3-巯基丙酮酸硫基转移酶敲低稳转神经胶质瘤细胞系的构建及表达

Expression and construction of stable cell lines with MPST knockdown in glioblastoma cell

摘要

目的 构建3-巯基丙酮酸硫基转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase， MPST）敲低的神经胶质瘤稳转细胞系GSC1023和GBM0709，并分析MPST在神经胶质瘤细胞内的定位。 方法 设计并合成2对MPST-shRNA干扰序列，连接到pLKO.1-Puro慢病毒载体上，构建敲低MPST基因的慢病毒载体pLKO.1-MPST-shRNA并感染人源神经胶质瘤干细胞GSC1023和神经胶质瘤细胞GBM0709。用嘌呤霉素筛选稳定敲低MPST基因的神经胶质瘤细胞系GSC1023和GBM0709。采用RT-qPCR、蛋白质免疫印迹（Western blot）和免疫荧光检测细胞中MPST的表达。 结果 成功构建敲低MPST基因的GSC1023和GBM0709稳转细胞系；RT-qPCR结果显示敲低MPST基因GSC1023和GBM0709稳转细胞系中MPST基因mRNA表达量显著降低（P＜0.05）；Western blot结果显示敲低MPST基因GSC1023和GBM0709稳转细胞系中MPST蛋白表达量显著降低（P＜0.05）；免疫荧光结果显示在神经胶质瘤细胞中MPST主要定位于线粒体。 结论 成功构建了稳定敲低MPST基因的GSC1023和GBM0709神经胶质瘤细胞系，为进一步探讨MPST介导的内源性H₂S在神经胶质瘤发生发展的影响奠定了基础。

Abstract

Objective To construct the glioma stable cell lines GSC1023 and GBM0709 with knockdown of 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase （MPST）， and to analyze the localization of MPST in glioma cells. Methods Two pairs of MPST-shRNA interference sequences were designed and synthesized， then ligated into the pLKO.1-Puro lentiviral vector to construct the lentiviral vector pLKO.1-MPST-shRNA for MPST gene knockdown. This constructed vector was used to infect human glioma stem cells （GSC1023） and glioma cells （GBM0709）. Subsequently， puromycin was employed to screen and establish stable MPST-knockdown glioma cell lines， namely GSC1023 and GBM0709. RT-qPCR， western blot， and immunofluorescence were used to detect MPST expression in cell lines. Results GSC1023 and GBM0709 stable cell lines with the MPST gene knockdown were successfully constructed. The results of RT-qPCR showed that the expression of MPST gene in stably knockdown cell lines were decreased significantly （P＜0.05）； the results of western blot showed that the expression of MPST in stably knockdown cell lines were decreased significantly （P＜0.05）. The results of immunofluorescence showed that MPST was mainly localized in mitochondria. Conclusion The stable glioma cell lines GSC1023 and GBM0709 with MPST knockdown were successfully established， laying a foundation for further exploration of the influence of MPST-mediated endogenous H₂S on the occurrence and development of glioma.

Graphical abstract

关键词

神经胶质瘤 / 3-巯基丙酮酸硫基转移酶 / 基因敲低技术

Key words

Glioblastoma / 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase / Gene knockdown techniques

神经胶质瘤是一种常见的中枢神经系统恶性肿瘤，其中以胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）侵袭性最强、致死率最高^［1］，患者确诊GBM后的平均生存时间仅为14个月^［2］。大脑微环境由细胞外基质、免疫细胞、微血管及内皮细胞等多种组分构成，这些成分的改变在GBM的发生、进展及耐药机制中均发挥关键作用^［3-5］。因此，我们需要深入探索GBM发生发展过程中的关键成分的改变，并进一步筛选可用于临床干预有效的分子靶点，这对提高GBM患者预后具有重要的临床意义。

