笔管草醇提物防治高脂血症的潜在药效物质及机制研究

Investigation of the bioactive constituents and anti-hyperlipidemic mechanisms of Equisetum debile Roxb. ethanol extract

摘要

目的 明确笔管草醇提物（Ethanol extract of Equisetum debile Roxb.，EED）防治高脂血症的核心药效成分，揭示其“成分-靶点-通路”的作用机制，为笔管草防治高脂血症的临床应用与新药研发提供科学依据。 方法 采用油酸诱导HepG2细胞建立脂质蓄积模型，通过油红O染色验证EED的降脂活性；运用超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱结合PubChem、TCMSP等在线数据库，系统鉴定EED灌胃给药后的大鼠入血成分及代谢产物；借助Swiss Target Prediction数据库筛选入血成分与高脂血症的交集靶点，利用STRING平台构建靶点蛋白互作网络，通过DAVID数据库进行KEGG信号通路富集分析；采用AutoDock Vina软件进行分子对接，结合PyMOL可视化分析潜在活性成分与关键靶点的结合模式及亲和力；为了进一步验证EED对关键基因表达的调控作用，采用RT-qPCR技术检测HepG2细胞在给药前后STAT3、HSP90AA1、EGFR、PTGS2及ESR1等基因的mRNA水平变化。 结果 EED可浓度依赖性降低油酸诱导的HepG2细胞内TG含量及脂质堆积（P<0.05）；从大鼠血清中初步鉴定出EED的17个主要入血成分，包括柚皮素、山奈酚等黄酮类成分；网络药理学分析显示，EED核心入血成分柚皮素、山奈酚、金合欢素、槲皮素等可共同作用于STAT3、AKT1、EGFR、HSP90AA1等31个高脂血症相关核心靶点；KEGG富集分析提示上述靶点主要富集于脂质与动脉粥样硬化通路等15条核心通路；分子对接结果证实，PTGS2与棉花素、PTGS2与山奈酚、PTGS2与甘草素，以及ESR1与甘草素的结合自由能均低于-9.0 kcal/mol，结合模式稳定；RT-qPCR检测结果显示，模型组中STAT3、HSP90AA1、EGFR、PTGS2基因的mRNA表达水平上调，而ESR1基因的mRNA表达下调，EED干预后可逆转上述基因的表达异常。 结论 EED通过“黄酮类成分集群-核心靶点-脂代谢相关通路”发挥防治高脂血症功效，其核心药效物质为甘草素、山奈酚、棉花素等黄酮类成分，脂质与动脉粥样硬化信号通路可能是其关键作用通路。

Abstract

Objective : To identify the core active constituents of the ethanol extract of （Ethanol extract of Equisetum debile Roxb.，EED） responsible for its therapeutic effects against hyperlipidemia， and to elucidate its mechanism of action via the "constituents-targets-pathways" axis， thereby providing a scientific basis for its clinical application and new drug development. Methods An in vitro model of lipid accumulation was established using oleic acid-induced HepG2 cells. The lipid-lowering efficacy of EED was verified via Oil Red O staining. Systemic identification of the absorbed constituents and metabolites of EED in rat serum following oral administration was performed using UPLC-Q-TOF-MS/MS， assisted by online databases including PubChem and TCMSP. Potential targets of these serum constituents related to hyperlipidemia were screened using the Swiss Target Prediction database. A protein-protein interaction （PPI） network was constructed using the STRING platform， and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis was conducted via the DAVID database. Molecular docking was performed using AutoDock Vina， and the binding modes and affinities between potential active constituents and key targets were visualized and analyzed with PyMOL. To further verify the regulatory effect of EED on the expression of key genes， the RT-qPCR technique was used to detect the changes in the mRNA levels of genes such as STAT3， HSP90AA1， EGFR， PTGS2， and ESR1 in HepG2 cells before and after drug administration. Results EED concentration-dependently reduced both intracellular TG content and lipid droplet accumulation in oleic acid-induced HepG2 cells （P<0.05）. Seventeen major absorbed constituents， primarily flavonoids such as naringenin and kaempferol， were identified in rat serum. Network pharmacology analysis revealed that 31 core hyperlipidemia-related targets， including STAT3， AKT1， EGFR， and HSP90AA1， were commonly modulated by key serum constituents like naringenin， kaempferol， acacetin， and quercetin. KEGG enrichment analysis indicated that these targets were significantly enriched in 15 core pathways， predominantly the Lipid and Atherosclerosis signaling pathway. Molecular docking confirmed strong binding affinities， with binding free energies below -9.0 kcal/mol for the complexes of PTGS2 with acacetin， PTGS2 with kaempferol， PTGS2 with liquiritigenin， and ESR1 with liquiritigenin， indicating stable binding modes. RT-qPCR detection results showed that the mRNA expression levels of STAT3， HSP90AA1， EGFR， and PTGS2 genes were significantly increased in the model group， while the expression of the ESR1 gene was significantly decreased. After EED intervention， the expression changes of these genes were all reversed. Conclusion EED exerts its anti-hyperlipidemic effect through the synergistic interactions of a "flavonoid cluster-core targets-lipid metabolism-related pathways" network. The core pharmacodynamic substances are flavonoids， including liquiritigenin， kaempferol， and acacetin， with the PTGS2 and ESR1 signaling pathways potentially serving as critical mechanistic routes.

