基于Nrf2/HO-1信号通路探讨褪黑素对去卵巢大鼠氧化应激损伤的作用

The effect of melatonin on oxidative stress damage in ovariectomized rats based on the Nrf2/HO-1 signaling pathway

摘要

目的 基于Nrf2/HO-1信号通路探讨褪黑素对去卵巢快速骨丢失模型大鼠氧化应激损伤的作用机制。 方法 将24只SD大鼠随机分为假手术组、模型对照组和褪黑素组，每组8只。双侧卵巢切除术复制快速骨丢失模型，灌胃干预12周，双能X线骨密度仪检测骨密度，苏木素-伊红染色观察骨显微结构，ELISA检测骨代谢指标骨源性碱性磷酸酶（Bone-specific alkaline phosphatase，BAP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）和氧化应激指标超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、氧化应激指标丙二醛（Malondialdehyde，MDA），实时荧光定量PCR（Real-time PCR）和蛋白质印迹（Western blot）检测股骨核转录因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、血红素加氧酶-1（Heme oxygenase 1，HO-1）mRNA和蛋白的相对表达水平。 结果 与假手术组比较，模型对照组大鼠骨密度显著降低，表明骨丢失模型大鼠构建成功。褪黑素干预12周后，与模型对照组比较，褪黑素组骨密度值显著升高（P<0.01），骨小梁数量增加和骨小梁间距缩短，血清BAP和TRAP含量均降低（P<0.01），SOD含量升高和MDA含量降低（P<0.01），Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白表达水平均显著升高。 结论 褪黑素可激活Nrf2/HO-1信号通路，降低氧化应激损伤，改善雌激素水平急剧降低引起的骨量丢失。

Abstract

Objective To explore the mechanism of melatonin on oxidative stress damage in rats with rapid bone loss after ovariectomy based on the Nrf2/HO-1 signaling pathway. Methods A total of 24 SD rats were randomly divided into a sham operation group， a model control group， and a melatonin-treated group， with 8 rats in each group. Bilateral oophorectomy was performed to replicate a rapid bone loss model， followed by gastric intervention for 12 weeks. Bone density was measured using a dual energy X-ray absorptiometry， and bone microstructure was observed using hematoxylin-eosin staining. ELISA was used to detect bone metabolism indicators including bone-specific alkaline phosphatase （BAP）， tartrate-resistant acid phosphatase （TRAP）， and oxidative stress indicators such as superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA）. Real-time PCR and Western blot were used to detect the relative mRNA and protein expression levels of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2） and heme oxygenase-1 （HO-1） in the femur. Results Compared with the sham operation group， the bone mineral density of rats in the model control group decreased significantly， indicating that the rat model of bone loss was successfully established. After 12 weeks of melatonin intervention， compared with the model control group， the BMD of the melatonin group was significantly increased （P <0.01）； the number of trabeculae increased and the trabecular spacing shortened； the serum BAP and TRAP were both decreased （P <0.01）； SOD was increased and MAD content was decreased （P <0.01）； and the mRNA and protein expression levels of Nrf2 and HO-1 were significantly increased. Conclusion Melatonin can activate the Nrf2/HO-1 signaling pathway， reduce oxidative stress damage， and improve bone loss caused by a sharp decrease in estrogen levels.

Graphical abstract

关键词

绝经后骨质疏松症 / 褪黑素 / 氧化应激 / Nrf2/HO-1信号通路

Key words

Postmenopausal osteoporosis / Melatonin / Oxidative stress / Nrf2/HO-1 signaling pathway

绝经后骨质疏松症（Postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一种常见于绝经后女性的疾病。其主要原因是雌激素水平急剧下降，导致全身骨量降低和骨组织结构改变，骨脆性增加导致骨折风险大幅升高，骨折引起的疼痛、骨骼变形及合并症会严重影响中老年女性的生活质量^［1］。骨重建由成骨细胞主导的骨形成与破骨细胞主导的骨吸收共同组成，PMOP中骨吸收量远超新骨形成量，处于负平衡状态，从而造成骨量快速大量丢失。有研究^［2-4］表明，过度的氧化应激在PMOP中发挥重要作用，机体内自由基的过量堆积，打破氧化和抗氧化的平衡状态，持续的氧化应激可引起成骨细胞的损伤甚至凋亡^［5］，同样可促进破骨细胞增殖分化^［6］，从而促进疾病的发生和发展。