硫化氢（Hydrogen sulfide，H₂S）作为一种新型气体分子在肿瘤发生发展中具有重要作用^［6-9］。有研究^［10］发现内源性H₂S与神经胶质瘤密切相关，H₂S供体NaHS可通过半胱天冬酶依赖性途径触发C6胶质瘤细胞凋亡。ZHEN Y等^［11］研究发现，H₂S通过激活p38 MAPK/ERK1/2-COX-2通路，进而下调Caspase-3的表达，最终促进C6胶质瘤细胞增殖与抗凋亡，增加细胞存活率，因此我们推测H₂S对胶质瘤细胞的促肿瘤或抑制肿瘤功能可能与H₂S含量和H₂S合成酶的种类有关。3-巯基丙酮酸硫基转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，MPST）是H₂S合成酶，主要分布于脑和视网膜神经元^［12］。研究发现MPST可促进中枢神经系统中H₂S的生成，从而促进过硫化物的形成、达到抗氧化效果^［13］，其次MPST也能减少神经胶质细胞介导的炎症反应^［14］，提示MPST对神经细胞具有保护作用。BRONOWICKA-ADAMSKA P等^［12］发现MPST在人星形胶质母细胞瘤（U-87 MG）和人神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞中高表达，但未阐明其在神经母细胞瘤中的作用机制。以上研究提示MPST可能在脑肿瘤中具有重要作用，但在神经胶质瘤中的作用尚不明确。

基于此，本研究以人源神经胶质瘤干细胞（GSC1023）、人源神经胶质瘤细胞（GBM0709）为研究细胞，通过构建MPST-shRNA重组慢病毒载体，建立稳定敲低MPST基因GSC1023和GBM0709细胞系，通过激光共聚焦显微镜观察MPST在神经胶质瘤细胞中的定位情况，为后续研究MPST介导的H₂S在神经胶质瘤中的作用奠定基础，并为GBM的治疗提供新思路与途径。

1 材料与方法

1.1　实验材料与试剂

293T细胞购买于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；神经胶质瘤干细胞GSC1023和神经胶质瘤细胞GBM0709来源于南方医科大学南方医院GBM患者，通过手术切除的神经胶质瘤组织提取并进行细胞培养获得，2种细胞均验证符合神经胶质瘤干细胞和神经胶质瘤细胞特征；慢病毒载体pLKO.1-Puro和包装质粒（pSPAX2/pMD2G）为本实验室保存；胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）购自依科赛公司；DMEM、胰酶、双抗、转染试剂Lipo 2000、DMEM/F12、B27、表皮细胞生长因子（Epidermal growth factor，EGF）、Accutase消化液等试剂均购自Gibco公司；成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，FGF）试剂购自Peprotech公司；蛋白定量试剂盒购自雷根生物；shRNA序列和引物由上海生工生物公司合成；MPST抗体购自Abcam公司；硝酸纤维素转印膜购自PALL公司；HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR试剂购自南京诺唯赞公司；Hieff^® qPCR SYBR Green Master Mix试剂购自翌圣生物公司。

1.2　实验方法

1.2.1　数据分析

使用加州大学圣克鲁兹分校基因组浏览器（University of California Santa Cruz Genome Browser，UCSC）分析TCGA数据库中MPST基因在原发GBM（Primary GBM）、复发GBM（Recurrent GBM）和癌旁正常组织（Solid Tissue Normal）中的表达。

1.2.2　细胞培养

GSC1023为悬浮细胞，培养于含有2% B27、10 ng·mL^-1 EGF和10 ng·mL^-1 FGF的DMEM/F12培养基中，使用Accutase进行消化传代。GBM0709为贴壁细胞，培养于含有10% FBS的DMEM培养基中，使用胰酶进行消化传代。所有细胞均放置在37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养。

1.2.3　靶向MPST基因的shRNA设计和合成

在NCBI网站查找人MPST基因序列，通过在线工具（http：//rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/setOption.do？）设计特异性靶向沉默MPST基因的2对shRNA序列。shRNA序列均由上海生工生物公司合成。shRNA序列见表１。

1.2.4　质粒构建

AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切pLKO.1-Puro质粒，T4连接酶将MPST shRNA退火产物和线性化的pLKO.1-Puro载体16 ℃连接30 min。连接产物转入感受态细胞，冰浴30 min，42 ℃热浴90 s，转入冰上静置5 min。加入LB培养基37 °C振荡培养1 h，然后取100 μL菌液涂于含氨苄LB平板上，37 ℃培养过夜。第2天挑取单克隆菌落加入到含氨苄的LB培养基，37 ℃振荡培养过夜。用天根试剂盒提取质粒^［15］，由上海生工生物公司进行测序。

1.2.5　琼脂糖凝胶电泳

取锥形瓶，加入0.3 g琼脂和30 mL 1×Tris Acetate-EDTA buffer，用微波炉加热煮沸，摇匀直至融化。冷却到65 ℃后加入3 μL溴化乙锭，倒入电泳槽中静置凝固，电泳槽补加缓冲液（1×Tris acetate-EDTA buffer）。取DNA marker和样品按顺序加入点样孔。电泳仪设置130 mA，130 V，30 min；电泳后用凝胶成像仪进行拍照。

