Map4k1缺失对DSS诱导的小鼠结肠炎的保护作用

The protective effect of Map4k1 deficiency on DSS induced colitis in mice

摘要

目的 探究有丝分裂原激活蛋白激酶1（Mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 1，MAP4K1）在小鼠结肠炎发展过程中的作用，并明确其作用机制。 方法 通过GEO数据库分析MAP4K1在炎症性肠病（Inflammatory bowel diseases，IBD）患者肠道组织中的表达情况。利用3%葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium salt，DSS）诱导的实验性结肠炎模型，通过HE染色、RT-qPCR等技术验证MAP4K1在炎症及组织损伤中的作用。采用流式细胞术和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，IHC）分析MAP4K1对肠上皮屏障功能和细胞凋亡、坏死等死亡方式的影响，以及其在免疫细胞浸润中的作用。研究MAP4K1对上皮细胞完整性和凋亡的调控作用，并探讨其与p53信号通路的关系。 结果 GEO数据库分析结果显示，相比健康人群，IBD患者肠道中Map4k1 mRNA表达水平上调。动物实验表明，相较于野生型（Wild type，WT）小鼠，Map4k1基因敲除型（Map4k1^-/-）小鼠在DSS诱导的实验性结肠炎模型中结肠炎症状减轻，具体表现为体重下降减缓、结肠长度缩短程度降低、组织病理损伤减轻、小鼠的炎症相关细胞因子（Il6、Tnf、Kc、Mcp-1等）mRNA表达水平也显著降低，同时抑制了IκB的磷酸化。机制研究发现，Map4k1缺失可促进肠上皮完整性及屏障相关分子（Muc2、E-cadherin等）mRNA及蛋白表达水平升高。DSS处理后，WT小鼠与Map4k1^-/-小鼠肠道免疫细胞［（巨噬细胞（Macrophages，MACs）、树突状细胞（Dendritic cells，DCs）与中性粒细胞（Polymorphonuclear leukocytes，PMNs）］的浸润和活化水平相似。然而，与WT小鼠相比，Map4k1^-/- 小鼠中抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax的比值显著增加。同样，过表达Map4k1后，上皮细胞凋亡增加。进一步研究发现，Map4k1缺失可以抑制p53表达。 结论 MAP4K1在IBD中表达上调，其缺失可减轻IBD症状，可能通过激活p53诱导肠上皮细胞凋亡推动结肠炎发展。

Abstract

Objective To explore the role of mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 1 （MAP4K1） in the development of colitis in mice and its mechanism of action. Methods The expression of MAP4K1 in the intestinal tissue of inflammatory bowel disease （IBD） patients was analyzed through the GEO database. An experimental colitis model was induced by 3% dextran sulfate sodium salt （DSS）. HE staining and RT-qPCR were used to verify the role of MAP4K1 in inflammation and tissue damage. Flow cytometry and immunohistochemistry were used to analyze the effect of MAP4K1 on intestinal epithelial barrier function and cell apoptosis/necrosis， and its role in immune cell infiltration. The regulatory role of MAP4K1 on epithelial cell integrity and apoptosis， and its relationship with the p53 signaling pathway were also studied. Results Analysis of the GEO database showed that the expression level of Map4k1 mRNA in the intestine of IBD patients was up-regulated compared with that of normal people. Animal experiments indicated that， in comparison with wild-type （WT） mice， Map4k1^-/- mice exhibited alleviated colitis symptoms in the DSS-induced experimental colitis model， which were specifically characterized by slowed weight loss， reduced colon length shortening， attenuated histopathological damage， significantly decreased mRNA expression levels of inflammation-related cytokine genes （including Il6， Tnf， Kc， and Mcp-1） in mice. additionally， phosphorylation of IκB was inhibited. Mechanistic studies found that the absence of Map4k1 enhanced intestinal epithelial integrity and increased the mRNA and protein expression levels of barrier-related molecules （Muc2， E-cadherin， etc.）. After DSS treatment， the infiltration and activation levels of intestinal immune cells ［macrophages （MACs）， dendritic cells （DCs）and polymorphonuclear leukocytes（PMNs）］ were similar between WT and Map4k1^-/- mice. However， the ratio of the anti-apoptotic protein Bcl-2 to the pro-apoptotic protein Bax was significantly increased in Map4k1^-/- mice compared to WT mice. Similarly， overexpression of Map4k1 led to increased epithelial cell apoptosis. Further research indicated that Map4k1 deficiency could suppress the expression of p53. Conclusion MAP4K1 is upregulated in IBD patients. Its deficiency alleviates IBD symptoms， possibly promoting colitis development by activating p53 to induce apoptosis of intestinal epithelial cells.

