miR-194-5p/UBA2在肾透明细胞癌进展中的作用及机制研究

Role and mechanistic study of the miR-194-5p/UBA2 in the progression of clear cell renal cell carcinoma

摘要

目的 探讨miR-194-5p在肾透明细胞癌（Clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）中的表达特征及其对肿瘤细胞发展的影响，并验证miR-194-5p与UBA2之间的靶向调控关系。 方法 实时RT-PCR检测ccRCC组织与正常组织及细胞系中miR-194-5p表达。将miR-194-5p agomir、miR-194-5p antagomir及相应阴性对照转染至786-O与Caki-1细胞，检测UBA2蛋白及mRNA表达变化。通过CCK-8、Transwell、流式细胞术分别评估细胞增殖、迁移/侵袭与凋亡。采用双荧光素酶报告实验验证miR-194-5p与UBA2 3´UTR的直接结合。 结果 miR-194-5p在ccRCC组织及ccRCC细胞系中的表达显著下调；上调miR-194-5p可降低UBA2蛋白及mRNA的表达，并抑制细胞增殖、迁移与侵袭，促进细胞凋亡；双荧光素酶报告提示miR-194-5p可特异性抑制携带UBA2野生型3´UTR的报告活性，而对UBA2 3´UTR 5´-UGUUACA-3´序列的突变型载体无显著抑制。 结论 miR-194-5p可通过直接靶向UBA2的3´UTR从而抑制其表达，进而抑制ccRCC细胞发展。

Abstract

Objective To investigate the expression pattern of miR-194-5p in clear cell renal cell carcinoma （ccRCC） and its effects on malignant biological behaviors of tumor cells， and to validate the targeted regulatory relationship between miR-194-5p and UBA2. Methods The expression of miR-194-5p in ccRCC tissues and cell lines was measured by real time RT-PCR. miR-194-5p agomir， miR-194-5p antagomir and corresponding negative control were transfected into 786-O and Caki-1 cells， and the expression of UBA2 protein and mRNA was detected. Cell proliferation， migration/invasion， and apoptosis were evaluated using CCK-8 assays， transwell assays， and flow cytometry， respectively. A dual-luciferase reporter assay was performed to verify the direct binding between miR-194-5p and the 3´UTR of UBA2. Results miR-194-5p was significantly downregulated in ccRCC tissues and ccRCC cell lines. Up-regulation of miR-194-5p could reduce the expression of UBA2 protein and mRNA， inhibit cell proliferation， migration and invasion， and promote apoptosis. The dual-luciferase reporter assay showed that miR-194-5p specifically suppressed the reporter activity of constructs containing the wild-type UBA2 3´UTR， whereas no significant suppression was observed in UBA2 3´UTR 5´-UGUUACA-3´mutant constructs. Conclusion Restoration of miR-194-5p expression can suppress the malignant biological behaviors of ccRCC cells by directly targeting and inhibiting UBA2.

Graphical abstract

关键词

肾透明细胞癌 / miR-194-5p / UBA2 / 增殖 / 迁移 / 侵袭

Key words

Clear cell renal cell carcinoma / miR-194-5p / UBA2 / Proliferation / Migration / Invasion

肾细胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系统最常见且最具侵袭性的恶性肿瘤之一，其组织学亚型以肾透明细胞癌（Clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）为主，约占全部病例的70%～80%^［1］。尽管近年来影像学分层不断细化，手术技术日益精准，以靶向治疗和免疫治疗为代表的系统治疗策略也取得了显著进展，但仍有20%～40%的患者在3年内出现复发或转移，其5年生存率不到10%^［2］，成为导致治疗失败和患者死亡的主要原因。这一临床困境提示，肾癌发生发展的分子机制，特别是与侵袭、转移相关的关键调控网络，仍有待深入阐明。值得注意的是，近年来研究发现，多种小分子非编码RNA，特别是微小RNA（microRNA，miRNA），在肾癌转移进程中发挥关键调控作用^［3-4］。这些miRNA可能通过调节与上皮-间质转化、血管生成、免疫逃逸及细胞外基质重塑相关的信号通路，影响肿瘤细胞的侵袭能力和远处定植潜能^［5-8］。深入揭示miRNA在肾癌转移中的功能与机制，不仅有助于阐明其复发转移的分子基础，也可能为开发新型生物标志物及靶向治疗策略提供理论依据。

miRNA是一类长度18～25 nt的非编码RNA，主要通过与靶mRNA 3´非翻译区（3´UTR）互补结合，引起mRNA降解或翻译抑制，从而参与肿瘤发生发展过程中的多环节调控^［3］。既往研究表明，miR-194-5p在多种肿瘤中与细胞增殖、迁移/侵袭能力及细胞命运调控相关，且在部分肾癌研究中呈现表达下调趋势，这可能与肿瘤的进展过程密切相关^［9-11］。