Graphical abstract

关键词

笔管草 / 高脂血症 / 液质联用 / 网络药理学 / 药效物质基础

Key words

Equisetum debile Roxb. / Hyperlipidemia / Liquid chromatography-mass spectrometry / Network pharmacology / Pharmacodynamic material basis

高脂血症是指血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平异常升高，或高密度脂蛋白胆固醇水平降低的代谢性疾病，其本质是脂质代谢网络紊乱，导致血脂稳态失衡^［1］。作为动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病的独立危险因素，高脂血症的患病率随居民饮食结构西化及生活方式改变呈逐年上升趋势，且发病群体逐渐年轻化，已成为威胁我国居民健康的重大公共卫生问题^［2］。

目前临床治疗高脂血症的一线药物以他汀类为主，辅以贝特类药物、胆固醇吸收抑制剂等，但长期使用易引发肌肉疼痛、肝酶升高、胃肠道不适等不良反应，部分患者还可能出现药物抵抗现象^［3］。因此，从天然植物中筛选高效、低毒的降脂活性成分，已成为高脂血症防治研究的热点方向。中医药在代谢性疾病治疗中具有“整体调节、多效协同”的独特优势，深入挖掘其药效物质基础并系统解析作用机制，对推动中药现代化具有重要意义。

笔管草（Equisetum debile Roxb.）为木贼科木贼属多年生蕨类植物，广泛分布于我国南方各省、东南亚及印度半岛，其药用历史可追溯至《本草拾遗》，该书记载其能“主目疾，退翳，清热止血，利尿通淋”^［4］。现代药理学研究证实，笔管草含黄酮、皂苷、酚酸等多种活性成分，具有抗氧化、抗菌及调脂作用^［5-7］，但其发挥降脂功效的关键物质基础，尤其是口服后吸收入血的活性成分、核心作用靶点及具体调控机制尚未明确。

中药口服后吸收入血的化学成分及代谢产物，是其发挥体内药效的核心物质基础^［8］。网络药理学基于系统生物学理论，可快速构建“药物成分-疾病靶点-信号通路”的关联网络，契合中药“多成分、多靶点”的作用特点，为解析中药复方及提取物的药效机制提供了高效工具^［9］。因此，本研究以笔管草醇提物（Ethanol extract of Equisetum debile Roxb.，EED）为研究对象，结合细胞药效学、液质联用技术、网络药理学及分子对接方法，筛选其防治高脂血症的核心入血成分，预测并验证关键作用靶点及信号通路，旨在揭示笔管草调脂作用的药效物质基础与分子机制、为开发新型降脂中药制剂提供实验依据。