Graphical abstract

关键词

有丝分裂原激活蛋白激酶1 / 炎症性肠病 / p53 / 细胞凋亡 / 肠上皮屏障

Key words

Mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 1 / Inflammatory bowel disease / p53 / Cell apoptosis / Intestinal epithelial barrier

研究表明，炎症性肠病（Inflammatory bowel diseases，IBD）的发病率在发展中国家呈现出持续增长的趋势^［1-3］。IBD主要包括克罗恩病（Crohn's disease，CD）和溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC），是一种慢性反复发作的肠道炎症性疾病，其临床特点表现为持续性炎症、腹痛、直肠出血、腹泻以及营养不良^［4］。IBD已被证实是结直肠癌的重要危险因素之一^［5］。IBD的发病机制被认为是肠道微生物或微生物产物与肠道上皮细胞和局部免疫系统的相互作用，导致黏膜免疫反应异常，从而产生大量炎性细胞因子（Il6、Tnf、Kc、Mcp-1等）^［6］。研究表明，IBD患者的结肠黏液层恶化明显，肠上皮屏障的破坏程度与炎性细胞因子的表达水平呈正相关^［7］。

有丝分裂原激活蛋白激酶1（Mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 1，MAP4K1）在多种组织中的表达水平存在显著差异^［8］。值得注意的是，MAP4K1在所有类型的造血细胞和免疫细胞中均有表达^［9］，且在细胞增殖和凋亡过程中发挥着复杂作用^［10］。MAP4K1参与多种细胞事件，包括ERK信号通路、NF-κB信号通路、细胞因子信号通路、细胞增殖和凋亡、TCR/BCR信号转导和T/B/树突状细胞介导的免疫应答，在体内发挥着复杂而重要作用^［11-13］。

MAP4K1作为蛋白激酶，促进LFA-1介导的中性粒细胞（Polymorphonuclear leukocytes， PMNs）黏附诱导，促进PMNs的黏附和迁移，从而促进急性炎症的发展^［14］。在先天病毒感染中，MAP4K1可由泛素连接酶DTX4通过K48连接的泛素化促进TBK1/IKKε降解，导致IFN信号通路的负调节，从而抑制RLR信号转导，抗先天病毒免疫^［15］。研究发现，MAP4K1在系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus， SLE）患者滤泡辅助T细胞（T follicular helper cells， Tfh cells）中表达较低，其mRNA的表达水平与SLE患者的疾病活动性呈负相关。并且MAP4K1可通过多种机制抑制SLE的发病和进展^［16-18］。同时有研究^［19-22］发现，MAP4K1在结直肠癌、胶质母细胞瘤、胰腺导管腺癌等不同肿瘤中也发挥着重要且复杂作用。研究发现Pdcd4敲除可以上调MAP4K1表达，进而通过c-Myc激活AP-1依赖性转录，促进结直肠癌细胞侵袭^［23］。相反，另一项研究揭示SPIB通过激活MAP4K1来增强NF-κB和JNK信号通路的活性，从而抑制结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成，并提高对化疗药物的敏感性，提示SPIB可能通过调控MAP4K1发挥其抑癌功能^［24］。这些研究共同表明，MAP4K1在结直肠癌的发生发展过程中具有复杂的调控机制。然而，IBD作为结直肠癌的危险因素，迄今尚未阐明MAP4K1在IBD发展中的作用及MAP4K1调节结肠炎发展的确切机制仍不清楚。

鉴于此，我们基于GEO数据库分析MAP4K1在IBD患者肠道组织中的表达情况。利用DSS诱导的急性肠炎模型，结合HE染色、RT-qPCR等技术，研究MAP4K1在炎症及组织损伤中的作用。探讨MAP4K1发挥作用的分子调控机制，有助于揭示其在促进炎性结肠炎中的作用靶点，为IBD的治疗提供新策略和思路。

