冬凌草甲素抗系膜增生性肾小球肾炎的作用及机制研究

Study on the effect and mechanism of oridonin on mesangial proliferative glomerulonephritis

摘要

目的 探讨冬凌草甲素（Oridonin，ORI）对大鼠肾小球系膜细胞增殖、周期分布及凋亡的影响，为系膜增生性肾小球肾炎的药物干预提供新思路。 方法 ⑴采用25%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）构建大鼠系膜细胞增殖模型，采用MTT实验、细胞周期实验、细胞凋亡实验及激光共聚焦实验，评估ORI对大鼠系膜细胞增殖、凋亡能力等影响；⑵采用弗氏完全佐剂与LPS建立MsPGN小鼠模型，评估ORI对肾组织系膜细胞增殖的影响。 结果 ⑴与模型对照组相比，5 µmol·L^-1 ORI组、10 µmol·L^-1 ORI组、15 µmol·L^-1 ORI组、20 µmol·L^-1 ORI组细胞增殖能力降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。且ORI以浓度依赖抑制系膜细胞增殖，其24 h半数抑制浓度（IC50）为12.88 µmol·L^-1，15 µmol·L^-1 ORI、20 µmol·L^-1 ORI对大鼠系膜细胞的增殖抑制非常显著；⑵15 µmol·L^-1 ORI组G0/G1期细胞占比（64.93±6.69）%，与模型对照组（40.23±7.83）%相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；S期、G2/M期占比与模型对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；⑶正常对照组、模型对照组、15 µmol·L^-1 ORI组总凋亡率分别为（6.63±6.90）%、（5.03±2.64）%、（57.03±8.18）%。15 µmol·L^-1 ORI组细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率高于正常对照组和模型对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），且细胞凋亡以早期凋亡为主；⑷肉眼可见正常对照组肾表面平整，呈淡褐色，而模型对照组肾明显肿大、充血，呈暗褐色，低浓度组、高浓度组肾颜色逐渐变淡，体积也有所减小；⑸免疫组织化学结果显示，模型组小鼠肾小球Ki-67阳性细胞数量较对照组增加，高、低浓度组肾小球Ki-67阳性细胞数量明显减少；⑹HE染色：正常对照组系膜区细胞稀疏，模型对照组系膜区细胞增多，低浓度组系膜区细胞减少，高浓度组系膜区细胞稀疏。PAS染色：正常对照组基底膜厚度均匀，结构清晰，模型对照组基底膜增厚，低浓度组、高浓度组基底膜增厚程度减轻。Trichrome染色：正常对照组小鼠肾小球内或周围无明显蓝色胶原纤维沉积，模型对照组小鼠肾小球内或周围蓝色胶原纤维显著积聚，低浓度组、高浓度组小鼠肾小球内或周围蓝色胶原纤维沉积减少。 结论 冬凌草甲素能够有效抑制肾系膜细胞的病理性增殖，诱导其进入G0/G1期阻滞并促进细胞凋亡，展现出作为抗系膜增生性肾小球肾炎潜在治疗剂的广阔前景。