1 材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1　药品与试剂

笔管草（安徽亳州福堂药业有限公司，货号：056465），经赣南医科大学药学院黄浩教授鉴定，为笔管草正品药材；MEM基础培养基（货号：PM153410）、PBS（货号：PB180327）均购自武汉普诺赛生物科技有限公司；油红O粉末（货号：O8010）、DMSO（货号：D8371）、肝素钠粉末（货号：H8060-1）均购自北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇（西陇科学股份有限公司，货号：1030001）；油酸（货号：O815206）、异丙醇（货号：I811932-1L）均购自上海麦克林生化科技股份有限公司；牛血清白蛋白（上海碧云天生物技术股份有限公司，货号：ST023）。

1.1.2　仪器

多功能粉碎机（永康铂欧五金厂，型号：BO500Y）；台式低速自动平衡离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号：L420-A）；倒置荧光显微镜（德国，Leica公司，型号：A7-356）；-80 ℃超低温冰箱（型号：ULT2186-6-W44）、多功能酶标仪（型号：VARIOS KAN LHX）、超微量核酸蛋白分析仪（型号：NanoDrop One）、荧光定量PCR仪（型号：Quant Studio^TM 7 Flex）均购自美国Thermo scientific公司；台式冷冻干燥机（湖南湘仪博医康科技有限公司，型号：TFD-1C-95+）；基因扩增仪（美国，Bio-Rad，型号：621BR88051）；台式高速冷冻离心机（德国，Eppendorf，型号：5424 R）。

1.1.3　细胞与动物

HepG2细胞（武汉普诺赛生物科技有限公司），培养基为：MEM+10%胎牛血清（FBS）+1%青霉素-链霉素双抗溶液（P/S）。将细胞置于37 ℃培养箱中，在5% CO₂环境下培养。

200~220 g雄性SD大鼠购自江苏华创信诺医药科技有限公司（许可证：SCXK苏：2020-0009），饲养于赣南医科大学实验动物中心。研究过程开展的动物实验经赣南医科大学医学伦理委员会审核通过（2022188）。

1.2　方法

1.2.1　笔管草提取物的制备

取干燥笔管草药材，去除杂质后粉碎，过40目筛，得到笔管草粉末。精密称取粉末200 g于锥形瓶中，加入70%的乙醇水溶液2 L，经超声提取（40 ℃，200 W，40 kHz）1 h，过滤收集滤液；药渣以相同条件重复提取1次，合并滤液。滤液减压浓缩至无醇味，得浓缩液。浓缩液于-80 ℃预冻24 h后冷冻干燥48 h得到EED，密封避光保存备用。

1.2.2　体外实验

1.2.2.1　细胞培养

HepG2细胞使用含10%胎牛血清的MEM培养基，于37 ℃、5% CO₂条件下的恒温培养箱中培养。细胞呈贴壁生长，形态为上皮样岛状集落，隔日观察并传代。

1.2.2.2　细胞接种

取对数生长期的HepG2细胞，稀释成密度为1×10⁴个/mL的细胞悬液，按每孔100 μL接种于96孔板中，置于培养箱中培养24 h备用。

1.2.2.3　油酸（Oleic acid，OA）储备液制备

用100 mmol/L NaOH溶液配制40 mmol/L OA溶液，于80 ℃水浴皂化40 min。皂化后与等体积40%牛血清白蛋白（BSA）溶液混匀，于55 ℃振荡孵育1 h形成OA-BSA复合物。冷却后经0.22 μm滤膜过滤除菌，即得OA工作液。使用时以MEM培养基稀释至终浓度1 mmol/L。

1.2.2.4　分组及给药处理

培养24 h后，将细胞分为对照组、模型组、阿托伐他汀组、低剂量EED组和高剂量EED组。对照组加入等体积基础培养液；模型组加入含1 mmol/L OA的培养液；阿托伐他汀组在模型组基础上加入浓度为10 μmol/L的阿托伐他汀；低剂量EED组在模型组基础上加入浓度为5 μg/mL的EED培养液；高剂量EED组在模型组基础上加入浓度为50 μg/mL的EED培养液。

1.2.2.5　油红O染色

HepG2细胞按1.2.2.4分组给药12 h后，PBS清洗，加入细胞固定液固定30 min。以油红O染料（超纯水∶油红O储存液=2∶3）染色20 min，75%乙醇快速分化，去离子水清洗。每孔加入50 μL DMSO孵育10 min，于490 nm处测定吸光度。