1 材料与方法

1.1　小鼠

选用C57BL/6遗传背景的野生型（Wild type，WT）小鼠及Map4k1基因敲除型（Map4k1^-/-）小鼠（6～8周龄），小鼠采购于赛业生物科技有限公司［实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2022-0016］。所有小鼠均饲养于赣南医科大学实验动物中心SPF级屏障环境，采用独立通气笼盒系统进行标准化管理。动物实验方案经赣南医科大学实验动物伦理委员会审查通过（2023317），全程遵循实验动物研究指南及国家标准。

1.2　细胞

人结肠癌细胞系HCT116细胞、正常结肠上皮细胞NCM460细胞均来源于美国菌种保藏中心（American type culture collection， ATCC），经短串联重复序列（Short tandem repeat， STR）鉴定确认为贴壁依赖性细胞系。

1.3　MAP4K1表达数据分析

利用GEO数据库（GSE4183、GSE66407）探讨MAP4K1在IBD患者肠道组织中的表达情况。对原始数据进行标准化处理，以消除技术误差并确保数据的可比性。基于样本的病理状态分为IBD患者组和健康对照组。分析基因差异表达水平，以P<0.05为显著性差异标准，并进行多重比较校正以控制假阳性率。

1.4　DSS诱导的小鼠实验性结肠炎模型的建立

使用含有3%葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium salt， DSS）饮用水喂养小鼠连续5 d，随后改为普通饮用水喂养3 d，其间持续记录小鼠体重变化以监控其健康状况。在DSS处理后的第8 d处死小鼠，收集其结肠组织，并对结肠长度进行测量，以评估DSS诱导炎症对肠道形态的影响。

1.5　组织病理学分析

收集结肠组织，福尔马林固定24 h，石蜡包埋，切片（4 μm）后用苏木精-伊红（Hematoxylin eosin， HE）染色。根据炎症浸润程度、溃疡程度、黏膜增生程度和病变范围，对切片进行组织病理学评分。评分标准见表1。

1.6　实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

使用酚-氯仿法从组织或细胞样本中提取总RNA，并利用NanoDrop仪器进行质量控制。提取的RNA经过gDNA Eraser试剂盒去基因组处理后，逆转录为cDNA，并进行5倍稀释。取1 μL稀释后的cDNA作为模板，加入10 μL的SYBR Green荧光染料，配制qPCR反应体系。PCR反应条件设置为：初始变性95 ℃ 5 min，随后进行40个循环，每个循环包括95 ℃ 30 s的变性和60 ℃ 1 min的退火。最后，通过熔解曲线分析验证引物的特异性。以Actb作为管家基因，计算目标基因的相对表达量。引物序列见表2。

1.7　蛋白免疫印迹（Western-blot， WB）

采用双缩脲法（Bicinchoninic acid， BCA）精确测定蛋白浓度。通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，之后将蛋白转移到PVDF膜上。转移完成后，对膜进行封闭处理以减少非特异性结合。加入一抗进行孵育，再加入与一抗相对应的二抗孵育。孵育后，彻底清洗膜以去除未结合的抗体。最后，使用增强化学发光（Enhanced chemiluminescence， ECL）对比液进行印迹显影，并通过Image J软件对条带进行定量分析，以评估蛋白的表达水平。抗体信息见表3。

1.8　过表达Map4k1质粒构建

将Map4k1基因克隆到一个带有强启动子的真核表达载体中。使用限制性内切酶对载体和含有Map4k1基因的DNA进行切割，并利用T4 DNA连接酶将Map4k1基因插入到载体的多克隆位点。构建好的质粒通过测序验证无误后，使用脂质体转染试剂（Lipo8000™转染试剂，碧云天）将质粒转染到目标上皮细胞中，以实现Map4k1基因过表达。转染24 h后，通过WB等方法检测MAP4K1表达水平。

1.9　免疫组织化学染色（Immunohistochemistry， IHC）

将小鼠结直肠组织切片固定于福尔马林溶液并嵌入石蜡块，随后进行脱蜡、水化处理。对切片进行抗原修复，以暴露抗原位点。通过封闭液阻断非特异性结合，一抗过夜孵育，二抗孵育以检测一抗结合。使用二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）显色，并在显微镜下观察和分析染色结果，以评估目标蛋白在组织中的表达和分布。抗体信息见表3。