UBA2作为SUMO E1激活酶复合体的关键亚基，在SUMO化级联反应起始步骤中发挥核心作用^［12］。前期研究已经证实UBA2在ccRCC中高表达，并且可以促进ccRCC增殖^［13］，然而其上游的潜在调控机制尚不清楚。经过TargetScan的分析，团队找到了一些可能参与UBA2调控的miRNAs，其中与miR-194-5p具有较佳的结合特性。然而，miR-194-5p是否通过直接靶向UBA2并进一步影响ccRCC恶性表型，仍缺乏系统证据支持。

本研究聚焦miR-194-5p在ccRCC中的表达变化及其对UBA2的调控作用，系统评估miR-194-5p表达改变后肾癌细胞的增殖、迁移/侵袭及凋亡变化，以期阐明miR-194-5p/UBA2轴在ccRCC进展中的潜在作用与机制。

1 材料与方法

1.1　临床标本

收集2018年12月至2021年1月在赣南医科大学第一附属医院泌尿外科手术切除并经病理确诊为肾透明细胞癌患者的肿瘤组织及配对癌旁组织共20例。所有患者术前未接受放疗、化疗或靶向/免疫治疗。标本取材后立即液氮速冻并转入-80 ℃保存，相关临床资料同步登记。研究经医院医学伦理委员会批准（伦理编号：临2025-278）并取得患者知情同意。

1.2　免疫组化分析与阳性率统计

肿瘤组织与配对癌旁组织石蜡包埋切片（4 μm）经70 ℃烤片后脱蜡复水。切片用3% H₂O₂室温孵育8～10 min封闭内源性过氧化物酶，随后采用柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）微波抗原修复（间隔10 min重复1～2次），自然冷却后PBS洗涤。室温封闭20 min后加入UBA2一抗（Proteintech，15347-1-AP），4 ℃孵育过夜；次日PBS洗涤后加入HRP标记二抗（中山金桥，PV6000）室温孵育约30 min，并按试剂盒流程进行DAB显色，苏木素复染，脱水透明后用中性树胶封片。阴性对照以PBS替代一抗，其余步骤相同。

在光学显微镜下以200×高倍镜观察切片，避开坏死、出血及褶皱区域；每例标本随机选取≥5个视野拍照。以细胞核出现明确棕黄色颗粒为阳性判定标准，分别计数每个视野UBA2阳性细胞数与总细胞数，计算阳性细胞率（%）=（阳性细胞数/总细胞数）×100%。每例取各视野阳性率的均值作为该样本最终阳性率，由2名观察者在未知分组条件下独立计数，差异较大时复核后达成一致。

1.3　细胞培养

786-O、Caki-1、HK-2及293T细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。细胞置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，培养基按细胞系特性选用RPMI-1640或DMEM并补充10%胎牛血清与1%青链霉素。所有实验均使用对数生长期细胞并定期进行支原体检测。

1.4　miR-194-5p转染与分组

采用TransIntro™ EL Transfection Reagent进行瞬时转染。实验设置miR-194-5p miRNA模拟物的阴性对照组（agomirNC）、miR-194-5p miRNA模拟物组（agomir）、敲低miR-194-5p miRNA的阴性对照组（antagomirNC）、miR-194-5p miRNA敲低组（antagomir）4组。细胞达70%～80%融合度时弃旧培养基，PBS清洗3次后更换血清培养基。将miRNA与转染试剂混匀并室温静置20 min后加入细胞，使miR-194-5p agomir终浓度为100 nmol/L，miR-194-5p antagomir终浓度为150 nmol/L，对应阴性对照保持相同终浓度。转染6 h后更换完全培养基，并在转染48 h后开展实时RT-PCR、Western blot及功能实验。除特别说明外，所有细胞学实验均至少进行3次独立生物学重复；CCK-8每组每时间点设置≥3个技术复孔；实时RT-PCR与双荧光素酶每组设置3个平行孔并取均值用于统计。