1.2.3　大鼠血浆样品制备

将SD大鼠分为对照组和给药组。给药组连续3 d每天灌胃500 mg/kg笔管草提取物水溶液，给药浓度为200 mg/mL，对照组灌胃等体积超纯水，末次给药前禁食12 h，给药后1.5 h眼眶取血，4 ℃ 850 ×g离心5 min，取血浆。血浆与甲醇按1∶2比例混合，混匀后4 ℃下15 000 ×g离心15 min，收集上清，冷冻干燥后以50%甲醇复溶，15 000 ×g离心10 min，取上清液进行UHPLC-MS/MS分析。

1.2.4　检测方法

1.2.4.1　色谱条件

采用超高效液相色谱系统（UPLC）。色谱柱为C₁₈柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱：0～2 min（5% B），2～8 min（5%→25% B），8～15 min（25%→65% B），15~22 min（65%→95% B），22～30 min（95%→100% B）。流速0.3 mL/min，柱温40 ℃，进样量1 μL。

1.2.4.2　质谱条件

采用电喷雾离子化源（ESI）进行检测，在正、负离子模式下扫描。质荷比（m/z）扫描范围100～1 700。

1.2.5　笔管草治疗高脂血症网络药理学分析

1.2.5.1　笔管草提取物入血成分靶点筛选

通过PubChem数据库获取已鉴定入血成分的SMILES结构及CAS号，利用Swiss Target Prediction平台进行靶点预测，所得靶点经UniProt数据库标准化基因名称。以“Hyperlipidemia”为关键词在GeneCards数据库中进行检索，选取relevance score>10的靶点，剔除重复后获得疾病相关靶点。借助微生信平台将疾病靶点和入血成分预测靶点取交集，并绘制韦恩图，得到笔管草治疗高脂血症的潜在靶点。

1.2.5.2　蛋白质互作网络（Protein-protein interaction network，PPI）构建及核心靶点筛选

将潜在靶点导入STRING数据库，设置物种为“Homo sapiens”，置信度评分阈值>0.7，隐藏无相互作用的孤立节点，最终得到PPI网络原始数据，将数据导入Cytoscape 3.10.0软件进行可视化处理。借助软件内置的CytoHubba插件，采用最大团中心度算法分析网络节点的拓扑属性，筛选出网络中的核心靶点。

1.2.5.3　GO功能及KEGG通路富集分析

将1.2.5.2项下筛选获得的核心靶点列表上传至微生信平台，使用其集成的GO富集分析模块，设定物种为“Homo sapiens”。从生物学过程（Biological process， BP）、分子功能（Molecular function， MF）和细胞组分（Cellular component， CC）3个层面进行解析。重点关注与脂质代谢调控相关的GO条目，富集结果以条形图展示排名前15的条目。利用同一平台的KEGG通路富集分析模块，对上述靶点进行通路注释与富集分析，物种同样设定为“Homo sapiens”，以P<0.01作为显著性筛选标准，重点关注与高脂血症病理生理密切相关的通路。富集分析结果以气泡图形式呈现，其中气泡大小代表富集基因数量，颜色深度代表富集显著性水平。

1.2.5.4　笔管草活性成分-靶点-通路关系分析

选取活性成分、核心靶点和KEGG富集分析得到的前15条信号通路，利用Cytoscape 3.10.0软件构建“活性成分-核心靶点-通路”相互作用网络图，对网络进行拓扑分析，依据Degree值的大小，分析得到核心活性成分。

1.2.5.5　笔管草活性成分分子对接

基于前期网络拓扑分析，挑选Degree排名前列的核心靶点（PTGS2和ESR1，对应PDB编号5F19和1XPC）与笔管草中的关键活性成分进行分子对接验证。从RCSB PDB数据库获取核心靶点的晶体结构，使用PyMOL 2.5.2软件去除水分子、原配体并进行加氢处理；从PubChem数据库获取活性成分的三维结构，采用AutoDock Tools进行力场分配和电荷优化。在AutoDock 1.5.7软件中，以靶蛋白的活性口袋为中心设置对接网格，采用拉马克遗传算法进行半柔性分子对接计算。以结合能≤-5.0 kcal/mol作为有效结合筛选标准，选取最优构象，最终通过PyMOL 2.5.2可视化分析氢键、疏水作用等关键分子相互作用，从而在原子水平验证活性成分与核心靶点的结合能力与作用机制。

