孕激素相关子宫内膜蛋白在肝细胞癌预后及免疫调节中作用的生物信息学分析

Bioinformatics analysis of the role of PAEP in the prognosis and immune regulation of hepatocellular carcinoma

摘要

目的 系统评估孕激素相关子宫内膜蛋白（Progestagen-associated endometrial protein，PAEP）在肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）中的表达特征、预后价值及其在肿瘤微环境调控中的作用。 方法 基于TCGA数据集中HCC RNA-seq数据（包含371例HCC样本和50例癌旁样本），首先评估PAEP在HCC中的差异表达情况，并分析PAEP与HCC预后的关系；然后，基于24种免疫细胞特征基因集，分析PAEP与HCC免疫细胞浸润的关系。 结果 PAEP在HCC中显著高表达，其表达水平与患者的不良预后显著相关（OS HR=1.82，95%CI：1.28～2.58；DSS HR=1.73，95%CI：1.10～2.70）。基于PAEP的预后模型显示出良好的预测效能（3年AUC=0.720；5年AUC=0.766）。肿瘤免疫微环境分析表明，PAEP表达与HCC中巨噬细胞、Th2细胞等的浸润程度呈正相关，而与Th17细胞、CD8⁺ T细胞等的浸润程度呈负相关。 结论 PAEP可能通过调控肿瘤免疫微环境促进HCC进展，并影响HCC预后，其可能成为联合免疫治疗的潜在靶点。

Abstract

Objective : To systematically evaluate the expression profile of progestagen-associated endometrial protein（PAEP） in hepatocellular carcinoma （HCC）， its prognostic value， and its potential role in regulating the tumor microenvironment （TME）. Methods RNA-seq data of HCC from TCGA database （371 HCC and 50 adjacent non-tumor tissues） were analyzed to assess the differential expression of PAEP and its association with prognosis. The relationship between PAEP expression and immune cell infiltration was evaluated based on 24 immune cell signature gene sets. Results PAEP was significantly overexpressed in HCC， and elevated expression was strongly associated with poor prognosis （OS HR=1.82， 95%CI： 1.28-2.58； DSS HR=1.73， 95%CI： 1.10-2.70）. The PAEP-based prognostic model exhibited good predictive performance （3-year AUC=0.720； 5-year AUC=0.766）. Immune microenvironment analysis revealed that PAEP expression was positively correlated with macrophage and Th2 cell infiltration， but negatively correlated with Th17 and CD8⁺T cell infiltration. Conclusion PAEP may promote HCC progression and influence prognosis by modulating the tumor immune microenvironment and as such could become a potential target for combined immunotherapy.

Graphical abstract

关键词

肝细胞癌 / 孕激素相关子宫内膜蛋白 / 生物信息学 / 预后

Key words

Hepatocellular carcinoma / Progestagen-associated endometrial protein / Bioinformatics / Prognosis

原发性肝癌作为全球第6大常见恶性肿瘤及第3大癌症致死病因，其恶性程度高、侵袭性强且预后极差^［1］。根据2022年《全球癌症统计报告》，全球肝癌新发病例约86.5万例，死亡75.8万例^［2］。肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是肝癌的主要亚型（占比80%～90%），研究发现HCC与慢性乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病以及黄曲霉毒素暴露等危险因素密切相关^［3］，但其发病机理复杂，值得深入研究。

孕激素相关子宫内膜蛋白（Progestagen-associated endometrial protein，PAEP）是一种分泌型糖蛋白，属于脂质运载蛋白家族成员^［4］。近年来，PAEP在肿瘤中的作用日益受到关注。PAEP在非小细胞肺癌中显著高表达，其高水平与女性患者预后不良及疾病进展相关，且血清PAEP可作为复发和转移的指标^［5］；在乳腺癌中，PAEP通过血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor， VEGF）通路促进肿瘤细胞迁移和血管形成，并通过影响肿瘤免疫微环境从而引起免疫逃逸^［6］。然而，PAEP在HCC中的表达及其具体生物学功能和机制尚未见报道。

综上，本文拟基于HCC高通量测序数据，分析PAEP在HCC中的表达及其与HCC预后的关系，评估其在HCC发生发展中的作用，并为HCC的发病机理研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1　数据来源和预处理

本文分析的HCC RNA-seq高通量测序数据来自TCGA数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov），共包含371例HCC样本和50例癌旁样本，简称TCGA-LIHC。TCGA-LIHC数据均采用TPM标准化处理，并进行了Log₂（TPM+1）转化。同时，为了研究PAEP与HCC预后的关系，本文还从TCGA数据库中下载了371例HCC患者的临床预后数据。为验证PAEP在HCC及正常组织中的蛋白表达差异，本研究利用人类蛋白图谱（Human Protein Atlas，HPA，网址：http：//www.proteinatlas.org）数据库获取并分析其免疫组织化学（Immunohistochemistry， IHC）数据。