1.5　实时RT-PCR检测miR-194-5p与UBA2表达 miRNA提取采用EasyPure^® miRNA Kit，组织经液氮研磨后裂解，细胞PBS清洗后裂解，按试剂盒完成相分离、上柱纯化与洗脱。miR-194-5p与U6分别逆转录并进行实时PCR扩增，采用2^-ΔΔCt法计算相对表达量。miR-194-5p与U6引物序列分别为：miR-194-5p正向特异性引物：5´-GCCGTCTG

TAACAGCAACTCCA-3´；miR-194-5p反向特异性引物：5´-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3´；U6正向特异性引物：5´-GCTTCGGCAGCACATATACT-3´；U6反向特异性引物：5´-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3´。

UBA2检测采用总RNA逆转录后实时PCR扩增，ACTB为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算相对表达量。ACTB与UBA2引物序列分别为：UBA2正向特异性引物：5´-GCAGTTGGCCTTTGTTGAGA-3´；UBA2反向特异性引物：5´-GGGACAACCCAGACAAACAC-3´；ACTB正向特异性引物：5´-GACGTGGACATCCGCAAAG-3´；ACTB反向特异性引物：5´-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3´。

1.6　Western blot检测UBA2蛋白表达

转染48 h后收集细胞，RIPA裂解蛋白并BCA定量，等量上样进行10% SDS-PAGE电泳并转膜至PVDF膜。5% BSA室温封闭2 h后加入UBA2（Proteintech，15347-1-AP）一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次后加入二抗室温孵育1 h，再次洗膜后ECL显色。

1.7　CCK-8检测细胞增殖

786-O与Caki-1细胞接种于96孔板，铺板密度为4 000个细胞/孔（100 μL），按分组完成转染。分别于24、36、48、72、96 h加入10 μL CCK-8工作液，37 ℃孵育100 min后于450 nm测定OD值并绘制增殖曲线。

1.8　Transwell迁移与侵袭

采用24孔Transwell小室进行迁移与侵袭实验，插入膜孔径为8 μm（常用规格）。迁移实验中，转染后细胞消化计数，以无血清培养基重悬后加入上室，每孔2 000个细胞/200 μL，下室加入600 μL含20%FBS完全培养基，37 ℃孵育12 h。孵育结束后PBS清洗2～3次，棉签轻拭去未穿膜细胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%草酸铵结晶紫染色5 min，PBS洗涤后倒置晾干。每孔随机选择不少于10个视野计数穿膜细胞数并取均值。侵袭实验在上室预铺Matrigel，使用无血清且不含双抗培养基按8∶1（培养基∶基质胶）稀释，向上室加入100 μL，37 ℃孵育2 h待凝固后加入细胞（2 000个细胞/200 μL），下室同样加入600 μL含20% FBS完全培养基，37 ℃孵育24 h后固定、染色与计数步骤与迁移实验一致。

1.9　流式细胞术检测凋亡

凋亡检测采用Annexin V-PE/7-AAD双染。转染后用0.125%未含EDTA胰酶消化收集细胞，PBS洗涤计数后取5×10⁵个细胞，300 g、4 ℃离心5 min弃上清，以500 μL 1×Annexin V binding buffer重悬并加入Annexin V-PE与7-AAD，室温避光孵育20 min后立即上机检测。数据分析时先以FSC-A/SSC-A排除碎片，以未染与单染样本完成补偿与象限设定，在Annexin V-PE与7-AAD散点图中判读存活、早期凋亡、晚期凋亡/继发坏死与坏死细胞比例。

1.10　双荧光素酶报告实验

293T细胞接种于24孔板，融合度约70%时进行共转染。分别将含UBA2野生型3´UTR或突变型3´UTR的psiCHECK-2报告质粒Luciferase转录本的TAA终止密码子后的多克隆位点区域，并与miR-194-5p agomir共同转染，每孔质粒用量0.8 μg，miR-194-5p agomir终浓度100 nmol/L。转染24 h后检测荧光素酶活性，每组设置3个复孔并以萤火虫/海肾荧光素酶比值表示相对活性。

1.11　TargetScan网站结合位点预测

访问TargetScan网站：https：//www.targetscan.org/vert_80/。在“Enter a gene symbol”框中，输入基因名UBA2。在“Or enter an mRNA accession number”下方，选择物种Human。点击Submit。导出与UBA2结合的miRNA列表。根据列表中总评分值、总评分值百分数、加权分值以及物种间进化评分值评估UBA2与miR-194-5p结合的强弱。

1.12　统计学处理

计量资料以\overline{x}±s表示。2组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，增殖曲线采用two-way ANOVA分析。采用Pearson相关系数分析UBA2和miR-194-5p表达的相关性。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1　ccRCC组织中miR-194-5p的表达下调