1.2.6　RT-qPCR检测HepG2细胞中mRNA表达水平

1.2.6.1　HepG2细胞RNA提取及cDNA合成

取对数生长期的HepG2细胞，稀释成密度为1×10⁴个/mL的细胞悬液，按每孔2 mL接种于6孔板中。依照1.2.2.2方法造模给药12 h后，弃去培养液，用1×PBS清洗1次，每孔加入RNAiso Plus 1 mL裂解细胞，收集裂解液至1.5 mL离心管中，充分吹打混匀。加入200 μL氯仿，剧烈振荡混匀后室温静置5 min，于4 ℃、12 000 ×g离心15 min。吸取上层无色水相至新离心管，加入800 μL异丙醇混匀，室温静置10 min，于4 ℃、12 000 ×g离心10 min，弃去上清。沉淀用75%乙醇清洗1次，4 ℃、7 500 ×g离心5 min后弃去上清，晾干后加入适量RNase-free H₂O溶解。使用超微量核酸蛋白分析仪对提取的RNA进行质量检测以及测定RNA浓度。目的基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

RNA质量与浓度符合要求后，使用PrimeScript FAST RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录。

1.2.6.2　RT-qPCR检测

采用TB Green 嵌合荧光法进行实时荧光定量。所需荧光定量PCR反应体系为10 μL：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ Fast qPCR（2×）试剂5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，RNase-free H₂O补足至10 μL。扩增程序为：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 10 s，40个循环。熔解曲线的温度设置为65～95 ℃。

1.3　统计学处理

使用GraphPad Prism 10.0软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），采用Tukey事后检验进行组间比较。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1　EED抑制HepG2细胞脂滴积累

为探究EED对肝细胞内脂质积累的影响，采用油红O染色法对HepG2细胞内脂滴进行可视化及定量分析，油红O染色显微成像结果如图1所示。对照组HepG2细胞形态正常，胞质分布均匀；模型组细胞内出现大量红色脂滴，染色信号显著增强，脂滴的数量及体积显著增加，提示脂质积累模型构建成功；阿托伐他汀组细胞内脂滴染色信号较模型组明显减弱，脂滴积累水平显著降低，验证了实验体系的可靠性；EED组呈现浓度依赖性的脂滴减少效应，低剂量EED组细胞内仍可见部分脂滴，但数量及染色强度已较模型组降低；高剂量EED组细胞脂滴积累进一步减少，染色信号更接近阳性对照组。

为进一步量化EED的降脂活性，将染色后的细胞进行洗脱处理，通过多功能酶标仪检测490 nm波长下的吸光度值并进行统计学分析。结果显示（图2），模型组吸光度值显著高于对照组（P<0.01），证实模型组细胞脂积累水平显著升高；与模型组相比，阿托伐他汀组及EED高剂量组的吸光度值均显著降低（P<0.05），且EED高剂量组吸光度值低于EED低剂量组，表明EED在细胞水平具有明确的降脂活性，可浓度依赖性地抑制HepG2细胞内的脂滴积累。

2.2　EED的UPLC-MS/MS入血成分

为明确EED经口服给药后的体内代谢入血成分（即潜在药效物质基础），本研究采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术，对灌胃给予EED后的大鼠血浆样品进行分析。首先获取血浆样品的总离子流色谱图，提取各色谱峰对应的保留时间、质荷比及特征碎片离子等质谱信息，随后将这些信息与EED相关文献报道的化学成分数据，以及PubChem、MassBank等在线化学数据库进行匹配比对，最终初步鉴定出17个主要入血成分（附表1见中国知网本文增强出版附加材料）。根据结构类型分类，上述入血成分涵盖3类：黄酮类化合物10个，包括黄烷酮、芹菜素、2-苯基色原酮、柚皮素、甘草素、金合欢素、山柰酚、草质素、槲皮素及棉花素，为EED入血成分中的优势类别；生物碱类化合物5个，包括一叶萩碱、氧化槐果碱、槐果碱、苦参碱及长春布宁；酚酸类化合物2个，为半紫黄质与去甲氧基姜黄素。