1.10　流式细胞术（Flow cytometry， FCM）

将细胞悬液与特定荧光标记的抗体混合，以识别目标细胞群体。孵育后，通过流式细胞仪进行检测，设置特定的门限和参数，可以区分不同的细胞亚群，并定量分析目标蛋白的表达水平。所得数据通过流式细胞分析软件进行处理和分析，以评估细胞群体的变化。

1.11　LPS刺激细胞模型建立

培养WT与Map4k1^-/- 小鼠骨髓来源的巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophage，BMDM）和树突状细胞（Bone marrow-derived dendritic cells，BMDC）。将1 μg/mL的LPS与细胞培养基混合制备刺激液，均匀加入到BMDM或BMDC细胞的培养孔中，在37 ℃、5% CO₂培养箱中共同孵育3 h。

1.12　统计学处理

使用Graphpad prism 8.0软件进行统计分析。2组间单因素比较使用独立样本t检验；多组间单因素比较使用单因素方差分析；两因素组间比较使用两因素方差分析和Sidak多重比较法；小鼠结直肠的组织病理学评分和IHC染色评分使用Mann Whitney检验及Kruskal-Wallis检验分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1　 Map4k1基因在IBD患者肠道组织的表达情况

为了明确MAP4K1在IBD的发生发展中是否发挥重要作用，基于GEO数据库（GSE4183、GSE66407）结果发现，相较于健康人群肠道组织，IBD患者肠道组织中Map4k1 mRNA表达水平明显升高，且差异表达主要部位为直肠组织（图1）。由此，我们推测Map4k1基因可能参与IBD发生与发展。

2.2　MAP4K1促进DSS诱导结肠炎的发生发展

为了进一步探究MAP4K1在IBD的作用，我们使用DSS溶液诱导小鼠建立结肠炎模型（图2A）。通过每天监测小鼠体重及状态，评估MAP4K1在结肠炎中的作用和机制。结果发现，与WT小鼠相比，Map4k1^-/-小鼠体重下降幅度更小（图2B）、结肠长度更长（图2C～2D）。HE染色结果显示，Map4k1^-/-小鼠的结直肠组织溃疡数目更少、面积更小，炎性细胞浸润深度较表浅（图2E），且炎症评分更低（图2F）。以上结果表明，相较于WT小鼠，Map4k1^-/-小鼠对DSS诱导的结肠炎更不易感。

在结肠炎的发展过程中，病原微生物可能通过入侵受损的肠道屏障，引起炎症信号，进一步激活转录因子，诱发炎症相关细胞因子的产生^［25］。IL-6是炎症性疾病发展过程中主要的促炎症细胞因子，因此本研究检测了WT小鼠和Map4k1^-/-小鼠Il6 mRNA表达水平。结果发现，与WT小鼠相比，Map4k1^-/-小鼠的结直肠组织中Il6 mRNA表达水平在DSS处理后的第8 d明显下调（图3A）。与此同时，与WT小鼠相比，Map4k1^-/-小鼠的结直肠组织中Tnf、Il1b、Kc、Mcp1、Cxcr2、Ccl4等基因mRNA表达水平也明显下调（图3B～3I）。这些结果表明，在DSS诱导的结肠炎中，Map4k1敲除抑制包括IL-6在内的炎症相关细胞因子的产生，从而减弱了小鼠的局部炎症。我们还检测了经典炎症信号通路中关键分子的蛋白表达情况。结果显示，相比于WT小鼠，Map4k1^-/-小鼠结直肠组织中IκB的磷酸化水平受到抑制（图3J～3K）。综上结果得出，在DSS诱导的结肠炎中，Map4k1^-/- 小鼠的炎症水平低于WT小鼠。