TargetScan数据库结果显示UBA2与miR-194-5p具有较佳的结合特性（表1）。为明确miR-194-5p在ccRCC的表达情况，本研究采集了20例ccRCC组织。实时RT-PCR结果显示，肿瘤组织中miR-194-5p表达水平较配对癌旁组织显著降低（图1A），同时我们还检测了UBA2的mRNA表达水平，提示UBA2在肿瘤组织表达水平高于配对的癌旁组织（图1B）。两者表达水平的相关性分析结果显示，UBA2和miR-194-5p在肿瘤组织中的表达呈负相关（R²=0.314 9，图1C）。这20例样本的组织学检测验证了UBA2在肿瘤组织表达高于癌旁组织（图1D），肿瘤组织的UBA2阳性率为86.7%，远高于癌旁组织的28.3%（图1E）。

2.2　miR-194-5p可负向调控ccRCC细胞中UBA2表达

本研究检测了常见的肾小管上皮细胞HK-2和常见的肾透明细胞癌患者来源的786-O与Caki-1细胞中miR-194-5p的表达情况。实时RT-PCR结果显示癌细胞的miR-194-5p的表达水平亦明显低于HK-2细胞（图2A）。在此基础上，为明确miR-194-5p是否调控UBA2，在786-O与Caki-1细胞中分别转染miR-194-5p agomir、antagomir及相应阴性对照。实时RT-PCR结果显示，与agomirNC组相比，agomir组可显著降低UBA2转录水平；而与antagomirNC组相比，antagomir组UBA2转录水平无明显变化（图2B～2C）。Western blot结果显示，与agomirNC组相比，agomir组UBA2蛋白下降；与antagomirNC组相比，antagomir组UBA2蛋白无明显变化（图2D）。我们推测，可能是由于786-O和Caki-1细胞内源性表达的miR-194-5p量不高，从而导致antagomir发挥的阻断效应有限。上述结果表明miR-194-5p对UBA2转录与蛋白层面都存在稳定负向调控。

2.3　miR-194-5p抑制ccRCC细胞增殖并降低迁移/侵袭能力

鉴于antagomir的效果不如预期，后续实验主要采用miR-194-5p mRNA模拟物组（agomir）进行验证实验。与阴性对照组相比，miR-194-5p agomir组的786-O和Caki-1细胞在培养48、72、96 h均表现为增殖能力显著下降（P均<0.05）（图3A）。

此外，Transwell实验结果显示，miR-194-5p上调显著减少2种细胞株的迁移穿膜细胞数（图3B）；在Matrigel预包被条件下，同样观察到相比于agomirNC组，agomir组侵袭穿膜细胞数显著减少（图3C）。上调miR-194-5p的水平可使细胞迁移与侵袭能力相应减弱，提示miR-194-5p的抑癌作用可延伸至肿瘤运动与侵袭过程。上述结果表明miR-194-5p对转移相关表型也具有稳定的抑制效应。

2.4　miR-194-5p促进ccRCC细胞凋亡

前期研究提示UBA2在抑制ccRCC细胞凋亡中发挥重要作用^［13］。CCK-8结果显示，miR-194-5p能够削弱肿瘤细胞生存优势。Annexin V-PE/7-AAD流式细胞术结果显示，miR-194-5p上调后2种细胞株总凋亡率显著升高，提示miR-194-5p可通过促进凋亡过程进一步抑制肿瘤细胞扩增（图4）。

2.5　双荧光素酶报告实验验证miR-194-5p可直接靶向UBA2 3´UTR

通过TargetScan预测结果可见，miR-194-5p可与UBA2 mRNA的3´UTR 5´-UGUUACA-3´片段存在结合关系。为从因果层面验证两者是否存在直接靶向关系，将UBA2 3´UTR野生型（WT）与突变型（MUT）序列的荧光素酶报告载体psiCHECK2（图5A）与miR-194-5p agomir在293T细胞中共转染。结果显示，与单转染野生型质粒相比，agomir可显著降低荧光素酶活性（P<0.01）。与之对应的是，当结合位点突变后，agomir抑制效应明显减弱，2组差异无统计学意义（图5B），提示miR-194-5p可与UBA2 mRNA 3´UTR发生直接结合并抑制其表达，两者结合的关键序列可能为5´-UGUUACA-3´。