2.3　网络药理学

2.3.1　EED入血成分与高脂血症的交集靶点

为解析EED发挥抗高脂血症作用的潜在分子靶点，本研究采用网络药理学策略开展靶点映射分析。首先从EED入血成分中筛选得到活性入血成分，基于TCMSP数据库及SwissTargetPrediction在线工具预测其潜在作用靶点，共获得534个成分相关靶点；随后通过GeneCards数据库检索高脂血症对应的疾病关联靶点，共获取3 309个高脂血症相关靶点；进一步利用Venny工具对成分靶点与疾病靶点进行交集分析并绘制韦恩图（图3）。结果显示，成分靶点与疾病靶点共有181个交集靶点（占两者总并集靶点数的4.9%），其中成分专属靶点353个，疾病专属靶点3 128个。上述交集靶点是EED入血活性成分参与调控高脂血症发生发展的潜在作用节点，为后续构建“成分-靶点-疾病”相互作用网络、挖掘核心作用靶点及解析其抗高脂血症的分子机制提供了关键数据支撑。

2.3.2　PPI网络构建及核心靶点筛选

为挖掘EED入血活性成分调控高脂血症的核心作用靶点，本研究将前期获得的成分-疾病交集靶点导入String数据库（物种限定为Homo sapiens，蛋白互作置信度阈值设置为≥0.7），获取靶点对应PPI关系数据；随后利用Cytoscape软件对该互作关系进行可视化构建，得到EED抗高脂血症的PPI网络（图4）。

在该PPI网络中，节点代表靶点蛋白，连线代表蛋白间的相互作用关系，节点的大小与颜色由degree值（即靶点的连接度）决定，degree值越大，对应节点的尺寸越大、颜色越深，提示其在网络中的核心调控地位越高。基于degree值的筛选结果显示，该网络中的核心靶点包括STAT3、EGFR、AKT1、HSP90AA1、TNF、ESR1、BCL2、CASP3、PTGS2、PIK3CA等。上述核心靶点多参与脂质代谢紊乱、炎症应答、细胞增殖/凋亡调控等高脂血症发生发展的关键生物学过程，据此推测，这些靶点是EED发挥抗高脂血症作用的关键分子节点。

2.3.3　功能与通路富集分析

为解析EED入血活性成分核心靶点参与的生物学调控维度，本研究将核心靶点导入DAVID数据库，开展GO功能富集分析与KEGG信号通路富集分析。其中GO功能富集分析以-LogP值为筛选依据，选取前10个显著条目进行可视化展示（图5），结果从细胞组分（Cellular component，CC）、生物学过程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）3个层面明确了靶点的功能特征：在BP维度，核心靶点主要富集于胆固醇稳态、炎症反应、ERK1/ERK2级联正调控及氧化应激反应等过程，而这些过程正是高脂血症中脂质代谢紊乱、炎症损伤及氧化失衡的核心病理环节；在CC维度，靶点集中分布于细胞囊泡腔、细胞表面、受体复合物等亚细胞结构，为其参与细胞信号转导与分子互作提供了空间基础；在MF维度，靶点则富集于阳离子通道活性、核受体活性、ATP结合等功能，直接关联脂质代谢调控、信号分子识别及能量代谢等关键生物学过程。

在此基础上，KEGG信号通路富集分析共得到15条显著相关通路（图6），涵盖癌症相关通路、脂质与动脉粥样硬化通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、胰岛素抵抗通路等，其中脂质与动脉粥样硬化通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、胰岛素抵抗通路均是高脂血症及其心血管并发症的核心病理调控通路。上述结果提示，EED入血活性成分的核心靶点可通过调控脂质代谢稳态、炎症应答、氧化应激等多重生物学功能，同时干预多条高脂血症相关信号通路，从而多维度发挥抗高脂血症的作用。

2.3.4　成分-靶点-疾病靶标关联网络构建

为直观解析EED入血活性成分、核心靶点与高脂血症之间的相互作用关系，本研究利用Cytoscape 3.10.0软件构建“入血成分-核心靶点-疾病通路”关联网络（图7）。在该网络中，不同类型节点分别对应EED入血活性成分、核心靶点及高脂血症相关信号通路，节点间的连线则代表各要素之间的直接相互作用关系。

