，未能正确折叠的蛋白质则被导向内质网相关降解（ER-associated protein degradation，ERAD）途径，从而被分解和清除^{［10，16］}。N-糖基化通过影响蛋白质的折叠、稳定性、细胞内运输以及与其他生物分子的相互作用，在蛋白质的生物合成和功能中发挥着重要作用，其发生机制及功能的阐明对于理解细胞生理过程和相关疾病的发病机制具有重要意义^［17］。

2.2　O-糖基化修饰

O-糖基化修饰是一种将寡糖链连接到蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基的羟基上的生物化学过程，其中N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine， GalNAc）是形成O-连接糖蛋白的关键组分。多肽链合成后，GalNAc在糖基转移酶作用下转移至多肽链的丝氨酸或苏氨酸残基的羟基上，然后逐个加上糖基，形成O-连接聚糖。O-连接聚糖通常由GalNAc与半乳糖构成的核心二糖进一步重复延长及分支构成。近年来，O-糖基化的一种特殊形式，O-乙酰氨基葡萄糖胺（O-linked beta-N-acetylglucosamine， O-GlcNAc）单糖基化修饰，受到了广泛关注。O-GlcNAc糖基化通过O-糖苷键将β-N-乙酰氨基葡萄糖胺添加到蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上，涉及细胞核、细胞质、线粒体等部位的蛋白质和跨膜蛋白。尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺（Uridine dipho-sphate N-acetylglucosamine， UDP-GlcNAc）作为直接的糖供体，参与了这一过程^［18］，O-GlcNAc糖基转移酶（O-GlcNAc transferase， OGT）和β-N-乙酰葡萄糖胺酶（O-GlcNAcase， OGA）负责O-GlcNAc糖基化循环^［19］，其表达和大脑的活动及年龄有关。另外，O-GlcNAc糖基化修饰发生位点也常是蛋白质丝/苏氨酸磷酸化位点，两者的修饰行为存在相互拮抗关系，共同参与信号通路的调节过程。综上所述，O-GlcNAc糖基化修饰在调节免疫细胞的信号转导、内质网应激以及自噬等方面发挥着重要作用^［20］。

3 糖基化在电压门控型钾离子通道中的作用

近年来，糖基化作为一种动态可逆的蛋白质修饰方式，在Kv通道的膜定位、通道蛋白稳定性、门控特性和药物敏感性调控中具有重要作用。N-连接和O-连接糖基化可通过改变Kv通道的构象动力学、调节其与细胞外基质的相互作用，进而影响通道的电生理特性^［21］。深入解析糖基化对Kv通道的调控机制，不仅有助于阐明相关疾病的发病机制，也为开发新型靶向治疗策略提供了理论依据。

3.1　蛋白细胞膜定位

Kv通道的N-糖基化是一个复杂的过程，对蛋白质的折叠、成熟、稳定性和运输等具有重要影响，决定了功能通道在细胞膜的表达水平^［22-24］。研究显示，相比于野生型，糖基化缺陷的Kv1.2-N207Q突变体在神经元细胞膜上的表达量下降了约60%，且其从膜上内化后的降解速率加快了1倍以上，而仅去除糖链末端的唾液酸即可完全重现此不稳定效应。因此，Kv1.2通道的N-糖基化不仅促进其向细胞膜的正向运输，更通过糖链末端的唾液酸来增强内化后通道的稳定性，从而显著提高细胞膜上的通道密度^［21］。对野生型和突变体（缺乏N-糖基化位点）Kv3.1通道的研究发现，糖基化对于该通道在细胞膜的正确折叠和表达亦是至关重要^［25］。Kv12.2通道拥有丰富的N-糖基化位点，正常进行糖基化修饰的Kv12.2通道可以被运输到细胞膜，但未发生糖基化的Kv12.2通道向细胞膜的运输受阻^［26］。在关于Kv10.1通道糖基化的一项研究表明，Kv10.1通道至少有一个糖基化位点进行糖基化才能在细胞质膜上表达^［22］。人类ether-à-go-go-related相关基因（Human ether-à-go-go-related gene，HERG）编码的HERG通道（又称Kv11.1通道）的糖基化修饰在通道的膜定位过程中发挥着重要作用。HERG钾通道蛋白的2个N-糖基化位点（N598Q和N629Q）的突变，导致HERG-GFP在HEK293细胞中主要定位于核周亚细胞区域，而缺乏细胞质膜表达^［27］。除了Kv通道α亚基，Kv通道的辅助亚基也参与调控通道的糖基化及转运^［28］，并且辅助亚基的糖基化也影响Kv通道复合物在细胞膜上的表达（图2）。KCNE1的糖基化若受到抑制，将显著降低KCNQ1-KCNE1通道的转运能力，并减少通道复合物在细胞膜上的表达^［29］。DPP10是一种跨膜糖基化蛋白，属于二肽基氨肽酶蛋白（Dipeptidy peptidase-like proteins，DPLPs）家族，有研究^［30］发现阻断DPP10糖基化使DPP10细胞膜定位显著减少，并改变了Kv4通道细胞质膜表达。