核转录因子E2相关因子2（Nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反应元件（Antioxidant response elements，ARE）信号通路是抗氧化应激的重要路径^［7］，氧化应激损伤可促进下游血红素加氧酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等表达，通过抗氧化应激发挥保护细胞作用。褪黑素（Melatonin，MT）是松果体分泌的吲哚类激素，具有维持机体昼夜节律性和调节睡眠等生理功能，近年来大量研究表明，其可维持骨代谢的动态平衡，促进成骨细胞分化和抑制破骨细胞活性，对PMOP的骨量流失起保护作用^［8-10］，然而是否通过抗氧化应激发挥抗骨质疏松作用有待研究。基于此，本研究通过建立大鼠快速骨丢失模型，以Nrf2/HO-1信号通路为切入点，探讨褪黑素对卵巢切除大鼠过度氧化应激的影响，为褪黑素防治PMOP提供实验基础。

1 材料与方法

1.1　实验动物

SPF级3月龄雌性SD大鼠24只，（200±20）g，购自上海杰思捷实验动物有限公司，合格证编码20210004027331，饲养于福建省中医药科学院比较医学中心，实验动物生产许可证号［SCXK（沪）2018-0004］和使用许可证号［SYXK（闽）2016-0005］，采用标准饲料喂食保证营养需要，适应性喂养1周后进行实验。本研究经福州市第二总医院伦理委员会审批（编号：2021068013）。

1.2　实验药物

褪黑素，批准文号：国药准字J20130085，产品批号：T014466。

1.3　主要试剂与仪器

4%组织细胞固定液（北京索莱宝科技有限公司，批号P1110）；EDTA脱钙液（pH 7.2）（Biosharp，批号BL616B）；大鼠骨特异性碱性磷酸酶（上海酶联生物科技有限公司，货号ml037086）；大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，货号ml106987）；TransScript^® Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（北京全式金生物技术，批号AU341-02）；PerfectStart^® Fast Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技术，批号AQ611-01）；β-actin rabbit mAb（爱博泰克生物，批号AC038）；NRF2 rabbit pAb（爱博泰克生物，批号A0674）；Heme oxygenase 1 rabbit pAb（爱博泰克生物，批号A1346）；酶标仪（BIO-TEK，型号LX-800）；双能X线骨密度仪（HOLOGIC，型号Discovery Wi）；石蜡切片机（德国徕卡，型号RM2235）；正置显微镜（德国徕卡，型号ivesta 3）；Real-time PCR（ABI，型号7500 Fast）。

1.4　方法

1.4.1　模型制备

将24只SD大鼠按照随机数字法分为3组：假手术组（Sham）、模型对照组（OVX）和褪黑素组（OVX+MT），每组8只。模型对照组和褪黑素组双侧卵巢切除术制备大鼠快速骨丢失模型，禁食不禁水12 h，称量体重，戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔膜注射全身麻醉，腹部备皮，作前正中线切口进入腹腔，结扎并彻底切除双侧卵巢，缝合，肌注青霉素钠预防术后感染；相同操作方法只切除卵巢周边脂肪组织作为假手术组。

1.4.2　药物干预和取材

术后褪黑素组按照100 mg/（kg·d）褪黑素进行口服^［8］，假手术组和模型对照组使用等量生理盐水灌胃，连续干预12周；大鼠麻醉后仰卧位固定，打开腹腔，无菌纱布推开肠道，充分暴露腹主动脉，采血针穿刺取血；眼科剪和眼科镊清除股骨和胫骨周围肌肉组织，并保持骨组织完整，超低温保存待检。

1.4.3　骨密度

剔除肌肉组织，生理盐水浸湿纱布包裹胫骨，-20 ℃保存备检；彻底恢复至常温并保持胫骨表面湿润，放置于扫描床固定位置，骨密度仪通过每日校准质检，变异系数（Coefficient of variation，CV）为0.307%，选择小动物高分辨扫描模式进行扫描，扫描结束后划分骨骺线下方固定感兴趣区域（Region of interest，ROI）测量骨密度值。

