诺如病毒快速免疫层析检测效能的评估及应用

Evaluation of the detection performance and application for rapid immunochromatographic test of norovirus

摘要

目的 评估一种诺如病毒免疫层析（Immunochromatography，IC）检测试剂盒的检测效能，为免疫层析法在实际筛查检测中的应用提供依据。 方法 收集100份腹泻样本，同时采用IC检测试剂盒与诺如病毒检测中推荐的实时定量逆转录聚合酶链式反应（Real-time quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）方法对样本平行检测，通过对2种方法检测结果进行统计分析，评估IC检测试剂盒对诺如病毒及其基因型的检测效能。 结果 IC检测试剂盒检测诺如病毒的灵敏度、特异性和符合率分别达到了95.9%、100.0%和97.0%。IC检测试剂盒与RT-qPCR检测结果比较{\mathrm{\chi }}^{\mathrm{2}}=1.333，P=0.248，差异无统计学意义。进一步对不同诺如病毒基因型进行检测，结果显示，IC检测试剂盒对诺如病毒GⅠ.5、GⅡ.3和GⅡ.7基因型检测灵敏度均为100.0%，而对GⅡ.4和GⅡ.17基因型检测灵敏度分别为94.4%和87.5%。 结论 IC检测试剂盒检测诺如病毒具有较高的灵敏度和特异性，检测结果与RT-qPCR检测的一致性高，可作为基层医疗机构诺如病毒筛检方法。

Abstract

Objective : To evaluate detection performance of a norovirus immunochromatographic （IC） test kit and provide evidence for its practical application. Methods A total of 100 diarrheal samples were collected and tested in parallel using the IC test kit and the RT-qPCR methods recommended by quarantine industry standards. The detection efficacy of the IC test kit for norovirus and its genotyping was assessed through statistical analysis of results from both methods. Results The sensitivity， specificity， and concordance rate of the IC detection kit reached 96%， 100%， and 97%， respectively. Compared with the standard detection methods， the McNemar chi-square value was 1.333， and the P-value was 0.248， indicating no statistical difference. The results of further detection of different norovirus genotypes showed that the IC detection kits demonstrated a sensitivity of 100.0% for the norovirus GⅠ.5， GⅡ.3， and GⅡ.7 genotypes， while the sensitivities for the GⅡ.4 and GⅡ.17 genotypes were 94.4% and 87.5%， respectively. Conclusion The IC detection kit has high sensitivity and specificity， the detection results show high consistency with RT-qPCR detection， making it suitable as a screening method for norovirus in primary healthcare institutions.

关键词

诺如病毒 / 免疫层析 / 检测效能

Key words

Norovirus / Immunochromatographic / Detection performance

诺如病毒（Norovirus，NoV）是全球急性胃肠炎（Acute gastroenteritis，AGE）暴发的主要病原体，约20%的急性胃肠炎与诺如病毒感染有关^［1］。病毒传播途径包括粪口传播、水源性传播和食源性传播^［2］，且呈现聚集性传播特征，护理机构、学校、养老院、游轮、公司食堂是疫情的高发场所^［3］。该病毒具有环境抵抗力强、感染剂量低、感染后潜伏期短、排毒时间长、免疫保护时间短等特点^［4］。

在疫情防控处置工作中，群体暴发性肠道疾病备受关注，尤其是儿童、学生、老年人等重点人群聚集的机构，一旦发生疫情易引发广泛舆论影响。因此，快速锁定致病原因至关重要，既能为精准制定防控策略提供支撑，又能及时回应群众诉求，有效平复舆情。

在检测技术方面，实时定量逆转录聚合酶链式反应（Real-time quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）是一种结合逆转录（将RNA转为cDNA）与实时荧光定量PCR的技术，用于检测和定量RNA表达水平。其核心原理是通过荧光信号实时监测PCR扩增过程，通过Ct值计算出起始RNA的模板量，用以判断样本中是否存在病毒的RNA。然而受到分子检测技术仪器设备价格昂贵、需要专业操作人员及检测周期较长等因素限制，许多基层医疗机构尚无法对肠道致病性微生物做出有效检测。因此，建立有效的早期检测体系和制定合理的防控策略对阻断病毒传播、降低疫情影响有重要意义。免疫层析（Immunochromatography，IC）检测法具有操作简便、检测速度快、设备依赖性低和成本低等优势，为诺如病毒筛查提供了有应用价值的替代方案。本研究通过比较IC检测试剂盒与RT-qPCR检测方法在检测灵敏度、特异性等指标上的表现，旨在构建适用于基层医疗机构的“初筛-确诊”分级诊断路径，提升早期疫情识别能力。