3.2　通道蛋白稳定性

Kv通道的N-糖基化在维持蛋白质稳定性方面发挥着关键作用。抑制该过程不仅会降低通道蛋白的稳定性，导致其在内质网中大量滞留，还会减少细胞膜表面的蛋白表达量。同时，糖基化的改变（如糖基化位点突变）也会使总蛋白与膜表面蛋白的半衰期表现出差异，糖基化位点突变体的总蛋白和膜蛋白的半衰期都显著缩短。以Kv1.4通道为例，N354Q突变体与野生型Kv1.4通道相比，其膜蛋白与总蛋白的比率显著降低，仅为0.35。进一步分析显示，Kv1.4通道和Kv1.4通道N354Q突变体的总蛋白半衰期分别为6.3 h和3.8 h，而位于细胞膜的蛋白半衰期分别为5.3 h和1.8 h，提示与野生型Kv1.4通道相比，Kv1.4通道N354Q突变体的总蛋白和膜蛋白的半衰期都显著缩短，从而影响了其在细胞膜的稳定性和功能^［31］。

3.3　门控特性

糖基化对Kv通道电压门控特性的影响是多方面的，并且这种影响在不同通道类型甚至同一亚族内也表现出显著差异。例如，Kv3.1通道的激活特性受糖基化修饰的影响。与野生型Kv3.1通道相比，非糖基化的Kv3.1通道突变体（N220Q/N229Q）的激活需要更强的去极化（约+4 mV的正向移动），即其电压依赖性向更正的电位偏移。此外，非糖基化突变体的激活速率显著慢于野生型，表现为在相同电压下电流上升时间延长、激活时间常数增大。这些发现表明，N-糖基化位点是否发生糖基化对Kv3.1通道的电压依赖性激活动力学起着决定性作用^［25］。另外，通道的门控特性也受到聚糖结构的影响，例如聚糖末端的唾液酸化（Sialylation）。唾液酸化是由一种或多种唾液酸转移酶和唾液酸酶应用共同的唾液酸供体催化合成的糖基化后期修饰过程，唾液酸残基常见于N-糖链或O-糖链的末端^［32］。唾液酸化的减少可导致Kv1.5通道电压依赖性激活发生较大的向去极化方向偏移，这种差异可能与S1-S2连接体的长度和氨基酸组成有关^［33］。类似地，如果Kv1.1通道缺乏N-糖基化，特别是缺乏唾液酸化，将会影响Kv1.1通道的门控特性，具体表现为Kv1.1通道的激活减慢，C型失活动力学改变，并在稳态激活曲线上产生向去极化方向偏移^［34］。另一项研究也证实，Kv1.1通道的N-糖基化确实改变了其门控特性，这种影响主要由附着在聚糖上的唾液酸残基引起^［35］。对于Kv4.2和Kv4.3通道，唾液酸通过O-糖链连接对2种通道的激活产生显著影响，但不影响其电压依赖性稳态失活^［36］。此外，对Kv12.2通道的研究表明，只有糖基化的Kv12.2通道才显示出正常的电压依赖性，去除糖链会导致通道稳态激活发生向去极化方向偏移，但与Kv1通道家族不同的是，这种偏移似乎并非由于糖链中带负电荷的唾液酸残基所致^{［26，37］}。