1.2　差异表达分析

在FDR＜5%且|log₂（FC）|＞0.5的条件下，采用R包“limma”识别PAEP在不同组织间表达，通过Wilcoxon秩和检验进行评估。

1.3　生存分析

依据PAEP表达的中位值将TCGA-LIHC队列分为高、低表达2组，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并通过Log-rank检验评估组间生存差异的显著性。利用R包“survival”中的coxph函数进行单因素及多因素Cox回归分析。基于多因素分析确定的独立预后因子构建列线图预测模型，并采用R包“timeROC”绘制时间依赖性ROC曲线，评估模型在3年及5年的预测准确性。

1.4　功能富集分析

本文基于GO和KEGG数据库对差异基因进行功能富集分析。在FDR＜5%条件下筛选显著富集的生物学过程，并通过R包“clusterProfiler”实现。

1.5　免疫浸润情况分析

基于BINDEA G等^［7］提供的24种免疫细胞特征基因集，本文利用单样本基因集富集分析（Single-sample gene set enrichment analysis， ssGSEA）算法，评估各免疫细胞在样本中的免疫浸润得分。

2 结果

2.1　PAEP在HCC中的差异表达

基于TCGA-LIHC数据集（50例癌旁样本，371例HCC样本）分析PAEP在HCC中的表达情况，发现PAEP在HCC中的表达水平显著高于癌旁组织（P＜0.001）（图1A）。在50例配对样本（癌旁vs HCC）中，也同样观察到PAEP的表达水平在HCC中显著升高（P＜0.001）（图1B）。进一步对比HPA数据库提供的PAEP在正常和病理组织的免疫组化图像，发现与正常组织相比，HCC组织间染色更深（图2）。以上结果表明，PAEP在HCC中存在异常高表达。

2.2　PAEP与HCC预后关系

根据TCGA-LIHC数据集中371例HCC样本的PAEP表达水平中值，将HCC患者分为高、低表达2组，比较2组间总体生存时间（Overall survival，OS）和疾病特异生存时间（Disease specific survival，DSS）。结果显示，PAEP高表达患者的OS和DSS均显著低于PAEP低表达患者（图3）。为评估PAEP的预后价值，分别进行了单因素与多因素Cox回归分析。发现在控制其他临床特征的情况下，PAEP仍是HCC的不良预后因素（P＜0.001）（图4）。为进一步实现预后的量化预测，基于多因素分析中确定的独立预后因子构建了列线图预测模型。时间依赖ROC曲线显示，该预测模型在3年和5年的AUC值分别为0.720、0.766，提示其具有良好的预测效能（图5）。综上，PAEP与HCC患者的预后密切相关，并具有潜在的预后风险预测价值。

2.3　PAEP在肝癌中的潜在生物学功能及其相关分子机制

为了探索PAEP在肝癌中的生物学功能和分子机制，利用R包“limma”在FDR＜5%和|log₂（FC）|＞0.5的条件下分析PAEP高、低表达组差异表达基因，最终获得2 317个差异表达基因。基于GO和KEGG数据库对这些差异基因进行功能富集分析，结果显示这些差异基因主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、白细胞迁移以及IL-17信号通路等生物学过程（图6）。这些通路与肿瘤免疫密切相关，提示PAEP可能与HCC的免疫浸润相关。进一步地，基于BINDEA G等^［7］提供的24种免疫细胞特征基因集，利用ssGSEA算法对各免疫细胞在HCC样本中的浸润情况进行评估，结果显示PAEP表达与巨噬细胞、Th2细胞和CD56bright NK细胞浸润程度呈正相关，与Th17细胞、嗜酸性粒细胞和CD8⁺ T细胞浸润程度呈负相关（图7）。提示PAEP可能与肿瘤免疫细胞浸润相关。

3 讨论

HCC是全球第6大常见恶性肿瘤，约70%的患者因诊断滞后而错失根治机会^［8］。我国每年新发病例数超过41万，占全球总数的46.7%^［9］。当前治疗手段虽有一定疗效，但术后高复发与耐药性问题仍十分突出^［10］，亟需探索HCC早期诊断标志物与治疗新靶点。PAEP作为分泌型糖蛋白，参与调控多种癌症的进程^［11-13］，但其在HCC中的作用机制及其与肿瘤微环境的作用尚不明确。因此，本研究基于其在HCC中的表达特征，探讨PAEP作为潜在生物标志物的临床应用前景及其在肿瘤免疫微环境中的作用机制，以期为HCC诊疗提供新思路。

本研究首先联合TCGA和HPA数据分析了PAEP在HCC中的表达情况，结果显示PAEP在HCC组织中的表达水平均显著高于癌旁组织。进一步分析表明，PAEP高表达与HCC患者较短的OS显著相关，且单变量和多变量Cox回归分析均证实PAEP是HCC的独立预后因子，与LIANG J Y等^［14］研究结果一致。