1 材料与方法

1.1　实验材料

研究样本源自2021—2023年江西省某哨点医院急性胃肠炎住院患者新鲜粪便，标本采集后72 h内，按1∶9（w/v）质量体积比加入预冷磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4），通过30 s涡旋振荡均质化后制备成10%混悬液，随后将混悬液经3 000×g离心5 min，取无颗粒上清液装入无菌冻存管中，并置于-80 ℃环境样品库长期保存。排除使用过抗病毒药物的患者样本，在此基础上，从样本库中随机抽取100份样本纳入本研究。

1.2　仪器和试剂

本研究使用的主要实验器材及试剂包括：诺如病毒IC检测试剂盒RIDA^® QUICK IC N1402（德国R-Biopharm AG）；ABI 7500实时荧光定量PCR仪（美国Thermo Fisher）；PCR扩增仪及凝胶成像系统（美国Bio-Rad）；磁珠法核酸提取纯化试剂（上海伯杰）；SensiFAST Probe Lo-ROX预混液（北京康润）；随机六聚体引物（日本TakaraBio）；耐高温逆转录酶（江苏康为世纪）等。

1.3　实验方法

所有样本均采用IC检测试剂盒检测诺如病毒，并通过RT-qPCR法平行检测诺如病毒及其他胃肠炎病毒（包括A组轮状病毒、腺病毒、星状病毒、沙波病毒等胃肠炎病毒）。阳性样本用于评估检测灵敏度，阴性样本用于评估特异性和交叉反应。

1.3.1　IC检测

本研究使用的IC检测试剂盒采用层析免疫法一步式侧向流动层析原理，检测卡的硝酸纤维素膜上预包被了生物素化抗诺如病毒抗体（检测线T线）和金标抗诺如病毒抗体（质控线C线）。检测时，当样本含诺如病毒时，病毒抗原与金标抗体结合形成复合物，在毛细作用下迁移至T线，通过生物素-链霉亲和素高亲和力作用被捕获，形成紫红色条带；未结合的金标抗体继续迁移至C线显色，验证检测有效性。若样本不含病毒，则仅C线显色，T线无条带。若C线不出现条带，则表明检测过程无效^［5］。操作过程中严格按照1∶1比例，将IC检测试剂盒中0.5 mL试剂A和0.5 mL试剂B加入反应试剂瓶，随后加入50 μL粪便样本充分混合形成悬浮液，取上清液，滴入检测卡的样孔中，5 min后目视观察判断检测结果。

1.3.2　RT-qPCR检测

RT-qPCR原理是通过逆转录酶将RNA转化为cDNA，利用荧光信号实时监测PCR扩增进程，通过Ct值（荧光信号达到设定阈值的循环数）定量初始RNA浓度，实现高灵敏度检测。病毒核酸提取及逆转录：采用磁珠法核酸提取试剂盒从0.2 mL样本中纯化RNA。逆转录反应体系含随机六聚体引物、逆转录酶及RNase抑制剂，经65 ℃预变性5 min、37 ℃延伸60 min生成cDNA。巢式PCR扩增：针对诺如病毒VP1区进行分阶段扩增，第一轮（扩增长度至387 bp），使用外引物，反应条件为95 ℃ 5 min预变性，35个循环（95 ℃ 30 s变性，55 ℃ 30 s退火，72 ℃ 45 s延伸）；第二轮（扩增长度至213 bp），以1 μL第一轮产物为模板，使用内引物，提高退火温度至58 ℃。测序验证：扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证后，纯化后的DNA片段通过二代测序平台进行双端测序（2×150 bp），原始数据经BLAST比对确认病毒基因型。质量控制：全过程设置阴性对照（无模板）和阳性对照，并通过熔解曲线分析验证产物特异性。

1.4　统计学处理

采用四格表对IC检测与RT-qPCR平行检测数据进行统计，用于评估IC检测的灵敏度、特异度及符合率。数据采用SPSS 25.0软件进行分析。计数资料以例数或率表示，采用{\mathrm{\chi }}^{\mathrm{2}}检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1　病毒检测

在100份样本中，经IC检测试剂盒检出诺如病毒阳性70例，阴性30例；通过RT-qPCR平行检测确诊阳性73例，阴性27例。在73例确诊阳性样本中，发现4例混合感染（3例合并肠病毒，1例合并A组轮状病毒）；27例阴性样本中，23例检出腺病毒、沙波病毒等肠道病原体，4例对所有检测病原体均呈阴性。

通过BLAST工具对诺如病毒阳性样本基因分型显示，73例阳性样本中存在5种基因型：GⅠ.5型（8例，11.0%）、GⅡ.3型（12例，16.4%）、GⅡ.4型（36例，49.3%）、GⅡ.7型（9例，12.3%）和GⅡ.17型（8例，11.0%）。病毒载量定量分析显示，粪便样本中诺如病毒核酸浓度范围为1.6×10⁶～9.6×10¹¹ copies·g^-1粪便。