3.4　药物敏感性

Kv通道的糖基化对其功能和药物敏感性有着显著影响。例如，心脏HERG通道和经N-糖基化位点突变的MinK相关肽（MinK-related peptide 1，MiRP1）所构成的Kv通道对磺胺甲恶唑抗生素（Sulfamethoxazole，SMX）的敏感性显著增加，提示MiRP1不完全的N-糖基化是导致SMX具有高亲和力作用的关键因素^［38］（图2）。此外，喷他脒（Pentamidine， PTM）通过干扰HERG通道的完全糖基化，阻断了快速激活延迟整流钾通道（Rapidly activating delayed rectifier K⁺ channel， I_kr），导致细胞质膜上出现较少成熟的HERG^［39］。另有研究^［40］显示，帽柱木碱能够显著降低完全糖基化的HERG1a蛋白表达，同时提高核心糖基化表达和HERG1a-Hsp90的结合，使HERG1a的运输受到干扰。这些结果揭示药物可能通过影响Kv通道的糖基化过程，从而导致QT间期延长并增加尖端扭转型室性心动过速（Torsade de pointes， TdP）的风险^［40］。

4 电压门控型钾离子通道糖基化修饰与疾病的联系

Kv通道的糖基化修饰对其功能至关重要，其异常可通过改变通道表达与门控特性诱发疾病。先天性糖基化障碍（Congenital disorders of glycosylation，CDGs）造成广泛的糖基化缺陷，其临床表征之一——致命性心律失常，即与Kv通道功能紊乱密切相关^［41］。此外，特定的Kv通道糖基化异常也常见于神经系统疾病与癌症等病理过程。

4.1　心律失常

心脏动作电位（Actin potential，AP）是由细胞内离子通道和转运体组成的跨膜蛋白的打开和关闭决定的，动作电位产生和传导的紊乱会导致心律失常，进而影响心脏收缩，最终可能引发起源于心房的血栓栓塞性中风或心源性猝死^［42］。值得注意的是，心脏中的Kv通道高度糖基化，其聚糖结构可占成熟通道质量的30%以上，这些附着在离子通道上的聚糖通过亚型特异性机制调节通道活性，从而精细调控心脏电信号的传导^［43］。在心脏电活动中，Kv通道发挥了关键作用，Kv通道糖基化的改变可能影响动作电位持续时间，进而导致心律失常，如长QT综合征（Long QT syndrome， LQTS）、Brugada综合征（Brugada syndrome， BrS）等^［44］。LQTS主要特征为心电图QT间期延长与T波异常，该病症易导致患者发生室性心律失常，特别是TdP、晕厥及猝死。HERG基因是编码心脏中快速激活的延迟整流钾通道的成孔亚基，HERG基因突变常可导致2型长QT综合征（Long QT syndrome type 2， LQT2）^［27］。研究显示约90%的LQT2相关错义突变会干扰HERG通道蛋白从内质网向细胞膜的运输，这些突变可能影响通道蛋白的折叠、组装、稳定性，或者干扰其与分子伴侣蛋白的相互作用^［45］。HERG通道的糖基化有利于通道的表面表达^［27］和维持心脏电活动^［46］。在LQT综合征患者中发现的2个HERG错义突变（N629S和N629D）破坏了糖基化位点^［47］。此外，有研究^［48］发现，HERG通道突变Y611H和V822M突变体会使HERG通道的糖基化形式不完全和表面表达改变，同时会伴有心律失常。BrS是一种遗传性心律失常疾病，研究发现BrS患者的血浆和外周血单个核细胞中的蛋白唾液酸化水平显著降低，唾液酸化转移酶的表达也发生了变化^［49］。以上研究提示Kv通道的糖基化修饰异常与心律失常之间存在着密切联系，且心血管疾病（Cardiovascular diseases， CVD）目前仍然是导致人类患病与死亡的主要原因，深入理解其分子机制对于预防和治疗心律失常具有重要意义。