2.3　MAP4K1可能促使小鼠肠道上皮屏障完整性受损

肠腔和黏膜之间的肠上皮屏障是宿主防御微生物感染的关键^［26-28］。该屏障由完整的肠上皮细胞（Intestinal epithelial cells， IECs）单细胞层及其分泌的黏液蛋白和紧密连接（Tight junction， TJ）蛋白组成，包括E-cadherin、β-catenin、Occludin、ZO-1、Desmosomes和抗菌肽^［29］。研究表明，Occludin等分子可调节肠道上皮的完整性^［30-31］。本研究为了确认WT小鼠与Map4k1^-/-小鼠在结肠炎发展过程中肠道屏障是否发生变化，检测了上皮屏障相关的基因（Muc2、Muc3、Muc4）以及紧密连接相关的基因（Cdh1、Tjp1、Ocln、Ctnnb1和Desmocollin1等）的表达情况。结果显示，与WT小鼠相比，Map4k1^-/- 小鼠结直肠组织中Muc2、Cdh1等基因mRNA表达水平明显上调，但其他基因的mRNA表达水平无明显变化（图4A～4H）。随后，我们检测了上皮屏障相关分子蛋白表达水平，与mRNA表达变化一致，Map4k1缺失后小鼠结直肠组织中Muc2、E-cadherin、β-catenin、Occludin蛋白表达明显增加（图4I～4M）。

为了进一步证实MAP4K1对肠上皮屏障分子的调控作用。我们培养了保留上皮细胞特性的结肠癌上皮细胞HCT116细胞以及正常肠上皮细胞NCM460细胞，将过表达Map4k1质粒转染至上皮细胞中，检测Muc2、E-adherin等屏障分子的蛋白表达情况。结果显示，过表达Map4k1后，Muc2、E-adherin、β-catenin以及Occludin的蛋白表达水平明显下调（图5A～5B）。该结果表明，MAP4K1可使肠道上皮屏障相关分子表达减少，提示MAP4K1可能导致肠上皮屏障完整性受损。

2.4　MAP4K1可能不直接参与调控肠道免疫细胞的浸润和活化过程

免疫细胞在IBD的病理过程中发挥着重要作用^［32］。有研究^［33］表明，免疫细胞的异常活化会导致肠道免疫屏障受损。基于此，我们将DSS处理后的肠道组织进行IHC染色，并检测巨噬细胞（Macrophages，MACs）、树突状细胞（Dendritic cells，DCs）、PMNs的浸润情况。结果显示，MACs、DCs与PMNs在WT与Map4k1^-/- 小鼠中的浸润数量无明显变化（图6A～6B）。为了进一步验证其浸润情况，我们使用DSS处理小鼠，并从肠道中分离其固有层细胞，并使用FCM检测MACs、DCs与PMNs的浸润情况。与IHC结果一致，MACs、DCs与PMNs在WT与Map4k1^-/- 小鼠中的浸润情况无明显变化（图6C～6F）。

为了探讨MAP4K1是否调控免疫细胞的活化过程，给予BMDM、BMDC LPS刺激后检测炎症相关的细胞因子，结果发现WT与Map4k1^-/- 小鼠来源的BMDM及BMDC经LPS刺激后炎症反应差异无统计学意义。因此，MAP4K1可能不影响免疫细胞的活化与浸润（图7A～7F）。

2.5　MAP4K1可能促进肠道上皮细胞凋亡

在IBD的发病过程中，IECs可能经历多种细胞程序性死亡方式，包括细胞凋亡、坏死性凋亡和细胞焦亡。这些细胞死亡形式之间的相互作用和信号通路的交叉，进一步加剧了肠上皮屏障的损伤^{［26，34-36］}。为了探究经DSS诱导后，MAP4K1是否参与调控肠道上皮细胞的程序性死亡过程。本研究检测了小鼠结直肠组织中Gpx4、Gsdmd、MLKL等分子的活化水平。结果显示，与WT小鼠相比，Map4k1^-/- 小鼠Gpx4、Gsdmd、MLKL等分子的活化水平差异无统计学意义（图8A～8F）。这表明MAP4K1对肠道上皮屏障的损伤作用可能不涉及细胞铁死亡、焦亡、坏死或自噬。

随后，我们检测了Bcl-2、Bax等凋亡相关分子的蛋白表达水平，结果发现与WT小鼠相比，Map4k1^-/- 小鼠肠道细胞Bcl-2/Bax比值显著增加（图9A～9E）。

为了进一步验证MAP4K1对肠上皮细胞凋亡的影响。我们进行了体外实验，将过表达Map4k1质粒转染至HCT116细胞以及NCM460细胞中，随后使用FCM检测细胞凋亡情况，并检测Bcl-2与Bax的蛋白表达情况。结果显示，与体内结直肠组织观察到的结果一致，过表达Map4k1显著增加了细胞凋亡率（图10A～10D），并且降低了Bcl-2/Bax比值（图10E～10F）。综上所述，这些结果表明MAP4K1可能通过促进肠上皮细胞凋亡，进而促进IBD发展。