从网络拓扑结构可见，EED中的主要入血成分，如芹菜素、金合欢素、山奈酚等黄酮类化合物，一叶萩碱等生物碱类成分作为核心成分节点，可同时与多个核心靶点，如EGFR、AKT1、STAT3、TNF等形成连接；而每个核心靶点又进一步关联多条高脂血症相关信号通路，如脂质与动脉粥样硬化通路、胰岛素抵抗通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路等。网络分析结果显示，EED的活性成分呈现“一成分对应多靶点”的特征，而核心靶点则呈现“一靶点调控多通路”的特征，这种多向交互关系清晰呈现了EED作为天然药物复杂体系的作用模式。上述关联网络明确了EED发挥抗高脂血症作用的“物质-靶点-通路”调控网络，证实其是通过“多成分、多靶点、多通路”的整合效应，实现对高脂血症病理过程的综合干预，这也体现了天然药物发挥药效的典型特征。

2.3.5　分子对接验证

为从分子层面明确EED入血活性成分与核心靶点的结合亲和力及潜在作用模式，本研究采用分子对接技术，选取EED核心入血成分与高脂血症关键靶点进行对接分析，以结合能为核心指标，通常结合能≤-5.0 kcal/mol提示存在结合活性，结合能≤-9.0 kcal/mol提示结合模式更稳定。结合能热力图如图8所示，EED中的核心入血成分，甘草素、棉花素、山奈酚与关键靶点PTGS2、ESR1表现出较强的结合活性：三者与PTGS2、ESR1的结合能均低于-9.0 kcal/mol，其中甘草素与ESR1、PTGS2的结合能为-9.2 kcal/mol，棉花素与PTGS2的结合能为-9.9 kcal/mol，山奈酚与PTGS2的结合能为-9.2 kcal/mol，提示这些成分与靶点间具有较高的结合亲和力，结合模式稳定。

分子对接可视化结果（图9）进一步解析了成分-靶点的具体相互作用机制，PTGS2与棉花素对接时（图9A），通过GLU-465、HIS-39等氨基酸残基形成氢键；PTGS2与山奈酚对接（图9B）过程中，TRP-323、GLN-461等残基参与氢键构建；PTGS2与甘草素（图9C）、ESR1与甘草素（图9D）对接时，也分别通过TYR-130、GLY-521等残基形成多个氢键及疏水相互作用，这些分子间相互作用是维持成分-靶点稳定结合的关键结构基础。上述分子对接结果从原子层面证实了EED核心入血成分与PTGS2、ESR1等关键靶点的特异性结合能力，为明确EED抗高脂血症的物质基础及作用靶点提供了直接的分子证据。

2.4　EED对HepG2细胞表达的影响

如图10所示，与对照组比较，模型组HepG2细胞STAT3、HSP90AA1、EGFR、PTGS2的mRNA表达上调，ESR1的mRNA表达下调（P均<0.05）；与模型组比较，EED组干预后HepG2细胞STAT3、HSP90AA1、EGFR、PTGS2的mRNA表达均下调，低剂量EED组ESR1的mRNA表达上升（P均<0.05）。

3 讨论

高脂血症作为动脉粥样硬化及相关心脑血管疾病的核心诱因，其病理机制复杂，天然药物因“多成分-多靶点”特性成为降脂药物研发的重要方向^［10］。然而目前对笔管草降脂活性的研究多停留在粗提物层面，其体内发挥药效的关键物质基础尚不明确。本研究通过UPLC-MS/MS技术首次系统鉴定出笔管草提取物EED口服后入血的17种活性成分，涵盖黄酮类10个、生物碱类5个及酚酸类2个，其中芹菜素、山奈酚、一叶萩碱等为主要入血成分。结合网络药理学靶点分析，进一步筛选出EED与高脂血症的181个交集靶点，构建了首个笔管草“入血成分-疾病靶点”关联基础，这一发现为笔管草体内药效物质研究提供了参考。