Abstract

Objective : To explore the effects of oridonin （ORI） on the proliferation， cell cycle distribution， and apoptosis of rat glomerular mesangial cells， providing new ideas for drug intervention in mesangial proliferative glomerulonephritis （MsPGN）. Methods ⑴ A rat mesangial cell proliferation model was constructed using 25% fetal bovine serum （FBS）. The effects of ORI on the proliferation and apoptosis of rat mesangial cells were evaluated through MTT assay， cell cycle assay， apoptosis assay and laser confocal microscopy. ⑵ A MsPGN mouse model was established using Freund's complete adjuvant and LPS. The effect of ORI on the proliferation of mesangial cells in kidney tissue was evaluated. Results : ⑴ Compared with the model control group, the cell proliferation ability of the 5 µmol·L^-1 ORI group, 10 µmol·L^-1 ORI group, 15 µmol·L^-1 ORI group, and 20 µmol·L^-1 ORI group decreased, and the differences were statistically significant （P＜0.05）. Moreover, ORI inhibited the proliferation of mesangial cells in a concentration-dependent manner. The 24-hour half-maximal inhibitory concentration （IC50） of ORI was 12.88 µmol·L^-1. The 15 µmol·L^-1 ORI group and 20 µmol·L^-1 ORI group significantly inhibited the proliferation of rat mesangial cells. ⑵ The proportion of cells in the G0/G1 phase in the 15 µmol·L^-1 ORI group (64.93±6.69)% was significantly different from that in the model control group （40.23±7.83）% （P＜0.05）； the proportions of cells in the S phase and G2/M phase were not statistically different from those in the model control group （P＞0.05）. ⑶ The total apoptosis rates of the normal control group, model control group, and 15 µmol·L^-1 ORI group were （6.63±6.90）%, （5.03±2.64）%， and (57.03±8.18)%， respectively. The early apoptosis rate, late apoptosis rate, and total apoptosis rate of the 15 µmol·L^-1 ORI group were higher than those of the normal control group and model control group， and the differences were statistically significant （P＜0.05）， and cell apoptosis was mainly early apoptosis. ⑷ Macroscopically， the surface of kidneys of the normal control group was smooth and light brown， while those in the model control group were significantly enlarged and congested， presenting dark brown. The color of kidneys of the low concentration group and high concentration group gradually became lighter, and their volumes also decreased. ⑸ Immunohistochemical results showed that the number of Ki-67 positive cells in the kidneys of the model group was higher than that in the control group， and the number of Ki-67 positive cells in the kidneys of the high and low concentration groups was significantly reduced. ⑹ HE staining: the cells in the mesangial area of the normal control group were sparse， while those in the model control group were increased. The number of cells in the mesangial area was reduced in the low concentration group and high concentration group. PAS staining： the thickness of the basement membrane in the normal control group was uniform and clear, while that in the model control group was thickened, and the degree of thickening of the basement membrane in the low concentration group and high concentration group was reduced. Trichrome staining: there was no obvious blue collagen fiber deposition in the renal glomeruli or around the renal glomeruli in the normal control group, while in the model control group, blue collagen fibers were significantly accumulated in the renal glomeruli or around them, and the deposition of blue collagen fibers in the renal glomeruli or around them was reduced in the low concentration group and high concentration group. Conclusion Oridonin effectively inhibits the pathological proliferation of renal mesangial cells， induces their arrest in the G0/G1 phase， and promotes apoptosis， demonstrating broad potential as a promising therapeutic agent for mesangial proliferative glomerulonephritis.

Graphical abstract

关键词

冬凌草甲素 / 系膜细胞 / 细胞周期阻滞 / 细胞凋亡 / 系膜增生性肾小球肾炎

Key words

Oridonin / Mesangial cells / Cell cycle arrest / Apoptosis / Mesangial proliferative glomerulonephritis

系膜增生性肾小球肾炎（Mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN）是原发性肾小球疾病的主要病理类型，以弥漫性肾小球系膜细胞增生及不同程度系膜基质增多为主要特征，常见于IgA肾病、狼疮性肾炎等疾病早期^［1-2］。活化的系膜细胞通过分泌炎症因子如白介素6（Interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor α，TNF-α）及促纤维化介质如转化生长因子β（Transforming growth factor β，TGF-β）和血小板衍生生长因子（Platelet-derived growth factor，PDGF），驱动肾小球系膜细胞增生和细胞外基质沉积，最终导致蛋白尿、血尿及肾功能进行性下降^［3-4］。目前临床一线治疗依赖糖皮质激素和免疫抑制剂，但部分患者疗效不佳或面临感染、代谢紊乱等不良反应，亟需开发靶向系膜细胞增殖的新型治疗策略。

冬凌草甲素（Oridonin，ORI）是传统中药冬凌草的核心活性成分，大量细胞实验与动物模型研究证实其具有显著抗肿瘤活性。通过检测细胞周期分布、增殖标志物（如Ki-67）表达，及凋亡相关信号通路（如Caspase家族、Bcl-2/Bax）激活情况，结合肿瘤体积与重量变化监测，明确其可有效抑制多种肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡^［5-8］，但其对肾脏系膜细胞的作用尚未被系统研究。鉴于MsPGN的核心病理环节是系膜细胞失控性增殖，本研究提出科学假说：ORI可能通过调控细胞周期和凋亡通路，特异性抑制病理性系膜细胞活化。本研究首次利用胎牛血清（Fetal bovine serum， FBS）构建的系膜细胞增殖模型（模拟MsPGN高负荷状态），综合评估ORI的增殖抑制效应，并深入解析其诱导G0/G1期阻滞与凋亡的机制，为靶向治疗MsPGN提供实验依据。