1.2.6　慢病毒包装

用7 μL Lipo 2000转染试剂将总量5 μg的包装质粒pSPAX2、pMD2G与慢病毒载体pLKO.1-Puro、pLKO.1-MPST-shRNA1和pLKO.1-MPST-shRNA2分别共转293T细胞，转染后6～12 h换液。换液后24～48 h，收集细胞培养基，然后用0.45 μm滤器过滤。过滤后的病毒液进行分装保存，即包装好的慢病毒命名为control、sh1和sh2。

1.2.7　目的细胞感染

接种神经胶质瘤干细胞GSC1023和神经胶质瘤细胞GBM0709，待细胞密度达70%～80%时，分别用control、sh1和sh2慢病毒液感染GSC1023和GBM0709细胞，分别命名为对照组（control）和敲低实验组（sh1、sh2），12～24 h后更换培养基。然后加入嘌呤霉素筛选48 h，更换培养基进一步扩大培养，获得稳定转染细胞系^［16］。

1.2.8　RT-qPCR

收取对照组（control）和敲低组（sh1、sh2）的GSC1023和GBM0709细胞，使用Trizol提取各组RNA并测定浓度。逆转录试剂盒将各组RNA逆转录为cDNA，然后以各组cDNA为模板，使用SYBR Green Mix qPCR试剂盒检测MPST在GSC1023和GBM0709细胞中的敲低效率。qPCR反应体系（30 μL）：20 μL Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（High Rox Plus）、上下游引物各0.4 μL、1 μL模板cDNA、8.2 μL无菌超纯水。扩增程序：95 ℃热激活5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。以GAPDH为内参，通过2^－△△Ct法计算MPSTmRNA在GSC1023和GBM0709细胞中的相对表达量。引物序列见表2。

1.2.9　蛋白质免疫印迹（Western blot）

收取对照组（control）和敲低组（sh1、sh2）的GSC1023和GBM0709细胞，加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，冰上裂解30 min，14 000 rpm，4 ℃离心15 min，离心后收取上清。用蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，根据蛋白浓度加入20%的5×Loading buffer，置于100 ℃金属浴变性蛋白10 min。蛋白上样后采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）电泳，电泳后进行转膜，5% BSA封闭PVDF膜2 h，一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3次，二抗室温敷育1 h，PBST清洗后用伯乐化学发光成像系统获得显影图，通过Image J软件对MPST蛋白水平的表达进行相对定量分析。

1.2.10　免疫荧光检测

将GBM0709细胞接种在盖玻片上，放入5% CO₂细胞培养箱中培养24 h后，去除培养基，PBS清洗细胞，4%多聚甲醛固定细胞15 min。PBS清洗细胞，3% BSA封闭液室温封闭1 h。MPST一抗稀释液4 ℃孵育过夜，PBS清洗3次，二抗稀释液（含DAPI）室温避光孵育1.5 h，PBS清洗3次。封片后用激光共聚焦荧光显微镜观察MPST的定位情况。

1.3　统计学处理

数据采用Graphpad Prism 9.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1　MPST在神经胶质瘤中高表达

基于TCGA Glioblastoma数据库对神经胶质瘤患者肿瘤组织和癌旁正常组织中MPST基因表达进行分析，结果显示，MPST在神经胶质瘤高表达，且与癌旁正常组织相比，原发和复发神经胶质瘤中MPST的表达增加，差异有统计学意义（P＜0.001），见图1。

2.2　敲低MPST基因的慢病毒载体鉴定

琼脂糖凝胶电泳结果显示，扩增出来的条带大小与目的基因基本一致（图2A）。DNA测序结果显示，MPST-shRNA1、MPST-shRNA2短片段序列与设计的目的序列完全一致（图2B、图2C）。由此得出靶向干扰MPST基因的shRNA序列被成功插入pLKO.1-Puro载体，敲低MPST基因的慢病毒载体pLKO.1-MPST-shRNA1和pLKO.1-MPST-shRNA2构建成功。