PPI网络分析筛选出的STAT3、AKT1、ESR1、EGFR等核心靶点，揭示了笔管草干预高脂血症的多靶点作用模式。STAT3是连接代谢紊乱与多种疾病进程的重要分子枢纽，通过协调细胞质、细胞核和线粒体之间的信号通路，在高脂血症等代谢性疾病中发挥核心的代谢调控作用，并可能参与相关病理进展^［11］。ESR1在调节全身葡萄糖稳态和胰岛素敏感性中发挥重要作用^［12］。EGFR磷酸化可以促进TG、胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的合成，而AKT1介导的PI3K-Akt通路是脂质代谢与葡萄糖稳态的核心调控枢纽^［13-14］。本研究发现这些靶点在笔管草作用体系中形成协同调控网络。KEGG通路富集结果进一步显示，核心靶点集中于脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化、PI3K-Akt等关键通路。笔管草对PI3K-Akt通路的激活作用，不仅能改善胰岛素敏感性以平衡肝脏脂质代谢，更可通过恢复细胞噬脂功能逆转泡沫细胞形成^［15-16］。这种“多靶点协同干预核心通路”的机制解析，弥补了笔管草体内药效物质及分子机制研究的不足。

分子对接结果为笔管草核心药效成分的精准定位提供了分子证据，也凸显了本研究在活性成分筛选上的创新性。黄酮类化合物是公认的天然降脂活性成分，现有研究已证实槲皮素、山奈酚可通过抗氧化活性改善脂质代谢^［17］，但对笔管草中此类成分的具体作用靶点及结合特性尚未明确。本研究发现，槲皮素、草质素、棉花素和山奈酚与PTGS2、ESR1等核心靶点的结合能均低于-9.0 kcal/mol，其中棉花素与PTGS2结合能达-9.9 kcal/mol，结合模式最稳定。现有研究推测，棉花素可能通过抗氧化、抗炎特性成为笔管草降脂的重要物质，草质素可通过调节胰岛素功能及肝脏脂质代谢酶发挥作用^［18-19］。而本研究初步明确了这些成分与高脂血症关键靶点的结合能大小及相互作用模式。

随后对相关基因进行qPCR验证，STAT3、HSP90AA1、EGFR和PTGS2等基因在造模后表达均上调，EED给药后表达下降。而ESR1在造模后表达下调，EED给药后表达上调。STAT3、HSP90AA1、EGFR和PTGS2是参与炎症与脂质代谢调控的关键基因，其表达上调可协同促进炎症反应与脂质合成，从而加速高脂血症的进展^［20-21］。STAT3表达上调会影响脂质代谢过程，通过促进脂肪酸合成、减少脂肪酸氧化分解，进一步增加细胞内脂质蓄积，并与ROS升高共同作用，持续放大脂质代谢的异常状态^［22］。HSP90AA1的过度表达会加剧炎症反应以及糖酵解过程，从而进一步影响脂质代谢过程^［23］。EGFR通过调控胆固醇稳态的核心转录因子SREBPs，在脂质代谢重编程中发挥关键作用。在高脂饮食诱导的代谢应激状态下，EGFR表达水平的下调有助于减轻肝脏脂质过度蓄积^［24］。PTGS2/COX-2的过度激活通过上调前列腺素PGE2合成，直接干扰脂质代谢稳态，促进炎症相关脂质介质的异常累积，并驱动与肿瘤进展相关的脂质代谢重编程^［25］。ESR1作为机体脂质稳态的重要保护因子，其表达下调会削弱机体对脂质代谢的调控能力，进一步加剧高脂血症的发展，而表达上调可以抑制脂肪生成、减少脂质沉积^［26-27］。根据分子对接与实验验证，EED通过协同调控STAT3、HSP90AA1、EGFR、PTGS2及ESR1等关键基因的表达，在多个通路层面共同纠正脂质代谢紊乱，抑制异常脂质蓄积。

综上，本研究通过“入血成分鉴定-靶点筛选-机制解析-分子验证”的系统策略，阐明了笔管草抗高脂血症的科学内涵，为笔管草从传统药用资源向现代降脂药物转化提供了理论与实验支撑。

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基金资助

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