1.4.4　苏木素-伊红染色

胫骨置于4%组织细胞固定液48 h，EDTA脱钙液3 d更换1次直到脱钙完成，水洗胫骨，自动脱水机进行脱水、透明和浸蜡，石蜡包埋；5 μm切片，摊片，拷片，石蜡切片脱蜡复水，苏木素染色20 min，水洗，分色，镜下控制，水洗，伊红染色1 min，水洗，中性树脂封片，光镜观察并拍照。

1.4.5　ELISA

全血静置3 h，离心机1 000 rpm离心15 min，离心半径10 cm，吸取上层血清待检；按照说明书要求加标准品和样本，加酶标试剂100 μL，37 ℃孵育60 min，弃液并控干，洗涤液洗涤，依次加入显色剂A和B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，加终止液终止反应；酶标仪测定吸光度，根据标准品光密度值（Optical density， OD）制作标准曲线，计算骨代谢指标骨源性碱性磷酸酶（Bone-specific alkaline phosphatase， BAP）和抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase， TRAP）、氧化应激指标丙二醛（Malondialdehyde， MDA）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD）的含量。

1.4.6　实时荧光定量PCR（Real-time PCR）

股骨超低温研磨成粉末，TRIzol法提取总RNA，检测OD 260/280 nm吸光度，逆转录为cDNA，-20 ℃保存备检；基因引物见表1，SYBR Green 20 μL反应体系，95 ℃ 15 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40个循环作为反应条件，以β-actin基因作为内参，2^-△△CT法计算Nrf2和HO-1基因的mRNA相对表达水平。

1.4.7　蛋白质印迹（Western blot）

股骨超低温研磨成粉末，提取总蛋白，BCA定量法测蛋白浓度；蛋白样本加入5×Loading buffer变性，-20 ℃保存备检；蛋白样本通过SDS-PAGE电泳，转膜，脱脂奶粉封闭，分别加入1∶10 000稀释的β-actin、1∶1 000稀释的Nrf2和HO-1一抗4 ℃摇床过夜，TBST洗涤，1∶1 000二抗室温摇床60 min，TBST洗涤，显影，ImageJ分析条带灰度值，以β-actin为内参，计算Nrf2和HO-1的蛋白相对表达水平。

1.5　统计学处理

采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料以\overline{x}±s表示，符合正态分布采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，方差不齐采用Tamhane检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1　褪黑素对去卵巢大鼠骨密度的影响

与假手术组比较，模型对照组大鼠骨密度显著降低（P<0.05）；与模型对照组比较，褪黑素组骨密度显著升高（P<0.05），仍然低于假手术组。见表2。

2.2　褪黑素对去卵巢大鼠骨组织结构的影响

假手术组可见胫骨近端骨骺线下方区域内骨小梁数量多、骨小梁间距小、排列规则、互相连接；模型对照组骨小梁显著稀疏、骨小梁间距显著加大，骨小梁连接断裂，髓腔内显著脂滴聚集；与模型对照组相比，褪黑素组骨小梁数量增加、间距缩小、排列相对规则，髓腔内脂滴数量同样减少。见图1。

2.3　褪黑素对去卵巢大鼠血清骨代谢指标的影响

与假手术组比较，模型对照组和褪黑素组血清中骨形成指标BAP和骨吸收指标TRAP含量均增高（P<0.01）；与模型对照组比较，褪黑素组BAP和TRAP含量均降低（P<0.01）。见表3。

2.4　褪黑素对去卵巢大鼠血清氧化应激指标的影响

与假手术组比较，模型对照组和褪黑素组血清MDA含量增高（P<0.01），SOD含量降低（P<0.01）；与模型对照组比较，褪黑素组MDA含量降低（P<0.05），SOD含量增高（P<0.01）。见表4。

2.5　褪黑素对去卵巢大鼠Nrf2和HO-1 mRNA表达的影响

与假手术组比较，模型对照组骨组织Nrf2和HO-1 mRNA相对表达水平均降低（P<0.01）；与模型对照组比较，褪黑素组Nrf2和HO-1 mRNA表达均升高（P<0.05），仍低于假手术组。见图2。