2.3　神经胶质瘤稳转细胞系中MPST mRNA的表达水平变化

在敲低MPST基因GSC1023和GBM0709稳转细胞系中，与control组相比，sh1组、sh2组MPST mRNA的表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。其中稳转细胞系GSC1023中sh1组敲低效率为79%，sh2组敲低效率为63%；稳转细胞系GBM0709中MPST基因sh1组敲低效率为55%，sh2组敲低效率为47%。

2.4　神经胶质瘤稳转细胞系中MPST蛋白的表达水平变化

在敲低MPST基因GSC1023和GBM0709稳转细胞系中，与control组相比，sh1组、sh2组MPST蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4）。

2.5　MPST在神经胶质瘤细胞的定位

为了研究MPST在神经胶质瘤中的功能，首先通过免疫荧光分析了MPST在神经胶质瘤细胞GBM0709中的定位情况。染色结果显示，MPST主要分布在神经胶质瘤细胞的细胞质中，在细胞核中的表达比较弱，并且MPST与线粒体标志物在细胞质的位置高度重合（图5），提示MPST主要定位于神经胶质瘤细胞的线粒体中。

3 讨论

神经胶质瘤常对放疗和化疗药物（如替莫唑胺）产生高度耐药性^{［15，17］}，治疗耐药导致的肿瘤复发是造成患者预后差的主要原因，严重威胁患者生命。与传统的“无差别”杀伤策略不同，靶向治疗能精准识别并攻击肿瘤发生发展中起关键作用的特定分子或基因。因此，寻找神经胶质瘤特异性高表达、功能关键的基因，并针对该基因进行干扰，能够有效治疗神经胶质瘤，提高胶质瘤患者生存率和改善患者预后。已有研究报道在结直肠癌、乳腺癌、肝细胞癌等多种癌症中，MPST的表达显著上调，且其高表达与患者的不良预后、肿瘤转移密切相关^［18-20］。这些研究成果表明MPST是一个潜在的肿瘤治疗靶点。相关研究报道H₂S合成酶MPST在神经母瘤和成胶质瘤中表达水平升高^［12］。本研究通过生物信息学分析发现：与癌旁正常组织相比，MPST在神经胶质瘤组织中表达增加。但是MPST在神经胶质瘤组织中高表达对神经胶质瘤是促肿瘤还是抑肿瘤作用尚未明确。为深入研究MPST在神经胶质瘤恶性进展中的生物学功能，本研究通过shRNA慢病毒感染技术，构建稳定敲低MPST基因的胶质瘤细胞GSC1023和GBM0709的稳转细胞系。RT-qPCR、Western blot结果显示敲低MPST基因的GSC1023和GBM0709稳转细胞系中MPST的mRNA、蛋白表达量均低于对照组，表明MPST基因稳定敲低的胶质瘤细胞系成功构建，为后续功能研究提供了可靠的实验模型。

蛋白质的亚细胞定位与其生物学功能密切相关。蛋白质必须定位至其底物或作用靶点所在区域才能发挥功能，例如：转录因子需进入细胞核并结合DNA，以调控基因转录；糖酵解相关酶类需定位于细胞质，才能将葡萄糖分解为丙酮酸和ATP，为细胞提供能量与碳骨架^［21］。此外，某些蛋白质的定位具有动态变化特征，以适应其功能需求。例如：细胞周期核心调控蛋白CYCLIN B1在分裂间期位于细胞质，而在G2/M期转位至细胞核，启动有丝分裂进程^［22］；胱硫醚β合成酶定位于线粒体，通过调节活性氧生成影响卵巢癌细胞代谢，进而促进肿瘤生长与化疗抵抗^［23］。MPST作为硫化氢生成酶之一，其在胶质瘤细胞中的亚细胞定位尚不明确。明确MPST的定位分布对深入探索其在胶质瘤中的生物学功能及作用机制具有重要参考价值。为明确MPST在神经胶质瘤细胞中的亚细胞定位，对GBM0709细胞进行了MPST与线粒体标志物—MITO的免疫荧光共染色。免疫荧光检测结果显示，MPST主要定位于神经胶质瘤细胞的线粒体。提示MPST在神经胶质瘤中可能通过调节线粒体功能参与肿瘤代谢调控。

综上，MPST敲低的稳转胶质瘤细胞模型的建立及其在神经胶质瘤细胞的定位结果均为后续进一步研究MPST在神经胶质瘤发生发展中的生物学功能提供了一定的基础，为进一步阐明MPST介导线粒体代谢对神经胶质瘤分子调控的机制提供参考。

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基金资助

广东省医学科研基金项目(B2022068)