2.6　MAP4K1促进p53表达

研究发现，p53在细胞凋亡中发挥着关键作用，p53可与Bcl-2结合，占据其BH3疏水口袋，阻止促凋亡蛋白如Bax与Bcl-2的结合，从而促进细胞凋亡^［37-39］。基于这一机制，我们检测了DSS处理后的小鼠结直肠组织中p53蛋白表达水平。结果显示，与WT小鼠相比，Map4k1^-/- 小鼠p53表达水平显著降低（图11A～11B）。为了进一步探究MAP4K1对p53表达的影响，我们将过表达Map4k1的质粒转染至HCT116上皮细胞，并检测p53蛋白表达。结果与体内观察到的结直肠组织结果一致，过表达Map4k1后p53表达水平升高（图11C）。综上所述，MAP4K1可增强p53表达，进而促进IBD发展。

3 讨论

IBD是一种长期反复发作、涉及胃肠道多个部位的炎症性疾病。其中，UC是最主要的IBD类型，其病变通常始于直肠，并向大肠近端扩展，主要局限于黏膜层。目前，常见的临床药物包括水杨酸类、糖皮质激素类以及免疫抑制剂类等，但这些药物在长期或大剂量使用时往往伴随着较多不良反应，治疗过程耗时且经济负担较重，导致部分患者难以坚持治疗^［40-42］。因此理解IBD的发病机制，找到新的治疗策略来改善患者预后是至关重要的。

本研究揭示了MAP4K1在IBD中的关键作用及其分子机制。通过分析GEO数据库中的数据集，发现IBD患者肠道组织中Map4k1基因的表达水平显著高于健康人群，且差异主要集中在直肠组织。这一结果提示MAP4K1可能在IBD的发生发展中发挥重要作用。进一步利用DSS诱导结肠炎的小鼠模型进行研究，发现与WT小鼠相比，Map4k1^-/- 小鼠在DSS诱导的结肠炎中体重下降幅度更小，结肠长度更长，组织损伤和炎性细胞浸润也更少，表明Map4k1^-/- 小鼠对DSS诱导的结肠炎更不易感。在炎症因子方面，Map4k1^-/- 小鼠结直肠组织中Il6、Tnf、Kc等炎症相关细胞因子基因mRNA表达明显下调，同时经典炎症信号通路中IκB的磷酸化水平也受到抑制。这进一步证实了敲除Map4k1可以抑制炎症相关细胞因子的产生，从而减轻局部和全身的炎症反应。这提示MAP4K1可能通过调控炎症因子的表达和炎症信号通路的激活，在IBD的炎症过程中发挥促进作用。这一发现与先前研究揭示MAP4K1具有负向调控作用，能够平衡前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）诱导的Fos基因转录，从而防止炎症反应过度激活^［43］这一作用恰好相反。可能原因在于MAP4K1在不同生理或病理状态下发挥不同功能。在某些情况下，MAP4K1可能通过负向调控作用来平衡炎症反应，而在IBD背景下，MAP4K1可能通过促进炎症因子的表达和激活炎症信号通路来加剧炎症过程。这种差异可能是由于不同研究中所关注的炎症类型、MAP4K1的作用细胞类型、信号通路的复杂交互作用，或是MAP4K1在不同组织中的表达水平和活性差异所导致的。这也提示MAP4K1在炎症反应中的作用具有复杂性和多样性，其功能取决于特定的炎症环境。因此，在考虑MAP4K1作为IBD治疗靶点时，需要更全面理解其在不同炎症状态下的具体作用机制。此外，这也可能意味着在开发针对MAP4K1药物时，需要考虑其在不同炎症性疾病中的潜在作用，以确保治疗的安全性和有效性。