1 材料与方法

1.1　实验材料

大鼠系膜细胞（MC）由本校基础医学院生物化学与分子生物学教研室吴素珍博士惠赠，ORI购于中国食品药品检定研究院，DMEM、胰酶、青-链霉素混合液均购于Gibco公司，DMSO、MTT试剂盒购于索莱宝科技有限公司，Cell Cycle Staining Kit、Annexin V-FITC/PI apoptosis kit购于联科生物技术股份有限公司。

1.2　细胞培养

MC细胞用含15%FBS和1%青-链霉素的DMEM低糖培养基培养于37 °C、5% CO₂及饱和湿度的培养箱中。

1.3　系膜细胞增殖模型构建

MC细胞以5×10³的密度接种于96孔板，以不同含量FBS（0、15%、20%、25%、30%）孵育12、24、36和48 h后每孔加入10 µL MTT溶液，继续孵育4 h，弃上清液，每孔加入100 µL DMSO溶液，平板摇晃10 min后酶标仪检测细胞的增殖情况，并以此结果确定系膜细胞增殖模型的FBS含量。

1.4　MTT实验

MC细胞以5×10³密度接种于96孔板，细胞接种24 h后各组给予不同处理，正常对照组：15% FBS；模型对照组：25% FBS；5 µmol·L^-1 ORI组：25% FBS+5 µmol·L^-1 ORI；10 µmol·L^-1 ORI组：25% FBS+10 µmol·L^-1 ORI；15 µmol·L^-1 ORI组：25% FBS+15 µmol·L^-1 ORI；20 µmol·L^-1 ORI组：25% FBS+20 µmol·L^-1 ORI。24 h后每孔加入10 µL MTT溶液继续孵育4 h，弃去培养上清液，每孔加入100 µL DMSO溶液，平板摇晃10 min，酶标仪检测细胞的增殖情况并计算IC50。

1.5　细胞周期实验

按每孔2×10⁵个细胞的密度接种于6孔板，细胞贴壁后，进行无血清同步化处理。根据MTT实验结果，按正常对照组（15% FBS）、模型对照组（25% FBS）、15 µmol·L^-1 ORI组（25% FBS+15 µmol·L^-1 ORI）分别给药处理。24 h后收集细胞，无水乙醇固定过夜，离心，PBS水化15 min，离心，每管加入1 mL DNA染色液，室温避光孵育30 min，使用流式细胞分析仪（BD公司）进行检测，上样速率设为最低。

1.6　细胞凋亡实验

按试剂盒说明书操作^［9］：将细胞以每孔2×10⁵个的密度接种于6孔板。24 h后按正常对照组（15% FBS）、模型对照组（25% FBS）、15 µmol·L^-1 ORI组（25% FBS+15 µmol·L^-1 ORI）分别给药处理。24 h后收集细胞，胰酶消化，离心，PBS洗涤，每管加入500 µL 1×Binding Buffer重悬细胞，再加入5 µL Annexin V-FITC和10 µL PI，室温避光孵育5 min。随即使用流式细胞分析仪进行检测。

1.7　共聚焦实验

将细胞以每孔2×10⁵个的密度接种于6孔板，按模型对照组（25% FBS）、12 µmol·L^-1 ORI组（25% FBS+12 µmol·L^-1 ORI）和15 µmol·L^-1 ORI组（25% FBS+15 µmol·L^-1 ORI）分别给药处理。24 h后收集细胞，胰酶消化，离心，PBS洗涤，每管加入500 µL 1×Binding Buffer重悬细胞，再加入5 µL Annexin V-FITC和10 µL PI，室温避光孵育5 min。用PBS洗涤以去除未结合的抗体及染料，将细胞液和适量抗荧光淬灭剂滴加载玻片中央，将细胞面朝下贴合，避免产生气泡，最后用指甲油密封盖玻片边缘。待密封剂干燥后，立即置于共聚焦显微镜下观察早、晚期凋亡细胞荧光显像。