3 讨论

RCC是一种典型的肾脏恶性肿瘤，约占所有恶性肿瘤的3%，复发率高，死亡率超过40%^［14-15］。ccRCC是最常见的肾脏恶性肿瘤，约占所有肾脏恶性肿瘤的90%^［1］。随着腹腔镜和机器人手术系统的普及，生物反应调节剂已应用于转移性RCC患者。然而，晚期癌症的预后仍然很差，5年生存率为5%～10%^［16］。因此，亟须探索ccRCC早期诊断标志物与治疗新靶点。miR-194-5p作为一类短链非编码RNA，参与调控多种肿瘤细胞的凋亡、侵袭和转移，但其在ccRCC中的作用机制尚不明确。因此，本研究聚焦于miR-194-5p在肾透明细胞癌中的表达模式及其对UBA2的靶向调控机制，探讨miR-194-5p作为潜在生物标志物的临床应用前景及其在肿瘤免疫微环境中的作用机制，以期为ccRCC诊疗提供新思路。

本研究首先在组织样本和细胞模型中验证miR-194-5p和UBA2的表达情况。结果显示，miR-194-5p在ccRCC组织及细胞系中均显著低表达，提示其可能作为抑癌miRNA参与肿瘤发生发展^［9-11］。这与Wang Y等^［17］和Wang M^［18］等研究结果一致，他们发现miR-194-5p在消化系统肿瘤中低表达并与不良预后相关。基于此表达特征，我们进一步在功能层面验证了恢复miR-194-5p表达可显著抑制ccRCC细胞的恶性行为，进一步支持其作为潜在抑癌分子的生物学基础。

在机制层面，通过agomir与antagomir干预实验，证实miR-194-5p可负向调控UBA2在mRNA和蛋白水平的表达。进一步利用双荧光素酶报告基因系统，证实miR-194-5p通过结合UBA2 3´UTR的特定位点直接抑制其表达。此外，功能实验表明，恢复miR-194-5p表达可显著抑制ccRCC细胞的增殖能力，并诱导细胞凋亡，提示其可通过调控细胞存活与死亡平衡抑制肿瘤生长。同时，迁移与侵袭实验也显示其可显著抑制细胞的运动与侵袭能力，表明miR-194-5p在调控肿瘤生长与转移2个关键恶性表型中均发挥重要作用。值得注意的是，UBA2作为SUMO化修饰途径中E1激活酶的关键亚基，其表达异常可能通过影响全局SUMO化水平，进而干扰包括凋亡调控、上皮-间质转化等在内的多条信号通路^［19-21］。本研究观察到的“miR-194-5p上调—UBA2下调—抑癌表型”的一致性变化，提示miR-194-5p/UBA2轴可能作为连接miRNA调控与蛋白质SUMO化修饰的重要分子桥梁，在ccRCC进展中具有枢纽性作用。

尽管本研究初步建立了miR-194-5p/UBA2调控轴，并揭示了其在ccRCC中的抑癌功能，但仍存在可进一步深化的方向：⑴在机制闭环验证方面，需进一步确立UBA2在介导miR-194-5p功能中的必要性，例如在miR-194-5p过表达背景下，外源性表达不携带3´UTR的UBA2编码区，观察其是否可逆转miR-194-5p诱导的抑癌表型；同时，可结合UBA2敲低实验，模拟miR-194-5p过表达的表型，从而增强机制链条的完整性。⑵在信号通路层面，未来可进一步探讨UBA2下调所影响的SUMO化下游底物及其介导的信号网络，特别是与凋亡执行、EMT进程等相关的关键蛋白及其修饰状态，从而构建从miRNA调控到蛋白质修饰再到表型输出的完整信号轴。⑶开展体内动物模型实验，验证该轴在肿瘤生长、转移及微环境调控中的作用，将具有重要转化意义。

综上所述，本研究系统阐明了miR-194-5p在ccRCC中作为抑癌miRNA的功能，并初步揭示其通过靶向UBA2抑制肿瘤恶性进展的分子机制，为ccRCC的分子靶向治疗提供了新的潜在靶点与实验依据。

4 结论

miR-194-5p在肾透明细胞癌组织与细胞系中显著低表达。恢复miR-194-5p表达可降低UBA2水平，并抑制肾癌细胞增殖、迁移与侵袭，促进细胞凋亡。双荧光素酶报告证实miR-194-5p可直接靶向UBA2 3´UTR并发挥转录后抑制作用，表明miR-194-5p可通过直接靶向UBA2的3´UTR从而抑制其表达，进而抑制ccRCC细胞的发展。

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基金资助

江西省主要学科学术和技术带头人培养计划领军人才项目(20213BCJL22038)