2.2　IC和RT-qPCR检测效能

IC检测诺如病毒的灵敏度为95.9%，特异性为100.0%，符合率为97.0%。IC与RT-qPCR的检测结果比较{\mathrm{\chi }}^{\mathrm{2}}=1.333，P=0.248，差异无统计学意义。见表1。

2.3　交叉反应

对所有样本同时进行了A组轮状病毒、腺病毒、星状病毒和沙波病毒检测。检测结果显示，IC和RT-qPCR检测方法均未出现交叉反应现象。

2.4　IC和RT-qPCR对诺如病毒不同基因型检测灵敏度比较

IC检测试剂盒对诺如病毒GⅠ.5、GⅡ.3和GⅡ.7基因型检测灵敏度均为100.0%，而对GⅡ.4和GⅡ.17基因型检测灵敏度分别为94.4%和87.5%。见表2。

3 讨论

诺如病毒作为引发急性胃肠炎的主要病原体，易在人群密集场所引发聚集性疫情，引发公共卫生安全问题。早期确诊与及时防控是阻断传播链、降低疫情暴发风险的关键环节。在实验室诊断领域，RT-qPCR技术凭借其高灵敏性，被公认为诺如病毒检测的金标准。不过，该方法需要专业核酸提取设备、精密温控系统和熟练操作人员，检测流程通常需要4～6 h，这些条件限制了其在基层医疗机构的常规使用，也会制约疫情早期的快速响应。

与RT-qPCR相比，快速免疫层析检测法在操作便捷性、精密仪器依赖性以及检测时效性等方面具有明显优势，适用于基层医疗机构和资源匮乏地区的大规模快速筛查。本研究数据显示，IC检测试剂盒与RT-qPCR的检测结果在灵敏度（96%）、特异性（100%）和符合率（97%）等指标上呈现较高的一致性，且未出现交叉反应。值得注意的是，IC检测试剂盒在检测中出现假阴性的情况，分析可能的原因是诺如病毒抗原高度变异，且某些基因型存在抗原漂移。需要指出的是，尽管免疫层析检测在灵敏度、特异性和符合率这些核心指标上与金标准尚存在差距，但研究所使用的产品性能较早期产品已有了明显的提升，早期IC检测试剂盒产品的灵敏度仅为76.5%（区间65.1%～85.0%）^［5］。最新研究显示，部分新一代IC检测试剂盒（如IP-Noro/Rota）灵敏度可达100%^［6］，随着免疫层析检测产品的不断迭代升级，先进抗原制备技术的应用，显著提升了抗原的纯度和特异性，这一进展增强了标记抗体与病毒抗原的结合能力，从而使检测效能持续增强。

免疫层析检测法操作简便、检测速度快且效率高，作为诺如病毒的一种筛检手段，在基层医疗机构、疾控机构具有独特的应用价值，在疫情初期能够快速识别传染源。从公共卫生防控策略而言，IC检测试剂盒可作为诺如病毒疫情暴发早期的初筛工具，一旦发现阳性样本可立即启动防控措施，而对于阴性样本则需进一步采用分子检测方法确认。这种分级检测策略，一方面可以有效缓解实验室的检测压力，另一方面还能兼顾检测的时效性与准确性，对于防控诺如病毒传播具有重要实践意义。

参考文献

[1] 张彦，张丹，苏文冕，等.诺如病毒急性胃肠炎流行特征及疫苗研究进展［J］.中国病原生物学杂志，2024，19（9）：1112-1114.

[2] WINDER N， GOHAR S， MUTHANA M. Norovirus： an overview of virology and preventative measures［J］. Viruses， 2022，14（12）：2811.

[3] 姜苏芮，李慧莹，段招军.诺如病毒消毒灭活方法研究进展［J］.中国公共卫生，2024，40（6）：754-758.

[4] 廖巧红，冉陆，靳淼，等.诺如病毒感染暴发调查和预防控制技术指南（2015版）［J］.中国病毒病杂志，2015，5（6）：448-458.

[5] PARK K S， BAEK K A， KIM D U， et al. Evaluation of a new immunochromatographic assay kit for the rapid detection of norovirus in fecal specimens［J］. Ann Lab Med， 2012，32（1）：79-81.

[6] SHAHA M， SIFAT S F， MAMUN MAL， et al. Comparative evaluation of sensitivity and specificity of immunochromatography kit for the rapid detection of norovirus and rotavirus in Bangladesh［J］. F1000Research， 2020，8：173.