1.8　MsPGN模型小鼠建立

参照文献［10］建立MsPGN模型小鼠：选用4周龄昆明小鼠（雌雄各半，体重约45 g），适应性饲养1周。除正常对照组外，其余小鼠于双后足垫皮下注射含1 mg BSA的弗氏完全佐剂乳剂（0.03 mL/只），并于第1、2周以相同方式加强免疫。第3周进行4次腹腔注射BSA（剂量依次为0.2、0.4、0.6、1.2 mg/只），次日再腹腔注射0.9 mg/只以加强。随后每日腹腔注射BSA，从0.2 mg/只起始，每日递增0.2 mg至2 mg/只，之后每4天增加0.5 mg至3.5 mg/只，持续4周。分别于第15天和第36天尾静脉注射LPS（30 μg/只）。

1.9　MsPGN模型小鼠分组及给药

设正常对照组、模型对照组、低浓度组（10 mg·kg^-1 ORI）和高浓度组（20 mg·kg^-1 ORI），每组8只。自造模开始之日（第0天）起，每日灌胃相应剂量药物或生理盐水，连续3周。末次给药后次日，取肾组织，经福尔马林固定后保存备用。

1.10　HE染色

取肾组织经梯度脱水、石蜡包埋后连续切片。切片脱蜡水化，苏木素染色5 min，盐酸分化30 s，伊红复染2 min，脱水、透明、封片，光学显微镜下观察肾小球结构、肾小管损伤及炎症细胞浸润等病理形态改变。

1.11　免疫组化

采用免疫荧光SP法，脱蜡水化后抗原修复，封闭非特异性结合位点，加入Ki-67一抗，于4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。

1.12　统计学处理

采用GraphPad Prism 9统计软件分析数据，结果以均数±标准差表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1　FBS对系膜细胞增殖的影响

相较于0% FBS组，25% FBS和30% FBS组在促进细胞增殖方面的效果更为显著（图1）。最终选定25% FBS作为后续实验中诱导系膜细胞增殖的培养条件。

2.2　ORI对大鼠系膜细胞增殖的影响

在光学显微镜下，正常对照组和模型对照组和5 µmol·L^-1 ORI组细胞呈不规则形或梭形、多角形，贴壁，10 µmol·L^-1 ORI组（2D）细胞间隙稍增大，15 µmol·L^-1 ORI组、20 µmol·L^-1 ORI组的细胞逐渐皱缩，间隙增大，细胞质密度增加，细胞的贴壁能力下降，可见部分细胞脱落和细胞碎片。MTT实验结果显示，与模型对照组相比，5 µmol·L^-1 ORI组、10 µmol·L^-1 ORI组、15 µmol·L^-1 ORI组、20 µmol·L^-1 ORI组细胞增殖能力降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）（图2）。且ORI以浓度依赖抑制系膜细胞增殖，其24 h半数抑制浓度（IC50）为12.88 µmol·L^-1，15 µmol·L^-1 ORI、20 µmol·L^-1 ORI对大鼠系膜细胞的增殖抑制非常显著。

2.3　ORI对大鼠系膜细胞的细胞周期影响

15 µmol·L^-1 ORI组G0/G1期细胞占比（64.93±6.69）%，与模型对照组（40.23±7.83）%相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；S期、G2/M期占比与模型对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）（图3）。

2.4　ORI对大鼠系膜细胞凋亡的影响

正常对照组、模型对照组、15 µmol·L^-1 ORI组总凋亡率分别为（6.63±6.90）%、（5.03±2.64）%、（57.03±8.18）%。15 µmol·L^-1 ORI组细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率高于正常对照组和模型对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），且细胞凋亡以早期凋亡为主（图4）。

2.5　ORI诱导大鼠系膜细胞产生凋亡小体

激光共聚焦实验显示，正常对照组只有少量细胞呈绿色荧光，12 µmol·L^-1 ORI组绿色荧光增强，15 µmol·L^-1 ORI组除较强的绿色荧光外还有红色荧光（图5）。