2.6　褪黑素对去卵巢大鼠Nrf2和HO-1蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型对照组骨组织Nrf2和HO-1的蛋白相对表达水平均降低（P<0.01）；与模型对照组比较，褪黑素组Nrf2和HO-1的蛋白相对表达水平均升高（P<0.01）。见图3。

3 讨论

绝经后女性雌激素水平的骤降是PMOP发病的关键初始因素，并且雌激素与氧化应激（Oxidative stress， OS）关系密切^［11-12］，机体雌激素水平急剧降低引起抗氧化系统的清除能力降低，活性氧（Reactive oxygen species， ROS）包括H₂O₂、OH^-和O₂^-等高化学反应的活性分子大量蓄积可导致线粒体结构受损，触发内质网应激。内质网是极为重要的细胞器，是蛋白质合成、折叠和加工的主要场所，而持续的未折叠蛋白反应可引起成骨细胞骨基质合成功能障碍甚至凋亡、骨髓间充质干细胞的成骨分化受损和破骨细胞活跃^［13-15］，骨吸收量显著强于骨形成量，引起骨重建负平衡，从而导致PMOP的发生。近年来研究显示氧化应激与骨代谢关系密切^［16］，异常的氧化应激在增强破骨细胞的生成和骨吸收活性的同时^［17］，可降低成骨细胞的数量和骨形成活性^［18］，抗氧化应激反应的物质可调控骨代谢发挥抗骨质疏松作用。

Nrf2/ARE信号通路是机体调控氧化应激动态平衡的核心路径之一^［19］，Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1， KEAP1）是氧化应激的传感器，生理状态下与转录因子Nrf2结合促使其泛素化并降解，强烈氧化应激促使KEAP1与Nrf2解离，Nrf2入核与ARE结合并启动下游相关抗氧化应激基因HO-1等转录，提高细胞抗氧化能力以避免氧化应激损伤。Nrf2^-/-小鼠骨髓ROS含量升高，破骨细胞分化活性增强，骨转换速率加快和骨吸收占主导地位，从而出现股骨骨密度降低和椎骨皮质骨面积减少^［20］；通过激活Nrf2/ARE信号通路可缓解成骨细胞的氧化应激损伤和凋亡^［21］。HO-1具备抗氧化应激和抗凋亡特性的同时也是维持骨稳态平衡的重要因子^［22］，其在骨髓中高表达，HO-1的代谢产物总胆红素与无潜在肝病的绝经后妇女骨密度呈正相关^［23］，人骨髓间充质干细胞过表达HO-1可促进成骨分化和骨形成^［24］。本研究结果显示，与假手术组比较，模型对照组骨密度值显著降低（P<0.05），骨小梁数量减少和骨小梁间变大，血清BAP和TRAP含量均上升（P<0.01），SOD含量降低和MAD含量升高（P<0.01），Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白表达水平均显著降低。

褪黑素由大脑松果体合成和分泌并具有昼夜节律性，最初认为在调节睡眠-觉醒的昼夜节律中发挥重要作用。多项研究发现松果体切除术可诱发高转换型骨质疏松^［25］，进一步通过去卵巢动物模型验证了褪黑素的抗骨质疏松作用^［26］，临床随机对照试验显示PMOP患者采用褪黑素治疗1年可增加股骨颈骨密度^［27］。本研究给予褪黑素处理去卵巢快速骨丢失大鼠，观察褪黑素对骨重建和氧化应激相关指标的影响，结果显示与模型对照组比较，褪黑素组骨密度显著升高（P<0.05），骨小梁数量增加和骨小梁间距缩短，血清BAP和TRAP含量均降低（P<0.01），MAD含量降低和SOD含量升高（P<0.01），Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白表达水平均显著增高。这些结果表明褪黑素可降低去卵巢带来的氧化应激损伤。

综上所述，通过去卵巢大鼠实验证明褪黑素可通过激活Nrf2/HO-1信号通路有效缓解过度氧化应激损伤，改善骨重建负平衡以发挥抗骨质疏松作用。未来研究需进一步探讨其对成骨细胞、骨髓间充质干细胞和破骨细胞的具体作用机制。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2022J011313)