为探讨PAEP在HCC中的生物学功能，本研究通过KEGG分析揭示了其潜在机制。KEGG分析揭示PAEP相关基因显著富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、PI3K-Akt和MAPK信号通路，提示PAEP可能通过调控炎症反应和细胞增殖信号促进HCC进展。值得注意的是，免疫浸润分析发现PAEP表达与具有免疫抑制/促瘤功能的巨噬细胞、Th2细胞和CD56bright NK细胞浸润程度呈正相关；而与发挥抗肿瘤作用的CD8⁺ T细胞、Th17细胞和嗜酸性粒细胞浸润程度呈负相关。这种同时增强免疫抑制、削弱免疫杀伤的微环境重构，是PAEP驱动肝癌进展的重要机制，PAEP可能通过抑制抗肿瘤免疫应答促进HCC免疫逃逸。RICHTMANN S等^［15］在非小细胞肺癌的研究中发现，PAEP通过分泌IL-10和TGF-β等抗炎因子，促进巨噬细胞向M2表型极化。此外，LIAN W等^［16］研究进一步证实，PAEP可通过上调树突状细胞表面OX40L表达水平，诱导初始CD4⁺ T细胞向Th2方向分化，这与我们观察到的Th2细胞浸润增加的现象相一致。

尽管本研究为PAEP在HCC中的作用提供了新的见解，但仍存在局限性。首先，本研究主要基于生物信息学分析，缺乏体内外实验验证，限制了结果的推广性。其次，TCGA和HPA数据库的样本量有限，可能影响分析的统计效力。未来应结合细胞和动物模型进一步验证PAEP在HCC中的具体功能，并探索其与PI3K-Akt通路及肿瘤免疫微环境的相互作用机制。此外，PAEP在HCC中的铁死亡相关功能及作为治疗靶点的可行性也值得深入研究。

综上所述，本研究从生物信息学角度揭示了PAEP在HCC中的高表达、独立预后价值及其潜在的促肿瘤机制。作为HCC的重要预后因子和潜在治疗靶点，PAEP有望为HCC的诊断和治疗提供新的思路。

参考文献

[1] BROWN Z J， TSILIMIGRAS D I， RUFF S M， et al. Management of hepatocellular carcinoma： a review［J］. JAMA Surg， 2023，158（4）：410-420.

[2] BRAY F， LAVERSANNE M， SUNG H， et al. Global cancer statistics 2022： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries［J］. CA Cancer J Clin， 2024，74（3）：229-263.

[3] GANESAN P， KULIK L M. Hepatocellular carcinoma： new developments［J］. Clin Liver Dis， 2023，27（1）：85-102.

[4] SAWYER L. β-lactoglobulin and glycodelin： two sides of the same coin？［J］. Front Physiol， 2021，12：678080.

[5] SCHNEIDER M A， GRANZOW M， WARTH A， et al. Glycodelin： a new biomarker with immunomodulatory functions in non-small cell lung cancer［J］. Clin Cancer Res， 2015，21（15）：3529-3540.

[6] CUI J， LIU Y， WANG X. The roles of glycodelin in cancer development and progression［J］. Front Immunol， 2017，8：1685.

[7] BINDEA G， MLECNIK B， TOSOLINI M， et al. Spatiotemporal dynamics of intratumoral immune cells reveal the immune landscape in human cancer［J］. Immunity， 2013，39（4）：782-795.

[8] ZHAO L Y， YANG D D， MA X K， et al. The prognostic value of aspartate aminotransferase to lymphocyte ratio and systemic immune-inflammation index for overall survival of hepatocellular carcinoma patients treated with palliative treatments［J］. J Cancer， 2019，10（10）：2299-2311.

[9] XIU B， CHI Y， LIU L， et al. LINC02273 drives breast cancer metastasis by epigenetically increasing AGR2 transcription［J］. Mol Cancer， 2019，18（1）：187.

[10] JI G W， ZHU F P， XU Q， et al. Radiomic features at contrast-enhanced CT predict recurrence in early stage hepatocellular carcinoma： a multi-institutional study［J］. Radiology， 2020，294（3）：568-579.

[11] PEARSON-FARR J， WHEWAY G， JONGEN M S， et al. Endometrial gland specific progestagen-associated endometrial protein and Cilia gene splicing changes in recurrent pregnancy loss［J］. Reprod Fertil， 2022，3（3）：162-172.

[12] NI Z， ZHANG L， ZHENG J， et al. Glycodelin as a biomarker of advanced lung adenocarcinoma brain metastases in patients treated with EGFR tyrosine kinase inhibitors［J］. Cancer Manag Res， 2019，11：9421-9425.

[13] SCHNEIDER M A， MULEY T， WEBER R， et al. Glycodelin as a serum and tissue biomarker for metastatic and advanced NSCLC［J］. Cancers （Basel）， 2018，10（12）：486.

[14] LIANG J Y， WANG D S， LIN H C， et al. A novel ferroptosis-related gene signature for overall survival prediction in patients with hepatocellular carcinoma［J］. Int J Biol Sci， 2020，16（13）：2430-2441.

[15] RICHTMANN S， MARWITZ S， MULEY T， et al. The pregnancy-associated protein glycodelin as a potential sex-specific target for resistance to immunotherapy in non-small cell lung cancer［J］. Transl Res， 2024，272：177-189.

[16] LIAN W， ZHENG X. Identification and validation of TME-related signatures to predict prognosis and response to anti-tumor therapies in skin cutaneous melanoma［J］. Funct Integr Genomics， 2023，23（2）：153.

基金资助

江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ2201433)

江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ211533)