2.6　不同浓度ORI对MsPGN模型小鼠肾外观的影响

肉眼可见正常对照组肾表面平整，呈淡褐色，而模型对照组肾明显肿大、充血，呈暗褐色，低浓度组、高浓度组肾颜色逐渐变淡，体积也有所减小。表明不同浓度ORI对模型小鼠肾外观有显著影响，能使充血肿大的肾组织形态恢复正常，且呈浓度依赖性（图6）。

2.7　不同浓度ORI对MsPGN模型小鼠肾细胞增殖的影响

膜细胞增殖是系膜增生性肾小球肾炎的主要病理特点，检测增殖的分子标记物系膜区Ki-67阳性细胞（棕褐色）。免疫组织化学结果显示，模型组小鼠肾小球较对照组Ki-67阳性细胞数量增加，高、低浓度组肾小球Ki-67阳性细胞数量明显减少。表明不同浓度的ORI对MsPGN模型小鼠肾细胞的增殖具有抑制作用，且呈浓度依赖性（图7）。

2.8　不同浓度ORI作用MsPGN模型小鼠后肾小球的结构变化

HE染色：正常对照组系膜区细胞稀疏，模型对照组系膜区细胞增多，低浓度组系膜区细胞减少，高浓度组系膜区细胞稀疏。PAS染色：正常对照组基底膜厚度均匀，结构清晰，模型对照组基底膜增厚，低浓度组、高浓度组基底膜增厚程度减轻。Trichrome染色：正常对照组小鼠肾小球内或周围无明显蓝色胶原纤维沉积，模型对照组小鼠肾小球内或周围蓝色胶原纤维显著积聚，低浓度组、高浓度组小鼠肾小球内或周围蓝色胶原纤维沉积减少。见图8。

3 讨论

本研究首次揭示ORI通过协同诱导G0/G1期阻滞和早期凋亡，靶向干预系膜细胞的病理性增殖。系膜细胞异常增殖是增生性肾小球肾炎（MsPGN）的关键病理环节^［11-12］。在FBS诱导的MsPGN模型中，ORI以浓度依赖性抑制增殖（24 h IC50为12.88 µmol·L^-1），其双重机制体现为：显著提高G0/G1期细胞比例（64.93% vs 40.23%）并诱导凋亡（57.03% vs 5.03%）。该发现直击MsPGN“增殖亢进-凋亡抵抗”的恶性循环本质^［11-12］，为早期防治提供新策略。

相较于传统治疗，ORI展现出独特优势：糖皮质激素虽抑制炎症但抗增殖作用弱且不良反应显著，而ORI在低浓度（15 µmol·L^-1）下即可高效清除活化系膜细胞，植物源性特性可能降低免疫抑制风险。此外，ORI通过源头清除促纤维化细胞，与靶向TGF-β的药物（如Fresolimumab）形成互补^［13］。其有效浓度（10~15 µmol·L^-1）显著低于肿瘤毒性阈值（＞20 µmol·L^-1），且接近大鼠安全血药浓度（8~12 µmol·L^-1），提示更优治疗窗^{［6，14-15］}。

当前局限在于未解析关键分子靶点（如Cyclin D1/p21、Bax/Bcl-2），且缺乏体内模型验证。未来需通过蛋白检测明确机制，并在IgA肾病模型（如ddY小鼠）中评估ORI对蛋白尿及系膜增生的改善作用，同步检测其对纤维化标志物（α-SMA、Collagen IV）和炎症因子（IL-6、TNF-α）的调控^{［4，16-17］}。基于双重机制，ORI具备三重转化潜力：①早期干预延缓肾小球硬化；②为激素抵抗型MsPGN提供非免疫抑制性替代方案；③与RAS抑制剂（如缬沙坦）协同抑制增生与纤维化。后续应聚焦人类原代细胞验证、肾脏靶向递送系统开发及补体抑制剂联用策略。

综上所述，ORI通过阻滞G0/G1期和激活早期凋亡通路，显著抑制肾系膜细胞病理性增殖。该双重机制直击MsPGN核心病理环节，且低起效浓度（10~15 µmol·L^-1）具有潜在安全性，为开发靶向MsPGN的植物源药物奠定基础。未来需深化分子机制解析并推进动物模型验证。

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基金资助

江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ201526)

江西省自然科学基金项目(20242BAB26171)