肠上皮屏障功能障碍是IBD发病的核心环节^［26-28］。本研究检测了与肠道屏障相关的基因和蛋白表达，结果显示Map4k1^-/- 小鼠结直肠组织中Muc2、Cdh1等基因mRNA表达上调，且Muc2、E-cadherin、Occludin蛋白表达水平也明显增高，表明Map4k1缺失可以增强肠道上皮屏障的完整性。本研究证实MAP4K1通过抑制E-cadherin等紧密连接蛋白的表达，破坏屏障完整性。这一发现与既往研究显示DLX6-AS1通过FUS正向调控MAP4K1表达，促进胃癌细胞EMT过程的机制一致^［44］，虽然MAP4K1在IBD和胃癌中的作用机制相似，但其对疾病进程的影响可能因组织类型和环境而异。提示在开发针对MAP4K1的治疗策略时，需要考虑其在不同疾病中的特异性作用。

本研究揭示了MAP4K1通过促进肠上皮细胞凋亡参与IBD的机制。我们检测了与细胞铁死亡、焦亡、坏死性凋亡相关的分子，结果显示Map4k1^-/- 小鼠中Gpx4、Gsdmd、MLKL等分子的活化水平与WT小鼠相比差异无统计学意义，表明MAP4K1与这些细胞死亡方式无关。然而，Map4k1^-/- 小鼠中抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调，促凋亡蛋白Bax下调。且体外实验中，过表达Map4k1的结肠癌上皮细胞显示Muc2、E-adherin、Bcl-2、Bax表达水平与体内相似，证实MAP4K1可能通过促进肠上皮细胞凋亡，从而促进IBD发展。这一发现与MAP4K1在胰腺癌中作为肿瘤抑制因子的作用呈现出相反的功能特征^［45］，进一步提示MAP4K1的功能可能具有高度的组织和疾病特异性。在不同的生理或病理环境中，MAP4K1可能通过不同的信号通路和分子机制发挥作用。进一步机制研究表明，Map4k1缺失导致p53蛋白表达显著增加，提示其可能通过抑制p53稳定性或转录活性促进凋亡。p53作为经典凋亡调控因子，可通过激活Bax、Puma等促凋亡基因或直接与Bcl-2家族蛋白相互作用诱导细胞死亡^［37-39］。然而，MAP4K1如何调控p53仍需深入探究。

尽管已知MAP4K1在免疫细胞（如MACs、DCs）中发挥调控作用^{［18，46-47］}，本研究意外发现Map4k1缺失未改变巨噬细胞、DC或中性粒细胞的浸润水平，且体外BMDM/BMDC的炎症应答差异无统计学意义，表明MAP4K1可能不影响免疫细胞的活化与浸润。这提示MAP4K1在IBD中的作用可能主要不是通过直接调控免疫细胞来实现，而是通过其他途径，如影响肠道屏障和炎症因子等发挥作用。

尽管本研究系统阐明了MAP4K1在IBD中的功能，仍存在以下局限性：⑴MAP4K1调控p53的具体分子机制尚未完全阐明，有待在未来研究中通过进一步的机制性实验加以验证；⑵MAP4K1抑制剂的开发及在IBD治疗中的应用前景尚待探索。未来研究可聚焦以下方向：在机制扩展方面，可利用磷酸化蛋白质组学和基因编辑技术（如CRISPR筛选）来揭示MAP4K1调控p53的具体机制，深入解析MAP4K1与p53等信号通路的交互网络，以更全面理解其在IBD发生发展中的作用。在临床转化方面，评估现有MAP4K1抑制剂（如PF-07265028）在IBD模型中的疗效^［48］，并开发肠道靶向递送系统，以降低系统性毒性，提高治疗的安全性和有效性。在精准医学方面，基于MAP4K1表达水平对IBD患者进行分层，指导个性化治疗策略，为患者提供更具针对性的治疗方案。

综上所述，本研究确立了MAP4K1作为IBD的新型治疗靶点，其通过促进上皮细胞凋亡，破坏肠上皮屏障，从而驱动疾病进展。这一发现不仅拓展了人们对MAP4K1的生物学功能认知，也为IBD的精准治疗提供了新思路。未来结合机制解析和药物开发，靶向MAP4K1可能成为缓解IBD病理进程的有效策略。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31960163)

江西省林业局油茶研究专项项目(YCYJZX2023312)

江西省自然科学基金项目(20242BAB26091)

江西省自然科学基金项目(20232BAB216036)

江西省卫生健康委员会项目(202311176)

赣州市指导性科技计划项目(GZ2024ZSF156)