4.2　癌症

钾离子通道的糖基化状态与癌症的发生、发展和生物学特性密切相关。糖基化不仅影响钾离子通道的活性、稳定性和膜分布，还通过调节细胞代谢（如糖酵解和谷氨酰胺代谢）和细胞生物学特性（如增殖、迁移和凋亡）来促进癌细胞的恶性行为^［50］。研究发现，N-聚糖的分子结构显著影响细胞迁移，并且产生糖基化通道的细胞比产生非糖基化通道的细胞迁移更快^［51］。Kv3.1通道中N-连接聚糖的糖链组成对细胞迁移能力有明显影响，产生复杂型N-连接聚糖的Kv3.1通道的细胞迁移速度要比产生寡甘露糖型N-连接聚糖以及双分支型N-连接聚糖的Kv3.1通道的细胞更快^［52］。在神经母细胞瘤细胞B35中开展的一项研究进一步证明了N-糖基化对Kv3.1通道的细胞分布和聚集的重要性，完全糖基化的Kv3.1b通道在细胞突起中分布较多，而未糖基化的Kv3.1b通道则更多分布在细胞体中^［53］。这种分布差异与细胞迁移速率相关，完全糖基化的Kv3.1b通道表达的细胞具有更快的迁移速率。因此，钾离子通道的糖基化可能通过影响其在细胞中的定位来调节细胞的迁移能力，从而影响癌细胞的扩散。另有研究^［54］也表明Kv3.1通道缺乏一个或两个糖基化位点会减慢神经母细胞瘤细胞的迁移速率。综上所述，钾离子通道的糖基化在癌症的发生、发展和转移中发挥着重要作用，对Kv通道糖基化修饰的研究，可能为癌症的干预和治疗策略带来新的机会。

4.3　神经系统疾病

Kv通道广泛存在于兴奋性和非兴奋性细胞膜上，并参与细胞电冲动的发放和内分泌的调节，与神经元活动密切相关^［55］。在神经系统中，Kv通道糖基化，尤其是唾液酸化，对通道功能发挥有着重要影响，任何导致通道糖基化或唾液酸化过程的缺陷都可能成为神经或神经肌肉疾病的病因。在蛋白质N-糖基化缺陷的患者中，观察到了一系列严重的神经系统症状，包括显著的发育迟缓、视觉接触障碍、感音神经性耳聋、肌张力减退、癫痫发作、小头畸形、进食困难以及整体发育不良等^［56］。Kv3.1通道是高频神经元放电的核心调控者，其功能异常与多种神经和免疫疾病相关。研究表明，Kv3.1通道具有2个绝对保守的N-糖基化位点，若其N-糖基化位点未被糖链占据，虽仍能被转运至细胞膜，但通道激活速率变慢、电压依赖性发生正向偏移^［57］；进一步研究发现，糖链类型（复合型vs杂合型）的差异不仅改变Kv3.1通道在神经突和细胞体中的亚膜定位，还显著调节通道的开放/关闭动力学，而糖基化缺失则导致通道功能受损、空间分布异常^［58］。表明，N-糖基化修饰异常（如先天性糖基化缺陷CDG或神经退行性疾病相关的糖基化障碍）可能通过破坏Kv3.1通道正常的糖基化修饰，影响神经元兴奋性，参与神经系统疾病的发生发展。

5 小结与展望

综上，电压门控型钾离子通道及其辅助亚基的N-或O-糖基化修饰在调节通道的门控特性、膜定位、药物敏感性等方面起关键作用，其异常与心律失常、神经系统疾病等多种病理状况密切相关（表1），为疾病的特异性诊断和治疗提供了新的可能性。尽管大量研究已经证实了Kv通道糖基化的重要生物学作用，但目前的研究仍然受到多糖链结构的复杂性和多样性、多糖链合成过程的动力学以及结构与功能之间缺乏直接的一对一线性关系的限制。例如，肿瘤细胞的异质性使不同的细胞和组织可以表现出不同的Kv通道糖基化模式，进一步使Kv通道糖基化研究复杂化。另外，Kv通道糖基化导致神经系统疾病和CVD的具体机制仍未明确，进一步研究这一复杂的生化过程仍然具有挑战性。随着蛋白组学、基因组学与糖组学等前沿技术的不断突破，Kv通道糖基化的分子细节及其与疾病的关系正被逐步揭示。未来，这些多组学手段的交叉融合必将深化我们对糖基化如何精细调控Kv通道结构-功能互作的理解，并为神经系统及免疫相关疾病的精准干预提供新靶点与新策略。

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基金资助

江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ2201447)

江西省大学生创新训练计划项目(S202410413021)